連續單反應釜發酵合成丁醇的製作方法

2023-05-28 04:17:26 1

專利名稱：連續單反應釜發酵合成丁醇的製作方法
技術領域：
本發明主要涉及通過發酵法生產丁醇，特別是涉及通過產生微環境來維持產酸和產溶劑相細胞共生(coincident)的亞群的單反應釜(vessel) 丁醇生產。
背景技術：
丁醇(正丁醇(n-butanol)或正-丁醇(η-butyl alcohol))可以通過碳水化合物的發酵來生產，所述碳水化合物降解成產物如包含五和六個碳原子的糖(如葡萄糖)。查爾斯魏茲曼(Charles Weizmarm)在第一次世界大戰期間發展了 這種方法(見，例如美國專利1，315，585 ；1, 329，214 ；1, 437，697)。簡單地說，魏茲曼方法包括在丙酮丁醇梭桿菌 {Clostridium acetobutylicum)存在下合適的原料的發酵，丙酮丁醇梭桿菌將原料轉化成丙酮、丁醇和乙醇(ABE)的溶劑混合物。在溶劑混合物中，丁醇丙酮乙醇的比率通常是 6 ！ 3 ！ I0ABE發酵為兩階段(biphasic)過程在第一(產酸)階段期間，對數生長伴隨乙酸和丁酸的生產，這也引起伴隨的和必需的PH下降。在第二(產溶劑)相中，生長停止，並且產生溶劑的同時消耗前述的酸，包括進一步消耗輸入的原料。氫氣和二氧化碳在發酵過程中不斷產生。由此產生的溶劑以稀的含水溶液形式產生，一般為約重量，使得其純態回收包括其與大量水的分離。正是分離的費用使得通過發酵生產這些化學製品競爭不過從以石油為基礎的來源生產溶劑。然而，對全球氣候變暖的關注、實現能源獨立的願望和石化衍生原料價格的增加使人們的興趣回到可將可再生未精製原料轉換成簡單有機化學製品的工藝上。用梭狀芽孢桿菌微生物發酵ABE的一個問題是丁醇對培養物有毒(即，在不考慮糖濃度的情況下，最大耐受丁醇濃度為大約2%)。通過在生產過程中連續除去丁醇可避免其毒性，用於最大量生產溶劑。各種丁醇去除系統，包括吸附、滲透蒸發、滲透萃取、反滲透、 液-液萃取和氣提，都不完全成功。此外，上述所有方法都增加了生產成本。因此，本領域仍然需要一種改進的從這些生物體生產溶劑的工藝。

發明內容
本發明介紹了一種通過梭狀芽孢桿菌屬(CZo1Siridium genus )細胞對碳水化合物進行發酵生產丁醇的方法，其中產酸相(acidogenic-phase)細胞和產溶劑相 (solventogenic-phase)細胞的混合物保持在單反應釜中。本發明系統不需要間歇性調整 PH或排出頂空氣體。公開的方法提供了一種移除丁醇產物的工藝，所述丁醇產物並非不可逆地損害細胞，當溶劑的抑制濃度不再存在時，這類細胞可以重新開始合成丁醇。此外，本發明包括包含梭狀芽孢桿菌細胞的組合物(compos i t ion )和生物純培養物。 在一個實施方案中，公開了丁醇生產的連續工藝，該工藝包括在第一反應釜中使梭狀芽胞桿菌細胞和緩衝劑與包含碳水化合物的基質相接觸，在最佳溫度下培養細胞直至達到丁醇抑制濃度，降低第一反應釜中的壓力直到出現強烈沸騰，將包含丁醇的共沸物從第一反應釜轉移到第二收集反應釜作為冷凝物(condensate)，用清洗流體衝洗反應釜，並不斷重複上述步驟。在相關方面，衝洗是冷凝收集體積(condensation collection volume)的功能，當冷凝收集體積佔培養物體積的約4% 時，衝洗開始。在另一方面，壓力從約760mm Hg下降至約20mm Hg-30mm Hg。在另一方面，當溶劑產量為基質中可同化碳水化合物的約35% -40% (wt/wt)時，補充包含碳水化合物的基質。在一個方面，這些細胞包括但不限於beijerinkii, C. acetobutylicum, C. aurantibutyricum^ C. tetranomorphum 禾口C. thermocellum0 在才目關方面，梭狀芽抱桿菌 beijerinkii 的編號是 NRRL B-50244。在另一個實施方案中，公開了生產丁醇的連續工藝，其包括在第一反應釜中使梭狀芽胞桿菌細胞的單培養物和緩衝劑與包含碳水化合物的基質相接觸，在最佳溫度下培養細胞直至達到丁醇的抑制濃度，升高培養物溫度到比最佳溫度高約6°c -ire並將第一反應釜的壓力從約760mm Hg降低至產生強烈沸騰，將包含丁醇的共沸物從第一反應釜轉移至第二反應釜作為冷凝物，用清洗流體衝洗第一反應釜並將培養物冷卻至丁醇合成的最佳溫度作為冷凝收集體積的功能，並不斷重複上述步驟。在一個方面，當溶劑產量為可同化碳水化合物的約35% -40% (wt/wt)時，補充包含碳水化合物的基質。在另一方面，培養物包含產酸和產溶劑相中的細胞混合物。在相關方面，梭狀芽胞桿菌細胞為C. beijerinkii。在另一方面，清洗流體為N2氣體。在一個方面，最佳溫度為約33°C -37°C。在另一方面，溫度上升至約43°C -44°C。 在又一方面，壓力下降至約110謹Hg-IOCkm Hg。在一個方面，丁醇的抑制濃度為約0.9%-2.0%。在相關方面，丁醇的抑制濃度為約 1. 3%。在另一方面，緩衝劑包括碳酸鈣的生物源，其包括海螵蛸和牡蠣殼。在一個方面， 該方法還包括使細胞與分子骨架相接觸。在相關方面，分子骨架包括海綿碎片，其中海綿包含碳酸鈣、二氧化矽骨針(silica spicules)或纖維素。在一個方面，這種工藝的丁醇產量是可發酵碳水化合物的約35%-40% (w/w), 包括每個循環約20g/L的丁醇產量。在另一方面，該工藝產生頂空氣體混合物，其包含約 40-50% H2、約40-50% CO2和0-20% N20在相關方面，頂空氣體包含43% H2,43% CO2和
14% N2。在另一個實施方案中，公開了一種組合物，其包括產酸相和產溶劑相梭狀芽孢桿菌屬細胞的混合種群和包含生物碳酸鈣源的緩衝劑。在一個方面，生物碳酸鈣源包括海螵蛸碎片和牡蠣殼碎片。在另一方面，緩衝劑為無機碳酸鈣源。在另一方面，該組合物還包括纖維素生物質，包括莖、葉、糠、木屑、鋸末、枯樹、樹枝、家居垃圾、紙製品、造紙黑液、草或它們的組合。
在一個方面，細胞為梭狀芽孢桿菌腫beijerinkii).在相關方面，梭狀芽孢桿菌知的編號是NRRL B-50244。在另一方面，梭狀芽孢桿菌beijerinkii插入於固相中，所述固相包括天然海綿、纖維海綿、海藻酸鈣微珠和聚丙烯醯胺片(sheet)。在一個實施方案中，公開了梭狀芽孢桿菌知NRRL B-50244的生物純培養物。在一個方面，該培養物可在PH6.0下繼續生產丁醇。在另一方面，該培養物包埋於固相中。在相關方面，固相包括天然海綿、纖維海綿、絲瓜海綿、海藻酸鈣微珠、軟體動物殼的碎片、墨魚骨碎片和聚丙烯醯胺片。



圖1顯示了可用於連續單反應釜生產丁醇的設備的示意圖2顯示了由C. beijerinkii NRRL B-50244培養物生產的丁醇的色譜； 圖3圖解說明了觀察到的自由和包埋細胞的丁醇合成時間過程。實心正方形代表來自於培養物中自由的C知ij^ri/^ii細胞的數據。實心菱形代表來自包埋於海藻酸鹽微珠中的C. beijerinkii細胞的數據；
圖4圖解說明了 OD6tltlnm處自由和包埋細胞的細胞生長速率。數據點與圖3中的丁醇數據點平行採集。實心正方形代表來自培養物中自由的C知ij^ri/^ii細胞的數據。實心菱形代表來自包埋於海藻酸鹽微珠中的C. beijerinkii細胞的數據；
圖5 (A)- (C)顯示了一系列表明真空蒸餾後丁醇重新開始合成的色譜。(A)顯示了蒸餾前的丁醇濃度。(B)顯示了蒸餾後的丁醇濃度。(C)顯示了再培育(re-incubation)後的丁醇濃度。各峰可鍵入(keyed to)圖2中。所有％值為vol/vol ； 圖6顯示了圖1所示設備的自動化實施方案的示意圖。
具體實施例方式在描述本發明的組合物、方法和方法論之前，應該理解，本發明不限於所描述的特定組合物、方法和實驗條件，因為這類組合物、方法和條件可以有所不同。也應該理解，本文所使用的術語僅出於描述特定實施方案的目的，並不意圖限制，因為本發明的範圍將僅在所附權利要求中被限制。如本說明書和所附權利要求所用，單數形式的「一」、「一個」以及「該」包括引用複數形式，除非上下文另有清晰的指示。因此，例如引用「一細胞」包括一個或多個細胞，和/ 或本文所描述類型的組合物，該種類型的組合物在本領域技術人員閱讀本公開內容之後將變得顯而易見，依此類推。除非另有定義，否則，本文使用的所有技術和科學術語具有與本發明所屬領域技術人員通常的理解相同的含義。任何與本文描述相似或等同的方法和材料可用於本發明的實施和測試，因將理解，各種改進和變型包括在本公開內容的精神和範圍內。如本文所用，「產酸相和產溶劑相細胞的混合種群」是指組合數量的梭狀芽孢桿菌細胞，其包括主要為丁酸和乙酸產生細胞的亞群和主要為丙酮/ 丁醇/乙醇(ABE)產生細 Ifi白勺L。 Iiftt^llf舌 C beijerinkii ^C. acetobutylicum>C. auran tibutyricum>C. tetranomorphum, C. thermocellum和類似的細菌，所述細菌將碳水化合物、丁酸和其它酸轉化成溶劑如丁醇、丙酮、乙醇或異丙醇。在某些方面，亞群來自單菌株或多菌株。在另一方面，在本發明公開的工藝中可使用的細胞可以是天然存在的或人造的(即，從重組操作獲得的)。

如本文所用，「生物碳酸鈣源」是指碳酸鈣的供應來自動物的殼或骨架材料(或其碎片)。例如，屬於軟體動物門(phylum Mollusca)的動物的殼是生物碳酸鈣源。如本文所用，「纖維素生物質」是指具有少量蛋白質、脂質(脂肪、蠟和油)和灰分， 由纖維素、半纖維素和木質素組成的材料。這類生物質包含可同化的碳水化合物(即，碳水化合物基質)。可同化的碳水化合物的實例包括但不限於糖如葡萄糖、乳糖、乳清滲透物、戊糖、澱粉、液化澱粉、經酶處理的液化澱粉、麥芽糊精和玉米漿。在一個方面，可分析這類可同化碳水化合物的右旋糖當量(dextrose equivalents)(例如，用糖化酶和α -澱粉酶處理生物質後使用YSI分析儀，見，例如美國專利5，192，673，或用二硝基水楊酸處理生物質後使用YSI分析儀，見，例如Tasun等人在((Biotech Bio-eng》1970年第12卷第991-992 頁發表的文章)。如本文所用，「固相」是指以抵抗變形和體積變化為特點的物質狀態。在一個方面， 固相可為多孔或無孔。在相關方面，選定的細菌可在多孔固相上形成菌落，其中菌落化的固相用作新培養物的移植。例如，固相可以是3維分子骨架，其中這樣的骨架為細胞生長提供較大的表面積(如海綿)。在相關方面，「包埋」是指細胞插入固相空隙內。如本文所用，「清洗流體」是指用於洗出其它液體或氣體的液體或氣體。例如，CO2 和N2氣體為清洗流體。生物產生的1-丁醇可以用本領域公知的方法從發酵培養基中分離。例如，可通過離心、過濾、傾析或類似的方法從發酵培養基中除去固形物。然後，使用方法如蒸餾、液-液萃取或以膜為基礎的分離來從發酵培養基中分離1- 丁醇。由於1- 丁醇與水形成低沸點共沸混合物，因此蒸餾只能用來將混合物分離至其共沸組成(azeotropic composition)。 蒸餾通常與另一分離方法結合以圍繞共沸物獲得分離。可與蒸餾結合使用以分離和純化 1- 丁醇的方法包括但不限於傾析、液_液萃取、吸附和以膜為基礎的技術。1- 丁醇-水混合物形成了非均相共沸物，使得蒸餾可與傾析結合用來分離並純化 1-丁醇。在一種方法中，將含1-丁醇的發酵液蒸餾至接近共沸組成。然後，使共沸混合物凝結，並通過傾析從發酵培養基中分離1-丁醇。傾出的含水相可回到第一精餾塔作為回流。傾出的富含1-丁醇的有機相可在第二精餾塔中通過蒸餾進一步純化。也可用液-液萃取與蒸餾結合來從發酵培養基中分離1-丁醇。在這種方法中，使用合適的溶劑來液-液萃取發酵液中的1-丁醇。然後蒸餾含1-丁醇的有機相以從溶劑中分離1-丁醇。也可用蒸餾與吸附結合來從發酵培養基中分離1-丁醇。在這種方法中，蒸餾含有 1-丁醇的發酵液至接近共沸組成，然後通過使用吸附劑如分子篩除去剩餘的水(國家可再生能源實驗室2002年6月出版的Aden等人的報告NREL/TP-510-32438，稀酸預水解和酶水解聯用對玉米秸稈從木質纖維素生物質至乙醇的工藝設計和經濟)。此外，蒸餾與滲透蒸發的結合已被用於從發酵培養基中分離和純化1-丁醇。在該方法中，蒸餾含有ι-丁醇的發酵液至接近共沸組成，然後用親水膜通過滲透蒸發除去剩餘的水(Guo等人在《J. Membr. Sci.》2004年第245卷第199-210頁發表的文章)。
在所有這 些蒸餾方法中，由於通常用來蒸餾丁醇-水共沸物的溫度(例如，約 93°C)會不可逆地損害營養態(vegetative state)的細胞，因此必須將發酵生物體從待蒸餾發酵液中分離出來。因此，與本發明方法相比，上面所述蒸餾工藝不能應用在與活性培養物相同的反應釜中而不破壞細胞。已應用各種工藝從生產性培養物中原位除去丁醇。研究的技術包括吸收、滲透蒸發、反滲透、液_液萃取和氣提。上述方所有法都顯著地增加生產費用，並且沒有一個是最佳的。對丁醇顯示出高度選擇性的以膜為基礎的系統被C acetobutylicum琳C. beijerinkii沾汙和堵塞。氣提法對希望從中除去揮發性組分的模型溶液運作良好 (見，例如美國專利申請20050089979)，但是，當例如使培養物保持平靜地用於生產丁醇時，是禁止惰性氣體通過待清洗溶液產生強烈泡沫的。在本發明中，公開了一種丁醇生產工藝，包括在第一單獨反應釜中使梭狀芽胞桿菌細胞的單培養物和緩衝劑與含碳水化合物的基質相接觸，在最佳溫度下培養細胞直至達到丁醇抑制濃度，並降低同一單獨反應釜中的壓力直到出現強烈沸騰，將包含丁醇的共沸物從第一反應釜轉移到第二收集反應釜中作為冷凝物，用清洗流體衝洗第一反應釜作為冷凝收集體積的功能，其中當收集的冷凝物體積為發酵體積的約4-5%時開始衝洗，並不斷重複上述步驟。因而，所得丁醇-水共沸物的蒸餾在與活性培養物相同的反應釜內進行。此夕卜，蒸餾後，同樣的培養物可以用來重新開始生產丁醇。在一個方面，該工藝中消耗的每克葡萄糖或其它糖類(包括但不限於乳糖)產生至少0.4克丁醇。在另一方面，該工藝由可發酵碳水化合物可達到約80% -90%的最大丁醇產量。在另一相關方面，該工藝的丁醇產量為約20-40g/L。在另一方面，梭狀芽胞桿菌細胞為C beijerinkii、C. acetobutylicum, C auran tibu tyricum > C. thermocellum 或 C. tetranomorphum 0 在才目關方面，細胞為 C beijerinkii NRRL B-50244。一般來說，發酵進行至少約36h，然而，發酵可進行140h或以上。對於本發明，在對數後期至穩定期維持細胞濃度用於連續生產溶劑，需要時，更換用盡的培養基和細胞。根據所使用的梭狀芽孢桿菌菌株，細胞可被攪動或保持靜止。例如，當使用C beijerinkii騎, 培養物將保持靜止以用於生產丁醇。對於本發明，原料可以是簡單的糖如葡萄糖、乳糖(例如，在乳清滲透物中所含有的)、戊糖；複合糖類如澱粉、液化澱粉、經酶處理的液化澱粉、麥芽糊精和玉米漿；或可包括纖維素生物質。這類原料作為水溶液和/或懸浮液加入。在一個方面，當從包含纖維素生物質的原料獲得基質溶液時，發酵前可將這類生物質碾磨或微粒化。碾磨減少了含碳水化合物原料組分的大小，從而使生物質較易被選定的細菌分解。可採用滅菌來殺死底菌 (background bacteria)，使所選細菌蓬勃生長。通常情況下，將碳水化合物/糖類與水混合，然後像許多發酵系統常見的那樣進行滅菌(見，例如美國專利5，753，474)。再次，可分析組成原料/糖類的碳水化合物的右旋糖當量(例如，在用糖化酶和α-澱粉酶處理生物質後用YSI分析儀分析(見，例如美國專利5，192，673)或通過二硝基水楊酸處理生物質後用 YSI分析儀分析(見，例如Tasun等人在((Biotech Bio-eng》1970年第12卷第991-992頁發表的文章))。除了包含碳水化合物的基質，細胞還與營養培養基接觸。有用的營養培養基包括本領域公知的那些營養培養基，如P2和蛋白腖葡萄糖酵母提取物(TGY)。也可以使用其它營養培養基。營養培養基可任選包含添加劑例如鹽和/或微量元素。在一方面，培養基為乳糖產孢培養基(LSM)，如表1定義。
權利要求
1.一種用於生產丁醇的連續工藝，其包括(a)在第一反應釜中使梭狀芽胞桿菌細胞的液體培養物和緩衝劑與包含碳水化合物的基質相接觸；(b)在溶劑生產的最佳溫度下培養細胞直到達到丁醇抑制濃度；(c)降低第一反應釜中的壓力直到出現強烈沸騰；(d)將包含丁醇的共沸物從第一反應釜轉移到第二收集反應釜中作為冷凝物；(e)用清洗流體衝洗第一反應釜；以及(f)不斷重複步驟(b)_(e)。
2.根據權利要求1所述的工藝，其中衝洗為冷凝收集體積的功能，以及其中所述衝洗在冷凝收集體積為培養物體積的4% -5%時開始。
3.根據權利要求1所述的工藝，還包括當溶劑產量為基質中可同化碳水化合物的約 35%-40% (wt/wt)時，補充含有碳水化合物的基質。
4.根據權利要求1所述的工藝，其中培養物包括產酸和產溶劑相細胞的混合物。
5.根據權利要求1所述的工藝，其中梭狀芽胞桿菌細胞選自beijerinkii,C. acetobutylicum、C. aurantibutyricum> C. tetranomorphum 私 C. thermoceIlum0
6.根據權利要求1所述的工藝，其中壓力從約760mmHg下降至約20mm Hg-30mm Hg。
7.根據權利要求1所述的工藝，其中丁醇的抑制濃度為約0.9% -2. 0%。
8.一種用於生產丁醇的工藝，其包括(a)在第一反應釜中使梭狀芽胞桿菌細胞的液體培養物和緩衝劑與包含碳水化合物的基質相接觸；(b)在最佳溫度下培養細胞直至達到丁醇抑制濃度；(c)將培養物的溫度升高到溶劑生產最佳溫度上約6°C_11°C並降低第一反應釜中的壓力直到開始強烈沸騰；(d)將包含丁醇的共沸物從第一反應釜轉移到第二收集反應釜中作為冷凝物；(e)用清洗流體衝洗第一反應釜並將培養物的溫度冷卻至最佳溫度；以及(f)不斷重複步驟(b)_(e)。
9.根據權利要求8所述的工藝，其中最佳溫度為約33°C_37°C。
10.根據權利要求9所述的工藝，其中步驟(c)中溫度升高到約43°C_44°C。
11.根據權利要求8所述的工藝，其中衝洗和冷卻為冷凝收集體積的功能，其中當冷凝收集體積為培養物體積的約4% -5%時，衝洗和冷卻開始。
12.根據權利要求8所述的工藝，其中壓力從約760mmHg下降至約IlOmm Hg-IOOmmHg。
13.根據權利要求8所述的工藝，其中抑制濃度為約0.9% -2. 0%。
14.根據權利要求8所述的過程，還包括當溶劑產量為基質中可同化碳水化合物的約 35% -40% (wt/wt)時，補充含有碳水化合物的基質。
15.根據權利要求8所述的工藝，其中緩衝劑包括生物碳酸鈣源。
16.根據權利要求15所述的工藝，其中生物源為海螵蛸或牡蠣殼。
17.根據權利要求8所述的工藝，還包括使細胞與海綿碎片相接觸。
18.根據權利要求17所述的工藝，其中海綿包含碳酸鈣、二氧化矽骨針或纖維素。
19.根據權利要求8所述的工藝，其中該工藝由可發酵碳水化合物達到約80%-90%之間的丁醇產量。
20.根據權利要求8所述的工藝，其中該工藝的丁醇產量為約20-40g/L。
21.根據權利要求8所述的工藝，其中該工藝產生頂空氣體混合物，其包含約40-50% H2,40-50% CO2 和 0-20% N2。
22.根據權利要求21所述的工藝，其中該工藝產生頂空氣體混合物，其包含約43%H2、 43% CO2 和 14% N2。
23.一種組合物，其包含產酸相和產溶劑相梭狀芽孢桿菌細胞的混合種群以及含有生物碳酸鈣源的緩衝劑。
24.根據權利要求23所述的組合物，其中生物碳酸鈣源為海螵蛸碎片或牡蠣殼碎片。
25.根據權利要求23所述的組合物，其中細胞為梭狀芽孢桿菌beijerinkii。
26.根據權利要求25所述的組合物，其中Cbeijerinkii為WRL B-50244。
27.根據權利要求25所述的組合物，其中梭狀芽孢桿菌知ij'ari/^ii包埋於固相中，所述固相選自天然海綿、纖維海綿、絲瓜海綿、海藻酸鈣微珠和聚丙烯醯胺片。
28.一種梭狀芽孢桿菌力eiJeri/^ii NRRL B-50244的生物純培養物。
29.根據權利要求28所述的生物純培養物，其中該培養物包埋於固相中，所述固相選自天然海綿、纖維海綿、海藻酸鈣微珠和聚丙烯醯胺片。
全文摘要
本發明公開了一種用梭狀芽孢桿菌產酸相細胞和產溶劑相細胞的混合種群在單個反應釜中通過碳水化合物發酵生產丁醇的方法。所描述的本發明系統不需要間歇性調整pH或排出頂空氣體。該方法提供了一種用於除去不可逆損害細胞的丁醇產物的工藝，並且描述了這類細胞可在相同的單個反應釜中重新開始合成丁醇的條件。如所公開的，本發明還描述了包含梭狀芽孢桿菌細胞的組合物和生物純培養物。
文檔編號C12R1/145GK102439161SQ200980158890
公開日2012年5月2日 申請日期2009年2月26日 優先權日2009年2月23日
發明者尤金·T·巴特勒三世 申請人:尤金·T·巴特勒三世