一種十字花科黑腐病菌的iii型效應物基因及其應用的製作方法
2023-05-27 23:17:56 1
一種十字花科黑腐病菌的iii型效應物基因及其應用的製作方法
【專利摘要】本發明公開了一種十字花科黑腐病菌的III型效應物基因及其應用。本發明提供的十字花科黑腐病菌的III型效應物基因具有下述核苷酸序列之一：(1)SEQIDNO:1所示的DNA序列；(2)與序列表中SEQIDNO:1所限定的DNA序列具有80％以上同源性的DNA序列。本發明提供的十字花科黑腐病菌III型效應物基因的應用於植物病害的防治。本發明提供了一種新的十字花科黑腐病菌致病相關基因，提供了可能的防治植物病害的藥物靶標；其致病試驗表明，XC2210基因的Tn5gusA5插入突變體的致病性顯著降低。
【專利說明】—種十字花科黑腐病菌的111型效應物基因及其應用
【技術領域】
[0001]本發明涉及植物病原細菌的致病相關基因，尤其涉及的是一種十字花科黑腐病菌的III型效應物基因及其應用。
【背景技術】
[0002]III型分泌系統(T3SS)是存在於多種動、植物病原菌中可向寄主細胞內分泌致病效應物的蛋白分泌系統，在病原菌致病過程中起決定性作用。T3SS通常由成簇存在的hrp基因簇編碼，在染色體上形成所謂的「毒島」或「致病性島」。在十字花科黑腐病菌中，位於hrp基因簇旁側的hrpG和hrpX是最關鍵的調控基因，HrpG調控hrpX，HrpX調控包括hrp基因簇調控單元在內的大多數HrpG調控元基因的表達，大部分HrpX調控元基因的啟動子區都存在PIP-box (植物誘導啟動子盒)。根據「基因對基因」理論，寄主關係的建立取決於病原體與植物的親和識別，而效應物蛋白對寄主的識別屬於寄主胞內識別，不同類型的效應物有不同的寄主胞內靶點，效應物與寄主胞內靶點相互識別及作用的結果決定了細菌的致病性和寄主專一性。
[0003]植物病害一直是農作物減產、品質降低的主要因子之一。十字花科黑腐病菌是一種革蘭氏陰性細菌，能在全球範圍內引起十字花科植物黑腐病，導致農產品的產量和品質嚴重下降。目前，還沒有很有效的生物農藥對該病有有效的防治作用，而隨著病原菌對藥物抗性的增強，農藥用量在不斷增加，這不僅加劇了環境汙染、藥物殘留，也大大提高了農業成本，因此，亟待研發新的防病治病策略和新型的無公害藥物。
【發明內容】
[0004]本發明所要解決的技術問題是針對現有技術在防治十字花科植物黑腐病中存在的不足，提供了一種十字花科黑腐病菌的III型效應物基因及其應用。
[0005]本發明的技術方案如下:
[0006]一種十字花科黑腐病菌的III型效應物基因，具有下述核苷酸序列之一:
[0007](I) SEQIDNO:1 所示的 DNA 序列；
[0008](2)與SEQIDN0:1所限定的DNA序列具有80%以上同源性的DNA序列。
[0009]所述的III型效應物基因，其自5』端的第501-4667位核苷酸為開放閱讀框。
[0010]所述的十字花科黑腐病菌的III型效應物基因在植物病害防治中的應用。
[0011]所述的十字花科黑腐病菌的III型效應物基因的序列已在國立生物技術信息中心(NCBI)公布，基因組序列號NC_007086，該基因編碼蛋白序列號YP_243285。攜帶該基因的質粒ΡΕΤ2210已在廣西大學生命科學與技術學院保存。 [0012]SEQIDN0:1所示的DNA是十字花科黑腐病菌8004菌株的DNA，由4667個鹼基組成。含完整的III型分泌效應物基因，自5』端的第501-4667位核苷酸為該基因的開放閱讀框(OpenReadingFrame, 0RF),自5』端的第501-503位核苷酸為該基因的起始密碼子ATG，自5』端的第4665-4667位核苷酸為終止密碼子TAG。[0013]序列表中SEQIDN0:2所示的蛋白質是十字花科黑腐病菌的III型效應物基因XC2210的編碼產物，由1388個胺基酸組成。
[0014]本發明提供了一種新的十字花科黑腐病菌致病相關基因，提供了可能的防治植物病害的藥物靶標。其致病試驗表明，XC2210基因的Tn5gusA5插入突變體的致病性顯著降低。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0015]圖1為XC2210基因啟動子區和分泌轉運區及XC2210基因克隆酶切電泳凝膠圖；圖中，M:100bp標準DNA ;1:XC2210基因啟動子區和分泌轉運區PCR擴增片段；2:XC2210啟動子區和分泌轉運區片段克隆PXC2210酶切電泳圖譜。
[0016]圖2為XC2210基因轉運鑑定菌株的酶切電泳凝膠圖；圖中，M:A/HindIII標準 DNA(片段大小從大到小依次為 23.lkb, 9.4kb, 6.6kb, 4.36kb, 2.4kb, 2.0kb) ；1~2:Xcc8004*/pJJA2210 和 8004*ΛhrcV/pJJA2210。
[0017]圖3為XC2210基因插入突變體044A05的PCR驗證凝膠圖；圖中，Ml:1OObp標準DNA ；1-4:XC2210基因插入突變體044A05的4個單克隆；Μ2: λ/HindIII標準DNA (片段大小從大到小依次為 23.lkb, 9.4kb，6.6kb，4.36kb，2.4kb，2.0kb)。
[0018]圖4為XC2210基因Tn5gusA5插入突變體的致病性試驗；圖中，8004為野生型Xcc菌株，044A05為XC2210基因的Tn5gusA5插入突變體。
【具體實施方式】 [0019]以下結合具體實施例，對本發明進行詳細說明。
[0020]在本發明的實施例中所用到的材料包括:大腸桿菌(Escherichiacoli)株系JM109 ;克隆載體pUC19及柯斯質粒pLAFR3、pLAFRJ為本研究室保存；限制性內切酶、修飾酶等試劑購自 Promega、Stratagene、QIAGEN 公司。
[0021]實施例1XC2210基因啟動子區以及分泌轉運區的克隆及序列測定
[0022]根據XC2210 的基因序列，設計引物 P2210_F/P2210-R(ggggaattcccagcaacaaggccagcgtg/gggggtaccttggcgacgccgggagatcc),以野油菜黃單胞菌總DNA為模板，用PCR法擴增該基因啟動子區以及分泌轉運區序列(20yL擴增體系:10XBuffer2yL，ExTaqDNA聚合酶 0.5 μ L,2.5mmol/LdNTPmixture2μ L,10 μ mol/LP2210_Flμ L,10 μ mol/LP2210_Rlμ L,模板 DNA2y L，ddH2011.5μ L ;擴增條件:95 °C 3min ；95 °C 30s, 60 °C 30s, 72 °C lmin,30cycles ；72°C 5min)，並將其克隆至克隆載體pUC19中，獲得了含該基因啟動子區以及分泌轉運區序列的重組質粒PXC2210。該質粒用EcoRI和KpnI酶切，除了一個2.7kb的載體條帶外，還有一個1.022kb的插入片段(見圖1)。送華大公司測序，結果正確。
[0023]實施例2候選效應物轉運鑑定菌株的構建
[0024]將XC2210基因的啟動子區以及分泌轉運區分別克隆到大腸桿菌和Xcc之間的穿梭質粒PJJA (該質粒是將cyaA基因中具有腺苷酸環化酶活性的區域克隆至pLAFR3衍生質粒pLAFRJ上)，酶切並測序驗證後將pJJA重組質粒分別引入Xcc8004*和8004* Δ hrcV中，得到候選效應物轉運鑑定菌株，酶切驗證後(見圖2)，通過檢測菌株在甘藍京豐I號的腺苷酸環化酶活性判斷所克隆的基因是否為依賴III型分泌系統分泌的效應物基因，本發明涉及一個新的III型分泌效應物基因--XC2210基因。
[0025]實施例3腺苷酸環化酶活性檢測
[0026]實驗所用寄主植物為甘藍京豐I號，所用的接種方法為壓滲法。XC2210基因的效應物轉運鑑定菌株和對照菌株在28°C下進行液體培養15-18h。用鈍端塑料注射器吸取約10 μ L用10mmol/L磷酸鈉緩衝液(5.8mmol/L的磷酸氫二鈉和4.2mmol/L的磷酸二氫鈉，PH7.0)懸浮生物細菌懸浮液(lX107CFU/mL)接種到甘藍京豐I號葉的背面。將接種的植物置於溫室中，保持12h光照周期和28°C的恆定溫度，24h後收集Icm2的葉片，置液氮中研磨，等液氮揮發完後，加入323 μ L的1.1moVLHClO4繼續磨，等葉片徹底磨碎後，15000g離心 IOmin,取上清 280 μ L 加入 37.3 μ L6mol/LK2C03,150 00g 離心 IOmin0 取上清 200 μ L,用真空冷凍抽乾機乾燥，乾燥後置_80°C保存。按照Amersham的cAMPBiotrakEnzymeimmunoassay (EIA) System試劑盒的使用說明書,檢測待測菌株的腺苷酸環化酶活性。試驗表明，XC2210基因的效應物轉運鑑定菌株的腺苷酸環化酶活性明顯高於對照(見表1)，表明XC2210是依賴III型分泌的效應物基因。
[0027]表1壓滲24h後檢測甘藍cAMP水平的檢測結果
【權利要求】
1.一種十字花科黑腐病菌的III型效應物基因，其特徵在於，具有下述核苷酸序列之
(1)SEQIDNO:1 所示的 DNA 序列； (2)與SEQIDN0:1所限定的DNA序列具有80%以上同源性的DNA序列。
2.根據權利要求1所述的III型效應物基因，其特徵是，自5』端的第501-4667位核苷酸為開放閱讀框。
3.根據權利要求1所述的十字花科黑腐病菌III型效應物基因的應用，其特徵是，在植物病害防治中的應用。
【文檔編號】C12R1/64GK103993021SQ201410227459
【公開日】2014年8月20日 申請日期:2014年5月27日 優先權日:2014年5月27日
【發明者】姜偉, 姜伯樂, 唐紀良, 何勇強, 唐菲菲, 韋紅玉, 蔣國鳳, 岑衛健, 杭小紅 申請人:廣西大學