組培誘導虎杖毛狀根製備虎杖苷的方法

2023-05-27 22:21:11

專利名稱：組培誘導虎杖毛狀根製備虎杖苷的方法
技術領域：
本發明涉及到一種組培誘導虎杖毛狀根製備虎杖苷的方法，屬於植物生物技術領域。
背景技術：
虎杖苷(polydatin)和白藜蘆醇(resVeratrol)均為植物體內天然產生的二苯乙烯類多酚物質，是具有明確的化學結構和確切療效的單體化合物，對人體具有強心擴血管、抑制血小板凝集、降血脂、抗病毒和增強機體免疫力等作用，更為重要的是其特異性地針對癌細胞具有殺傷力而不影響正常細胞，被譽為「二十一世紀最有前途的抗癌藥物之一」，因此廣泛應用於臨床醫療及保健業，國內外市場需求量很大。
虎杖苷和白藜蘆醇在自然界的很多植物中都存在，例如葡萄、花生、藜蘆、虎杖、歐洲雲杉等，其中以在虎杖中的含量最為豐富，遠遠超過其他植物。目前製藥工業主要依靠從大量採挖的野生虎杖根及根莖中提取虎杖苷和白藜蘆醇，據統計提取10噸白藜蘆醇需要消耗5000噸虎杖原料。虎杖苷和白藜蘆醇在植物體內的含量不僅普遍較低，而且還明顯受到產地、採收季節以及生長環境等因素的影向，例如雲南地區的虎杖根莖中虎杖苷的含量為3.24％，而廣東一帶僅為0.64％；同一產地的虎杖八月份採收時其根莖中含有白藜蘆醇0.30％，到十月份採收時就降為0.04g％，所以單純依靠從植物原料中提取的方法，不僅質量難以控制，而且生產周期長、成本高、產品得率低，更為嚴重的是長期掠奪式地採挖還會加快野生資源的滅絕速度，不符合我國經濟可持續發展的戰略要求。如何在不破壞自然資源的條件下，生產出質量可控、純度較高的白藜蘆醇及其苷類，是當前研究的熱點問題。
生物合成(biosynthesis)，即通過對植物高產細胞、組織或器官的篩選與優化培養，將植物體作為一個「藥物加工廠」，在特定的生物反應器內達到目標成分的高效產出，對於解決中草藥資源的可持續利用及天然藥物的生產問題具有重要意義。目前，利用生物合成途徑生產虎杖苷或白藜蘆醇的研究主要集中在細胞培養物方面，例如專利00113914.2公開了利用葡萄細胞株生產白藜蘆醇的技術方案。但是利用細胞培養物進行次生代謝物的大規模生產存在許多不足，例如細胞普遍生長緩慢且依賴激素維持、含量低下、遺傳穩定性差和放大培養時對剪切力敏感等。

發明內容
本發明所要解決的技術問題是利用組培技術和髮根農桿菌(Agrobacter ium rhizogene)生根質粒上的一段T-DNA對虎杖外植體進行遺傳轉化誘導培養所產生的毛狀根來生產虎杖苷的方法。
本發明的技術方案是這樣實現的組培誘導虎杖毛狀根製備虎杖苷的方法，其特徵在於它包括如下步驟A、野生虎杖組培選取發育良好的野生虎杖植株莖段頂部的幼芽，消毒處理後經分化培養，壯苗培養，生根培養形成發育完整的幼苗，切取無菌組培苗的莖段、葉片、葉柄及幼芽等外植體作為感染材料備用；B、髮根農桿菌的活化培養取出冰箱保存的髮根農桿菌菌株ATCC11325室溫平衡20～30min，然後在超淨工作檯上吸取500～800μl菌液於已滅菌的100～150ml新鮮YEB培養液中，於23～27℃、120～160r·min-1、黑暗振蕩培養20～24h即可；C、虎杖毛狀根的誘導培養劃傷受體材料表面以形成傷口，放入步驟B的農桿菌菌液中浸泡5sec～15min使之充分接觸，取出感染材料用無菌吸水紙輕輕蘸幹多餘菌液，24～27℃、黑暗條件下置於MS0中進行共培養。7～15天後在感染材料的傷口部位可見毛狀根的萌生；D、虎杖毛狀根優化培養經分子鑑定後採用1/2MS0液體培養基，附加3％蔗糖作為碳源，在pH值為6.0～6.5，溫度22～27℃，搖床轉速120～140r·min-1，黑暗或弱光條件下6～30天獲得大量增殖的毛狀根株系；E、虎杖毛狀根中虎杖苷的提取從培養液中取出毛狀根、烘乾、研磨成粉末，用50％(V∶V)乙醇結合30～40min超聲波處理進行提取，之後於3000r/min離心15～20min，取上清液減壓濃縮，再經過柱層析分離、濃縮、結晶、冷凍乾燥，即可得到純度較高的虎杖苷產品。
所述的組培誘導虎杖毛狀根製備虎杖苷的方法，步驟A中對野生材料的消毒方法是採用流水衝洗乾淨後置於超淨工作檯上，75％(V∶V)酒精浸泡10～30sec，無菌水漂洗三次後再置於0.1％(W∶V)升汞溶液中表面消毒3～8min，無菌水充分漂洗後即可接種；誘導叢生芽分化的培養基是指MS+0.05mg/LTDZ+0.5mg/L NAA+0.1mg/L 6-BA；壯苗生長的培養基是指MS+0.1mg/LCPPU+1.0mg/L NAA，生根培養基是指MS+1.0mg/L NAA+0.5％活性炭；上述培養條件均為白天27±1℃，夜晚20±1℃溼度60～70％，光強28μmol/m2.s，光照時間13～17h/d。
所述的組培誘導虎杖毛狀根製備虎杖苷的方法，提高步驟G所述的虎杖毛狀根誘導率的方法包括a、髮根農桿菌與根癌農桿菌雙感染；b超聲波振蕩輔助感染；c，微波輻射輔助感染；d、選取成熟葉的葉片部分作為感染材料；e、感染葉片不經預培養且共培養時葉片上表皮向上放置；或f、黑暗、室溫環境下誘導根的發生。
所述的組培誘導虎杖毛狀根製備虎杖苷的方法，步驟D所述的分子鑑定是指切取從感染材料上產生的毛狀根根段，分離成單根後轉接至MS0固體培養基中生長，10～15天繼代培養一次；從大量的單克隆毛狀根系中篩選生長迅速、外形粗壯、分枝較多的毛狀根進行PCR分子鑑定，證實具有轉髮根農桿菌T-DNA性質的毛狀根進入下一步操作。
所述的組培誘導虎杖毛狀根製備虎杖苷的方法，步驟D所述的培養周期6～24天內採取每7天更換培養液一次。
所述組培誘導虎杖毛狀根製備虎杖苷的方法，將步驟D得到虎杖毛狀根進行固體種質保存以用於工業化生產。
所述組培誘導虎杖毛狀根製備虎杖苷的方法，將生長迅速、含量較高且遺傳穩定的優良虎杖毛狀根單克隆系，保存於添加有1％活性碳並提高蔗糖含量至5％的MS固體培養基中。
所述組培誘導虎杖毛狀根製備虎杖苷的方法，將步驟D得到的虎杖毛狀根在優化條件下擴大培養以便定期收穫毛狀根，繼代培養時接種量控制在0.5～1.0g鮮重毛狀根100～150ml培養液。
所述組培誘導虎杖毛狀根製備虎杖苷的方法，可同時製備白藜蘆醇提取物。
本發明的技術進步效果表現在(1)與從野生虎杖根及根莖中提取虎杖苷和白藜蘆醇的現今生產方式相比，利用毛狀根來生產以根入藥為主的藥用植物的某些有效成分，具有生產周期短、質量和產量穩定、不佔用耕地等優點，而且天然藥物的生產是在可控和可重複條件下進行，不會受到病蟲害和自然環境等因素的影響。
(2)與化學合成的方法相比，利用毛狀根培養物生物合成途徑除了可提供虎杖苷和白藜蘆醇外，還可直接生產出前體及其他具有藥理活性結構而化學手段很難合成的化合物，此外產物可無限、連續、均勻的生產，分離、提取操作簡單，節約人力物力。
(3)與利用其他組織培養物(如自然根、愈傷組織、懸浮細胞等)生產方式相比，毛狀根中由於導入了髮根農桿菌Ri質粒上的T-DNA，具有不依賴激素自主快速生長的特性，而其他培養物必須添加昂貴或對人體有毒害的外源激素來維持其生長。在本發明具體實施例中篩選獲得的優質虎杖毛狀根株系，在30d培養期內乾重增長率可達到8.29，是相同條件下懸浮培養細胞的192.8倍，是自然根培養物的8.4倍。此外，毛狀根遺傳性能穩定，繼代操作簡單，生長不需要光照，成本低廉，更適於工廠化生產。
(4)本發明利用野生型髮根農桿菌和根癌農桿菌雙菌共感染的方式，不僅可以明顯提前出根，而且有效提高了毛狀根的誘導率及誘根密度，毛狀根平均誘導率可達到97.1％，誘根密度達到15.8，遠遠高於同屬其他植物。此外，與以往文獻報導不同的是，本項技術中感受材料不需預培養，劃傷後直接浸泡於活化好的菌液中，在葉片生根及毛狀根繼代培養過程中均不需要繁雜的除菌工作，節省了人力物力，也使得毛狀根的誘導與培養操作更為簡便。


圖1感染7d後從葉片上開始出現毛狀根圖2感染20d後形成大量生長迅速的毛狀根系圖3虎杖毛狀根的液體擴大培養圖4虎杖毛狀根中rolb基因引物經PCR擴增後產物的瓊脂糖電泳圖譜圖中從左向右依次為①空白(無模板DNA)；②Ri質粒；③感染葉片；④未感染葉片；⑤Marker；⑥毛狀根；⑦自然根。
圖5虎杖毛狀根中tms基因引物經PCR擴增後產物的瓊脂糖電泳圖譜圖中從左向右依次為①Marker；②毛狀根；③自然根；④空白(無模板DNA)。
圖6虎杖苷對照品的HPLC色譜7白藜蘆醇對照品的HPLC色譜8虎杖毛狀根樣品的HPLC色譜中虎杖苷對照品0.101mg·mL-1白藜蘆醇對照品0.0300mg·mL-11、虎杖苷 2、白藜蘆醇具體實施方式
實施例11、選取生長健壯、發育良好，無病蟲害及黴菌侵染的野生虎杖植株莖段頂部的幼芽，常規消毒處理後置於誘導叢生芽分化的培養基中MS+0.05mg/LTDZ+0.5mg/L NAA+0.1mg/L 6-BA。培養條件為白天溫度27±1℃，夜晚溫度20±1℃；溼度60-65％，光強28μmol/m2.s，光照時間14h/d。15d後將叢生苗分離成單株，置於壯苗生長培養基中MS+0.1mg/L CPPU+1.0mg/LNAA，培養條件同上。1周後移植單株組培苗於生根培養基中MS+1.0mg/L NAA+0.5％活性炭，培養條件同上。以此不定芽器官增殖途徑可持續進行快繁，每株芽的繁殖係數為5～7，2周內即可獲得發育良好的完整植株。
2、切取虎杖無菌組培苗的葉片外植體作為感染材料備用。
3、野生型髮根農桿菌菌株ATCC11325通常於添加有20％甘油的YEB液體培養基中-20℃避光保存。從冰箱中取出髮根農桿菌菌株ATCC11325平衡30min，然後在超淨工作檯上吸取500μl菌液於已滅菌的100ml新鮮YEB培養液中，25℃、140r·min-1、黑暗振蕩培養22h即可使用。
4、用無菌解剖刀小心劃傷葉片表面以形成傷口，放入活化好的農桿菌菌液中浸泡10min，輕輕搖動使之充分接觸。取出感染材料，用無菌吸水紙輕輕蘸幹多餘菌液，使葉片上表皮向下放置於MS0培養基中，25℃、黑暗條件下進行共培養。感染一周左右葉片表面劃傷處開始出現密集叢生的毛狀根(圖1)，向下扎入培養基中迅速生長。持續共培養20～30d即可形成大量豐富的毛狀根系(圖2)。其間未出現農桿菌生長情況，因此省去除菌環節。
5、毛狀根的分子鑑定毛狀根轉基因性質的鑑定採用聚合酶鏈式反應技術(polymerase chain reaction，PCR)，設計髮根農桿菌Ri質粒中TL-DNA或TR-DNA上與生根有關的基因引物，提取毛狀根基因組DNA進行擴增，對擴增的產物通過瓊脂糖電泳進行分析鑑定，確定得到的特異性基因片段。rolb基因是髮根農桿菌Ri質粒TL-DNA(T-DNA左臂)上與生根密切相關的一個基因，而tms基因則位於TR-DNA(T-DNA右臂)上，參與編碼生長素的合成，如果所誘導的毛狀根具有轉髮根農桿菌T-DNA性質，則通過設計TL-DNA或TR-DNA上特異的基因引物，與提取的毛狀根基因組DNA進行PCR擴增。具體操作參照王關林等編《植物基因工程原理及技術》(1998年科學出版社)。
從圖4、圖5顯示的結果可見，利用rolb及tms的PCR引物，能從感染後的虎杖葉片及毛狀根總DNA中分別擴增到期望的422bp和910bp左右的特異性DNA片段，而從未轉化的自然根及未感染的葉片總DNA中擴增不到任何片段。這說明，髮根農桿菌ATCC11325Ri質粒的TL-DNA和TR-DNA部分已在虎杖毛狀根基因組中得到整合與表達。
6、對篩選的毛狀根進行優化培養，採用1/2MS0液體培養基，不添加其他植物生長調節劑(如 NAA、CPPU、TDZ或乙烯利)，調節pH值為6.0～6.5，並附加3％蔗糖作為碳源。溫度22～27℃，搖床轉速120～140 r·min-1，黑暗或弱光下進行培養。繼代培養時接種量控制在0.5～1.0g(鮮重)毛狀根100～150ml培養液較適宜。在毛狀根生長最快的指數期(6～24天)採取補液培養的方式，能夠最大程度地收穫培養物。毛狀根在液體培養基中能夠自主快速增殖如圖3，培養過程中日增長量平均為0.214～0.275g乾重/天，30天的生長量(鮮重)為接種量的7～9倍，乾重增長率可達到8.29，是相同條件下懸浮培養細胞的192.8倍，是自然根培養物的8.4倍。
7、從培養液中取出毛狀根，低溫(45℃)乾燥至恆重後，用研缽研成細粉，過60目篩，用50％(V∶V，以下同)乙醇結合30～40min超聲波處理進行提取，之後3000r/min離心15～20min，取上清液減壓濃縮，再經過柱層析分離、濃縮、結晶、冷凍乾燥，即可得到純度較高的虎杖苷和白藜蘆醇。
8、利用高效液相色譜法(HPLC)檢測毛狀根中虎杖苷和白藜蘆醇含量，與標準品圖6、圖7比對發現，虎杖毛狀根中含有虎杖苷和白藜蘆醇成分如圖8所示。用本發明提供的毛狀根系與培養方法，毛狀根日增長量平均為0.214～0.275g乾重/天，虎杖苷含量可達培養物乾重的0.18～0.22％，白藜蘆醇含量可達培養物乾重的0.05～0.0g％。
9、將優良毛狀根株系轉接於添加有適量活性碳，如1-2％，並提高蔗糖含量如5-10％的MS固體培養基中進行固體種質保存，用於工業化生產在優化條件下擴大培養以便定期收穫毛狀根。
實施例2
在步驟(2)中切取虎杖無菌苗的莖段作為感染材料。步驟(3)中，同時加入根癌農桿菌C58菌液500μl於100ml YEB培養液中，和髮根農桿菌ATCC11325在25℃、140r·min-1、黑暗共培養22h後使用。步驟(4)中，莖段外植體在雙菌活化液中浸泡10min，黑暗條件下置於MS0中共培養。步驟(5)中，對莖段誘導獲得的毛狀根分離培養後進行PCR分子鑑定；步驟(6)中，對莖段誘導獲得的毛狀根進行優化培養，獲得大量增殖的毛狀根株系。步驟(7)中，從莖段誘導獲得的毛狀根中提取、分離、純化虎杖苷和白藜蘆醇產品。步驟(8)中，利用HPLC法對莖段誘導獲得的毛狀根中虎杖苷和白藜蘆醇的含量進行檢測。步驟(9)中，對莖段誘導獲得的毛狀根篩選後直接進行液體擴大培養，採用1/2MS0液體培養基，在優化的條件下培養，收穫得到的大量毛狀根培養物用來提取虎杖苷和白藜蘆醇產品，其他同實施例1。
實施例3在步驟(2)中切取虎杖無菌苗的幼芽作為感染材料。步驟(3)中，髮根農桿菌ATCC11325在26℃、150r·min-1、黑暗共培養24h後使用。步驟(4)中，幼芽外植體浸泡於100ml活化菌液中，在超聲波振蕩器中處理5～10sec，取出吸乾多餘菌液後，黑暗條件下置於MS0中共培養。步驟(5)中，對幼芽誘導獲得的毛狀根分離培養後進行PCR分子鑑定；步驟(6)中，對幼芽誘導獲得的毛狀根進行優化培養，獲得大量增殖的毛狀根株系。步驟(7)中，從幼芽誘導獲得的毛狀根中提取、分離、純化虎杖苷和白藜蘆醇產品。步驟(8)中，利用HPLC法對幼芽誘導獲得的毛狀根中虎杖苷和白藜蘆醇的含量進行檢測。步驟(9)中，對幼芽誘導獲得的毛狀根篩選後直接進行液體擴大培養，採用1/2MS0液體培養基，在優化的條件下培養，收穫得到的大量毛狀根培養物用來提取虎杖苷和白藜蘆醇產品，其他同實施例1。
實施例4在步驟(2)中切取虎杖無菌苗的成熟葉片(葉長≥1.5cm)作為感染材料。步驟(3)中，髮根農桿菌ATCC11325在27℃、140r·min-1、黑暗共培養20h後使用。步驟(4)中，葉片外植體浸泡於100ml活化菌液中，在微波爐中輻射處理5～10sec，取出吸乾多餘菌液後，黑暗條件下置於MS0中共培養。步驟(5)中，對葉片誘導獲得的毛狀根分離培養後進行PCR分子鑑定；步驟(6)中，對葉片誘導獲得的毛狀根進行優化培養，獲得大量增殖的毛狀根株系。步驟(7)中，從葉片誘導獲得的毛狀根中提取、分離、純化虎杖苷和白藜蘆醇產品。步驟(8)中，利用HPLC法對葉片誘導獲得的毛狀根中虎杖苷和白藜蘆醇的含量進行檢測。步驟(9)中，對葉片誘導獲得的毛狀根篩選後直接進行液體擴大培養，採用1/2MS0液體培養基，在優化的條件下培養，收穫得到的大量毛狀根培養物用來提取虎杖苷和白藜蘆醇產品，其他同實施例1。
實施例5在步驟(2)中切取虎杖無菌苗葉片的葉柄部分作為感染材料。步驟(3)中，髮根農桿菌ATCC11325在24℃、130r·min-1、黑暗共培養23h後使用。步驟(4)中，葉柄外植體浸泡於100ml活化菌液中8min，取出吸乾多餘菌液後，黑暗條件下置於MS0中共培養。步驟(5)中，對葉柄誘導獲得的毛狀根分離培養後進行PCR分子鑑定；步驟(6)中，對葉柄誘導獲得的毛狀根進行優化培養，獲得大量增殖的毛狀根株系。步驟(7)中，從葉柄誘導獲得的毛狀根中提取、分離、純化虎杖苷和白藜蘆醇產品。步驟(8)中，利用HPLC法對葉柄誘導獲得的毛狀根中虎杖苷和白藜蘆醇的含量進行檢測。步驟(9)中，對葉柄誘導獲得的毛狀根篩選後直接進行液體擴大培養，採用1/2MS0夜體培養基，在優化的條件下培養，收穫得到的大量毛狀根培養物用來提取虎杖苷和白藜蘆醇產品，其他同實施例1。
實施例6在步驟(2)中切取虎杖無菌苗的成熟葉片(葉長≥1.5cm)作為感染材料。步驟(3)中，髮根農桿菌ATCC11325在23℃、130r·min-1、黑暗共培養23h後使用。步驟(4)中，葉片外植體浸泡於100ml活化菌液中15min，取出吸乾多餘菌液後，使葉片上表皮向上放置於MS0培養基中，弱光條件下進行共培養。步驟(5)中，對葉片誘導獲得的毛狀根分離培養後進行PCR分子鑑定；步驟(6)中，對葉片誘導獲得的毛狀根進行優化培養，獲得大量增殖的毛狀根株系。步驟(7)中，從葉片誘導獲得的毛狀根中提取、分離、純化虎杖苷和白藜蘆醇產品。步驟(8)中，利用HPLC法對葉片誘導獲得的毛狀根中虎杖苷和白藜蘆醇的含量進行檢測。步驟(9)中，對葉片誘導獲得的毛狀根篩選後直接進行液體擴大培養，採用1/2MS0液體培養基，在優化的條件下培養，收穫得到的大量毛狀根培養物用來提取虎杖苷和白藜蘆醇產品，其他同實施例1。
本發明列舉的實施例旨在更進一步地闡明這種組培誘導虎杖毛狀根製備虎杖苷的方法，而不對本發明的範圍構成任何限制，用本發明實施例得到的產品和經由本發明權利要求書所述均可得到組培誘導虎杖毛狀根製備虎杖苷及白藜蘆醇產品。需要說明的是白藜蘆醇及其苷在植物體內可以相互轉化，因此對其含量需要有全面的評價。
實施例中涉及的縮寫術語、培養基及統計方法說明1、菌種髮根農桿菌ATCC11325和根癌農桿菌C58購自中國科學院微生物研究所菌種保存中心。
2、農桿菌活化培養基YEB(yeast e×tract bacto)培養基，是基因工程領域常用的培養農桿菌的培養基，其配方可在基因工程的實驗指導手冊中獲得。
3、植物培養基MS(Murashige Skoog，1962)培養基，是植物組織培養領域常用的基本培養基，在組織培養方面的教科書或實驗指導手冊中均可獲得其配方。MS0指未添加任何生長調節劑的MS基本培養基；1/2MS0指大量元素成分減半的MS0培養基。
4、標準品白藜蘆醇(resveratrol，純度99％)購自Sigma公司；虎杖苷(polydatin，純度98％)購自天津尖峰天然產物研究開發有限公司。
6、乾重增長率＝(收穫乾重-接種乾重)/接種乾重；毛狀根誘導率＝產生毛狀根外植體數/總外植體數×100％；誘根密度＝毛狀根產生的條數/生根外植體數。有效成分含量(％)＝有效成分質量(g)/100g培養物乾重。
權利要求
1.組培誘導虎杖毛狀根製備虎杖苷的方法，其特徵在於它包括如下步驟A、野生虎杖組培選取發育良好的野生虎杖植株莖段頂部的幼芽，消毒處理後經分化培養，壯苗培養，生根培養形成發育完整的幼苗，切取無菌組培苗的莖段、葉片、葉柄及幼芽等外植體作為感染材料備用；B、髮根農桿菌的活化培養取出冰箱保存的髮根農桿菌菌株ATCC11325平衡20～30min，然後在超淨工作檯上吸取500～800μl菌液於已滅菌的100～150ml新鮮YEB培養液中，於23～27℃、120～160r·min-1、黑暗振蕩培養20～24h即可；C、虎杖毛狀根的誘導培養劃傷受體材料表面以形成傷口，放入步驟B的農桿菌菌液中浸泡5sec～15min使之充分接觸，取出感染材料用無菌吸水紙輕輕蘸幹多餘菌液，24～27℃、黑暗條件下置於MS0中進行共培養7～15天後在感染材料的傷口部位可見毛狀根的萌生；D、虎杖毛狀根優化培養經分子鑑定後採用1/2MS0液體培養基，附加3％蔗糖作為碳源，在pH值為6.0～6.5，溫度22～27℃，搖床轉速120～140r·min-1，在黑暗或弱光條件下6～30天獲得大量增值的毛狀根株；E、虎杖毛狀根中虎杖苷的提取從培養液中取出毛狀根、烘乾、研磨成粉末，用50％(V∶V)乙醇結合30～40min超聲波處理進行提取，之後於3000r/min離心15～20min，取上清液減壓濃縮，再經過柱層析分離、濃縮、結晶、冷凍乾燥，即可得到純度較高的虎杖苷產品。
2.根據權利要求1所述的組培誘導虎杖毛狀根製備虎杖苷的方法，其特徵在於步驟A中對野生材料的消毒方法是採用流水衝洗乾淨後置於超淨工作檯上，75％(V∶V)酒精浸泡10～30sec，無菌水漂洗三次後再置於0.1％(W∶V)升汞溶液中表面消毒3～8min，無菌水充分漂洗後即可接種；誘導叢生芽分化的培養基是指MS+0.05mg/L TDZ+0.5mg/L NAA+0.1mg/L 6-BA；壯苗生長的培養基是指MS+0.1mg/L CPPU+1.0mg/L NAA，生根培養基是指MS+1.0mg/L NAA+0.5％活性炭；上述培養條件均為白天27±1℃，夜晚20±1℃；溼度60～70％，光強28μmol/m2.s，光照時間13～17h/d。
3.根據權利要求1所述的組培誘導虎杖毛狀根製備虎杖苷的方法，其特徵在於提高步驟C所述的虎杖毛狀根誘導率的方法包括a、髮根農桿菌與根癌農桿菌雙感染；b超聲波振蕩輔助感染；c，微波輻射輔助感染；d、選取成熟葉的葉片部分作為感染材料；e、感染葉片不經預培養且共培養時葉片上表皮向上放置；或f、黑暗、室溫環境下誘導根的發生。
4.根據權利要求1所述的組培誘導虎杖毛狀根製備虎杖苷的方法，其特徵在於步驟D所述的分子鑑定是指切取從感染材料上產生的毛狀根根段，分離成單根後轉接至MS0固體培養基中生長，10～15天繼代培養一次；從大量的單克隆毛狀根系中篩選生長迅速、外形粗壯、分枝較多的毛狀根進行PCR分子鑑定，證實具有轉髮根農桿菌T-DNA性質的毛狀根進入下一步操作。
5.根據權利要求1所述的組培誘導虎杖毛狀根製備虎杖苷的方法，其特徵在於步驟D所述的培養周期6～24天內採取每7天更換培養液一次。
6.根據權利要求1所述組培誘導虎杖毛狀根製備虎杖苷的方法，其特徵在於將步驟D得到虎杖毛狀根進行固體種質保存以用於工業化生產。
7.根據權利要求6所述組培誘導虎杖毛狀根製備虎杖苷的方法，其特徵在於將生長迅速、含量較高且遺傳穩定的優良虎杖毛狀根單克隆系，保存於添加有1％活性碳並增加5％蔗糖含量的MS固體培養基中。
8.根據權利要求6所述組培誘導虎杖毛狀根製備虎杖苷的方法，其特徵在於將步驟D得到虎杖毛狀根在優化條件下擴大培養以便定期收穫毛狀根，繼代培養時接種量控制在0.5～1.0g鮮重毛狀根100～150ml培養液。
9.根據權利要求1-8所述組培誘導虎杖毛狀根製備虎杖苷的方法，其特徵在於上述方法可同時製備白藜蘆醇提取物。
全文摘要
本發明提供一種利用組培技術和髮根農桿菌(Agrobacterium rhizogene)生根質粒上的一段T－DNA對虎杖外植體進行遺傳轉化誘導培養所產生的毛狀根來生產虎杖苷的方法。它包括如下步驟A、野生虎杖組培；B、髮根農桿菌的活化培養；C、虎杖毛狀根的誘導培養；D、虎杖毛狀根優化培養；E、虎杖毛狀根中虎杖苷的提取。本發明的技術進步效果表現在與從野生虎杖根及根莖中提取虎杖苷和白藜蘆醇的現今生產方式相比，利用毛狀根來生產以根入藥為主的藥用植物的某些有效成分，具有生產周期短、質量和產量穩定、不佔用耕地等優點，而且天然藥物的生產是在可控和可重複條件下進行，不會受到病蟲害和自然環境等因素的影響。
文檔編號C07H1/00GK1759665SQ200510012809
公開日2006年4月19日 申請日期2005年9月13日 優先權日2005年9月13日
發明者於樹宏, 範慶書, 查建蓬, 張嫡群 申請人:河北醫科大學