克裡本類芽孢桿菌的發酵生產方法及培養基與流程
2023-05-28 15:55:31 1
本發明涉及微生物發酵技術領域，具體涉及克裡本類芽孢桿菌的發酵生產方法及克裡本類芽孢桿菌的培養基。
背景技術：
克裡本類芽孢桿菌(Hypocrea virens)是一種抑制多種土傳植物病原真菌的重寄生菌，菌落生長快，培養4天後直徑7～9.5cm，氣生菌絲捲毛狀，白色或者灰色。分生孢子豐富，近於平展狀覆蓋於平板。克裡本類芽孢桿菌作為植物病害生物防治的主要機制，已經越來越受到各國植物病理學家的重視。重寄生菌作為生物防治的重要因子，對於防治植物病害具有重要作用。
現有技術中，關於克裡本類芽孢桿菌發酵工藝的報導較少，僅專利號為CN 103756931 A的發明專利記載了關於克裡本類芽孢桿菌的發現和應用的相關內容，克裡本類芽孢桿菌培養方法和培養基僅是對克裡本類芽孢桿菌的活化培養及活化培養基兩方面有記載，並未就克裡本類芽孢桿菌發酵方法以及發酵各階段所使用的培養基有記載。
克裡本類芽孢桿菌活化培養方法無法滿足本領域預防植物病害的應用，而傳統的真菌發酵方法能夠實現工業化生產，但存在發酵時間長，成本高，收率低等問題，不能滿足現有防止植物病害的應用。
技術實現要素：
有鑑於此，本發明的目的在於得到優化的發酵生產方法，能夠得到一種更高效的控制手段，最終獲取孢子含量較高的克裡本類芽孢桿菌粉。
為了實現上述發明目的，本發明提供以下技術方案：
本發明提供了一種克裡本類芽孢桿菌的發酵生產方法，包括下列步驟：
1)將克裡本類芽孢桿菌菌種活化，接種到一級液體培養基中進行一級培養，得到一級種子液；
2)將所述步驟1)得到的一級種子液接種到二級液體培養基進行二級發酵培養，得到二級種子液；
3)將所述步驟2)得到的二級種子液接種到三級液體培養基進行三級發酵培養，濃縮分離後，得到克裡本類芽孢桿菌菌粉；
所述三級液體培養基包括下列質量百分含量組分：葡萄糖2.00～3.00％、玉米粉0.50～1.50％、硫酸銨0.03～0.10％、磷酸氫二鉀0.03～0.10％、氯化鈣0.07～0.20％，餘量為水。
優選的，所述步驟1)中一級培養的時間為28～32h，一級培養的溫度為28～32℃。
優選的，所述步驟1)中一級培養須進行光照培養，所述光照培養的光強3000～4000xl。
優選的，所述步驟1)中的一級培養過程進行通氣，所述通氣的程序具體為：進入培養24h內，通氣量為10～20m3/h，培養24h後，通氣量15～24m3/h；
優選的，所述培養的接種量為1.5～2.5％。
優選的，所述一級培養的初始pH值為7.0～8.0。
優選的，所述步驟1)中的一級培養在攪拌的條件下進行，所述攪拌的頻率為1～2次/h，每次攪拌的時間為10～20min，所述攪拌的轉速為150～300r/min。
優選的，所述步驟2)中二級發酵培養的時間為45～52h，二級發酵培養溫度為30～35℃。
所述二級發酵培養在光照下進行，所述光照的光強為4000～5000xl。
優選的，所述二級發酵培養過程進行通氣，所述通氣的程序具體為：進入二級發酵培養後24h之內，通氣量控制在100～180m3/h，培養24h後，通氣量為200～260m3/h。
優選的，所述二級發酵培養的接種量為7～15％。
優選的，所述二級發酵培養的初始pH為7.0～8.0。
優選的，所述步驟2)中的二級發酵培養在攪拌的條件下進行，所述攪拌的頻率為1～2次/h，每次攪拌的時間為10～20min(發明人需確認)，所述攪拌的轉速為150～300r/min。
優選的，所述步驟3)三級發酵培養的時間為62～67h，三級發酵培養的溫度28～32℃。
所述三級發酵培養在光照下進行，所述光照的的光強為5000～7000xl。
優選的，所述三級發酵培養過程進行通氣，所述通氣的程序具體為：進入三級發酵培養後36h之內，通氣量控制在1800～2300m3/h，培養48h後，通氣量為800～1200m3/h。
優選的，所述三級發酵培養的接種量為7～15％。
優選的，所述三級發酵培養的初始pH值為7.0～8.0。
優選的，所述步驟3)中的三級發酵培養在攪拌的條件下進行，所述攪拌的頻率為1～2次/h，每次攪拌的時間為10～20min，所述攪拌的轉速為150～300r/min。
優選的，其特徵在於，所述一級液體培養基包括下列質量百分含量組分：蔗糖2～5％、硝酸鈉0.1～0.2％、磷酸氫二鉀0.08～0.2％、硫酸鎂0.03～0.1％、氯化鉀0.02～0.1％、硫酸鐵0.001～0.003％，餘量為水；更優選的，所述一級液體培養基包括下列百分含量組分：蔗糖3％、硝酸鈉0.15％、磷酸氫二鉀0.1％、硫酸鎂0.05％、氯化鉀0.05％、硫酸鐵0.001％，餘量為水。
優選的，所述二級液體培養基包括下列質量百分含量組分：蔗糖1.00～2.00％、葡萄糖1.00～2.00％、黃豆粉0.70～1.50％、硫酸銨0.03～0.10％、磷酸氫二鉀0.03～0.10％、氯化鈣0.07～0.20％，餘量為水；更優選的，所述二級液體培養基包括下列百分含量組分：蔗糖1.5％、葡萄糖1.5％、黃豆粉1％、硫酸銨0.05％、磷酸氫二鉀0.05％、氯化鈣0.1％，餘量為水。
本發明還提供了一種克裡本類芽孢桿菌的發酵生產用培養基，包括下列質量百分含量組分：葡萄糖2.00～3.00％、玉米粉0.50～1.50％、硫酸銨0.03～0.10％、磷酸氫二鉀0.03～0.10％、氯化鈣0.07～0.20％，餘量為水。
優選的，包括下列質量百分含量組分：葡萄糖2.5％、玉米粉1％、硫酸銨0.05％、磷酸氫二鉀0.05％、氯化鈣0.1％，餘量為水。
本發明提供了一種克裡本類芽孢桿菌的發酵生產方法，將克裡本類芽孢桿菌菌種活化，在一級種子液體培養基和二級液體培養基進行培養以擴大繁殖，得到強健的菌體和一定量的孢子，將二級種子液接種到複合的碳源和氮源形成的三級液體培養基上，使克裡本類芽孢桿菌的快速生長和產芽孢。得到的發酵液中活菌數為10-50億CFU/ml，噴霧乾燥後，得到菌粉的收率為10％-15％。由此可見，採用本發明的技術方案最終獲取孢子含量較高的克裡本類芽孢桿菌粉，解決了本發明的技術問題。
附圖說明
圖1為本發明實施例中三級發酵菌液處理流程圖。
菌種保藏
克裡本類芽孢桿菌(Paenibacillus kribbensis)，包藏於中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，地址為中國.北京.北京市朝陽區北辰西路1號院3號，中國科學院微生物所，保藏機構簡稱：CGMCC，保藏日期為2013年8月13日，保藏編號CGMCC No.7996，菌株編號：TRCC82001。
具體實施方式
本發明提供了一種克裡本類芽孢桿菌的發酵生產方法，包括下列步驟：
1)將克裡本類芽孢桿菌菌種活化，接種到一級液體培養基中進行一級培養，得到一級種子液；
2)將所述步驟1)得到的一級種子液接種到二級液體培養基進行二級發酵培養，得到二級種子液；
3)將所述步驟2)得到的二級種子液接種到三級液體培養基進行三級發酵培養，濃縮分離後，得到克裡本類芽孢桿菌菌粉；
所述三級液體培養基包括下列質量百分含量組分：葡萄糖2.00～3.00％、玉米粉0.50～1.50％、硫酸銨0.03～0.10％、磷酸氫二鉀0.03～0.10％、氯化鈣0.07～0.20％，餘量為水。
本發明提供了一種克裡本類芽孢桿菌的發酵生產方法，將克裡本類芽孢桿菌菌種活化，在一級種子液體培養基和二級液體培養基進行培養以擴大繁殖，得到強健的菌體和一定量的孢子，將二級種子液接種到由複合的碳源和氮源形成的三級培養基上進行的三級發酵培養，使克裡本類芽孢桿菌的快速生長和產孢。
本發明將克裡本類芽孢桿菌菌種活化，得到活化的克裡本類芽孢桿菌菌種。本發明對所述活化的方法沒有特殊限制，採用本領域技術人員熟知的活化的技術方案即可。在本發明的實施例中，所述克裡本類芽孢桿菌菌種為江西天人生態股份有限公司提供。
在本發明中，所述活化的培養基優選為改良的固體察氏培養基II。
在本發明中，所述固體察氏培養基II的配方參見申請號為CN201310643992.5的專利。
得到活化的克裡本類芽孢桿菌，本發明將所述活化的克裡本類芽孢桿菌接種到一級種子液體培養基中進行一級培養，得到一級種子液。
在本發明中，所述一級培養的時間優選為28～32h，更優選為30℃。所述一級培養的溫度優選為28～32℃，更優選為30℃。所述的一級培養優選在光照條件下進行，所述的光照的光強優選為3000～4000lx，更優選為3500lx。
在本發明中，所述一級培養優選在攪拌的條件下進行，所述攪拌的頻率優選為1～2次/h，每次攪拌的時間優選為10～20min。所述攪拌的轉速為150～300r/min。
在本發明中，所述一級培養過程優選進行通氣，所述通氣的程序具體優選為：進入培養24h內，通氣量為10～20m3/h，更優選為15m3/h；進入培養24h後，通氣量優選為15～24m3/h，更優選為20m3/h。
在本發明中，所述通氣的氣體種類優選為無菌空氣。
在本發明中，所述一級培養的接種量優選為1.5～2.5％，更優選為2％。
在本發明中，所述一級培養的初始pH值為7.0～8.0，更優選為7.5。
在本發明中，所述一級種子液體培養基優選包括下列質量百分含量的組分：蔗糖2～5％、硝酸鈉0.1～0.2％、磷酸氫二鉀0.08～0.2％、硫酸鎂0.03～0.1％、氯化鉀0.02～0.1％、硫酸鐵0.001～0.003％，餘量為水；更優選為蔗糖3％、硝酸鈉0.15％、磷酸氫二鉀0.1％、硫酸鎂0.05％、氯化鉀0.05％、硫酸鐵0.001％，餘量為水。本發明對上述組分的來源沒有特殊限制，採用本領域技術人員所熟知的用於製備培養基的藥品即可。
得到一級種子液後，本發明將所述一級種子液接種到二級液體培養基中進行二級發酵培養，得到二級種子液。
本發明對所述接種的方法沒有特殊限制，採用本領域技術人員所述熟知的接種的技術方案即可。
在本發明中，所述二級發酵培養的接種量優選為7～15％，更優選為10％。
在本發明中，所述的二級發酵培養的時間優選為45～52h，更優選為48h。所述二級發酵培養的溫度優選為30～35℃，更優選為32℃。所述二級發酵培養優選在光照條件下進行，所述光照的光強優選為4000～5000lx，更優選為4500lx。
在本發明中，所述二級發酵培養過程優選在通氣條件下進行，所述通氣的程序具體優選為：進入二級發酵培養後24h之內，通氣量控制在100～180m3/h，更優選為150m3/h；培養24h後，通氣量為200～260m3/h，更優選為250m3/h。
在本發明中，所述通氣的氣體種類優選為無菌空氣。
在本發明中，所述二級發酵培養的初始pH優選為7.0～8.0，更優選為7.5。
在本發明中，所述二級發酵培養優選在攪拌的條件下進行，所述攪拌的頻率優選為1～2次/h，每次攪拌的時間為10～20min。所述攪拌的轉速為150～300r/min。
在本發明中，所述的二級種子液體培養基優選包括下列質量百分含量組分：蔗糖1.00～2.00％、葡萄糖1.00～2.00％、黃豆粉0.70～1.50％、硫酸銨0.03～0.10％、磷酸氫二鉀0.03～0.10％、氯化鈣0.07～0.20％，餘量為水，更優選為蔗糖1.5％、葡萄糖1.5％、黃豆粉1％、硫酸銨0.05％、磷酸氫二鉀0.05％、氯化鈣0.1％，餘量為水。
得到二級種子液後，本發明將所述二級種子液接種到三級液體培養基進行三級發酵培養，得到三級發酵菌液。
在本發明中，所述三級發酵培養的時間優選為62～67h，更優選為64h。所述三級發酵培養的溫度優選為28～32℃，更優選為30℃。所述三級發酵培養優選在光照培養條件下進行，所述光照的光強優選為5000～7000lx，更優選為6000lx。
在本發明中，所述三級發酵培養過程進行通氣，所述通氣的程序具體如下：進入三級發酵培養後36h之內，通氣量控制在1800～2300m3/h，更優選為2000m3/h；培養48h後，通氣量優選為800～1200m3/h，更優選為1000m3/h。
在本發明中，所述三級發酵培養36-48之間，通氣量逐漸減少，呈倒V型，在42h時進行缺氧操作，之後逐漸增加通氣量。所述缺氧操作的作用是在適當缺氧的條件下促使菌絲體更大程度的轉變為芽孢體。
在本發明中，所述通氣的氣體種類優選為無菌空氣。
在本發明中，所述三級發酵培養的接種量優選為7～15％，更優選為10％。
在本發明中，所述三級發酵培養的初始pH值為7.0～8.0，更優選為7.5。
在本發明中，所述三級發酵培養優選在攪拌的條件下進行，所述攪拌的頻率優選為1～2次/h，每次攪拌的時間優選為10～20min。所述攪拌的轉速為150～300r/min。
三級發酵培養後，本發明優選將得到的三級發酵培養液分離，得到上清液和濃縮液。
在本發明中，所述離心的轉速為10000-15000r/min更優選為12000～13000r/min。
在本發明中，所述離心的設備沒有特殊限制，採用本領域技術人員所熟知的離心機即可。在本發明實施例中，所述離心的設備為蝶式離心機。
在本發明中，所述濃縮液優選經噴霧乾燥塔乾燥，最終得到克裡本類芽孢桿菌的菌粉。
在本發明中，所述乾燥的溫度優選為35℃～40℃，更優選為37℃。
在本發明中，所述上清液經包裝後得到無菌發酵液產品。
本發明還提供了一種克裡本類芽孢桿菌的發酵生產用培養基，包括下列質量百分含量組分：葡萄糖2.00～3.00％、玉米粉0.50～1.50％、硫酸銨0.03～0.10％、磷酸氫二鉀0.03～0.10％、氯化鈣0.07～0.20％，餘量為水；更優選為包括下列質量百分含量組分：葡萄糖2.5％、玉米粉1％、硫酸銨0.05％、磷酸氫二鉀0.05％、氯化鈣0.1％，餘量為水。
本發明提供的一種克裡本類芽孢桿菌的發酵生產用培養基，所述培養基採用複合氮源和碳源及營養元素組成，通過優化各組分配比，使菌體產生含量豐富的芽孢和代謝產物。
下面結合實施例對本發明提供的克裡本類芽孢桿菌的發酵生產方法及培養基進行詳細的說明，但是不能把它們理解為對本發明保護範圍的限定。
實施例1
江西天人生態股份有限公司提供的克裡本類芽孢桿菌菌種在改良的固體察氏培養基II的固體斜面上接種1％的接種量，在30℃條件下培養3天，對菌種進行活化。將活化的菌種按照2％的接種量接種到一級液體培養基中在30℃條件培養30h，培養過程添加光照，光強為3000lx，進行一級培養，培養過程通入無菌空氣，進入培養24h內，通氣量為18m3/h，培養24h後，通氣量20m3/h，同時培養過程需攪拌的條件下進行，每小時內攪拌一次，每次攪拌持續20min，攪拌的轉速為150～300r/min，一級液體培養基配方為蔗糖3％、硝酸鈉0.15％、磷酸氫二鉀0.1％、硫酸鎂0.05％、氯化鉀0.05％、硫酸鐵0.001％，餘量為水，培養的初始pH值為7.5。結束一級培養後，將獲得一級種子液按照10％的接種量接種到二級液體培養基上，二級液體培養基包括蔗糖1.5％、葡萄糖1.5％、黃豆粉1％、硫酸銨0.05％、磷酸氫二鉀0.05％、氯化鈣0.1％，餘量為水，培養的初始pH值為7.5，在32℃條件下培養48h，培養過程需5000lx的光照，進入二級培養後24h之內，通入無菌空氣150m3/h，培養24h後，通氣量上調到250m3/h，二級培養過程中每小時攪拌2次，每次攪拌10min。結束二級培養後，將獲得二級種子液按照10％的接種量接種到三級液體培養基上，二級液體培養基包括葡萄糖2.5％、玉米粉1％、硫酸銨0.05％、磷酸氫二鉀0.05％、氯化鈣0.1％，餘量為水，培養的初始pH值為7.5；在30℃條件下三級發酵培養64h，培養過程中光照的光強控制為5000lx，進入三級發酵培養後36h之內，通氣量控制在2000m3/h，培養48h後，通氣量為1000m3/h；每小時攪拌2次，每次攪拌持續15min(發明人需確認)。得到三級發酵菌液後，採用蝶式離心機在10000r/min條件下離心，得到上清液和濃縮液，上清液經包裝後得到無菌發酵液產品，將濃縮液經噴霧乾燥塔37℃乾燥，得到克裡本類芽孢桿菌的菌粉。
實施例2
江西天人生態股份有限公司提供的克裡本類芽孢桿菌菌種在改良的固體察氏培養基II的固體斜面上接種1％的接種量，在30℃條件下培養3天，對菌種進行活化。將活化的菌種按照1.5％的接種量接種到一級液體培養基中在32℃條件培養28h，培養過程在光照下進行，光強為4000lx，進行一級培養，培養過程通入無菌空氣，進入培養24h內，通氣量為10m3/h，培養24h後，通氣量15m3/h，同時培養過程需攪拌的條件下進行，每小時內攪拌一次，每次攪拌持續20min，所述攪拌的轉速為150～300r/min，一級液體培養基配方為蔗糖5％、硝酸鈉0.1％、磷酸氫二鉀0.2％、硫酸鎂0.03％、氯化鉀0.1％、硫酸鐵0.001％，餘量為水，培養的初始pH值為7.0。結束一級培養後，將獲得一級種子液按照7％的接種量接種到二級液體培養基上，二級液體培養基包括蔗糖1.00％、葡萄糖2.00％、黃豆粉0.70％、硫酸銨0.10％、磷酸氫二鉀0.03％、氯化鈣0.20％，餘量為水，培養的初始pH值為8.0，在30℃條件下培養45h，培養過程需45000lx的光照，進入二級培養後24h之內，通入無菌空氣180m3/h，培養24h後，通氣量上調到200m3/h，二級培養過程中每小時攪拌2次，每次攪拌10min。結束二級培養後，將獲得二級種子液按照10％的接種量接種到三級液體培養基上，三級液體培養基包括葡萄糖2.00％、玉米粉1.50％、硫酸銨0.03％、磷酸氫二鉀0.10％、氯化鈣0.07％，餘量為水，培養的初始pH值為7.5；在32℃條件下三級發酵培養62h，培養過程中光照的光強控制為7000lx，進入三級發酵培養後36h之內，通氣量控制在2300m3/h，培養48h後，通氣量為1200m3/h；每小時攪拌2次，每次攪拌持續15min(發明人需確認)。得到三級發酵菌液後，採用蝶式離心機在15000r/min條件下離心，得到上清液和濃縮液，上清液經包裝後得到無菌發酵液產品，將濃縮液經噴霧乾燥塔40℃乾燥，得到克裡本類芽孢桿菌的菌粉。
實施例3
江西天人生態股份有限公司提供的克裡本類芽孢桿菌菌種在改良的固體察氏培養基II的固體斜面上接種1％的接種量，在30℃條件下培養3天，對菌種進行活化。將活化的菌種按照2.5％的接種量接種到一級液體培養基中在28℃條件培養32h，培養過程在光照下進行，光強為3500lx，進行一級培養，培養過程通入無菌空氣，進入培養24h內，通氣量為20m3/h，培養24h後，通氣量22m3/h，同時培養過程需攪拌的條件下進行，每小時內攪拌一次，每次攪拌持續20min，所述攪拌的轉速為150～300r/min，一級液體培養基配方為蔗糖2％、硝酸鈉0.2％、磷酸氫二鉀0.08％、硫酸鎂0.1％、氯化鉀0.02％、硫酸鐵0.003％，餘量為水，培養的初始pH值為8.0。結束一級培養後，將獲得一級種子液按照15％的接種量接種到二級液體培養基上，二級液體培養基包括蔗糖2.00％、葡萄糖1.00％、黃豆粉1.50％、硫酸銨0.03％、磷酸氫二鉀0.10％、氯化鈣0.07％，餘量為水，培養的初始pH值為7.5，在35℃條件下培養45h，培養過程需4000lx的光照，進入二級培養後24h之內，通入無菌空氣180m3/h，培養24h後，通氣量上調到200m3/h，二級培養過程中每小時攪拌2次，每次攪拌10min。結束二級培養後，將獲得二級種子液按照10％的接種量接種到三級液體培養基上，三級液體培養基包括葡萄糖2.00～3.00％、玉米粉0.50～1.50％、硫酸銨0.03～0.10％、磷酸氫二鉀0.03～0.10％、氯化鈣0.07～0.20％，餘量為水，培養的初始pH值為7.5；在28℃條件下三級發酵培養67h，培養過程中光照的光強控制為6000lx，進入三級發酵培養後36h之內，通氣量控制在1800m3/h，培養48h後，通氣量為800m3/h；每小時攪拌2次，每次攪拌持續20min。得到三級發酵菌液後，採用蝶式離心機在12000r/min條件下離心，得到上清液和濃縮液，上清液經包裝後得到無菌發酵液產品，將濃縮液經噴霧乾燥塔35℃乾燥，得到克裡本類芽孢桿菌的菌粉。
實施例1-3中得到的發酵液中活菌數為10-50億CFU/ml，乾燥得到的菌粉與發酵液之比為菌粉收率，經計算實施例1-3中得到的菌粉收率為10％-15％。
由以上實施例可知，採用合適的碳氮比，在一級種子液製備中以高的氮含量，促使菌種集中的菌體生產上，生長出更加強健的菌體，在二級種子液產生中，碳氮比菌體生產適宜，有強健的菌絲可以產生出更多的孢子，同時孢子萌發在菌液中，可以在三級發酵培養階段中更加大量的菌體；提供最適宜的非生物影響因子，在生產中優化發酵培養參數，更高效的控制手段，最終濃縮烘乾出菌粉。
以上所述僅是本發明的優選實施方式，應當指出，對於本技術領域的普通技術人員來說，在不脫離本發明原理的前提下，還可以做出若干改進和潤飾，這些改進和潤飾也應視為本發明的保護範圍。