變態反應疫苗組合物及其製備方法及在變態反應治療中的用途的製作方法

2023-05-28 09:02:11 2

專利名稱：變態反應疫苗組合物及其製備方法及在變態反應治療中的用途的製作方法
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本發明涉及免疫學領域，特別是免疫-變態反應的分支和尤其是能調節對變應原免疫應答的佐劑或載體化合物的用途。本發明的目的是在特異性應答中誘發變化從而減少或阻止它的致病效應。
變態反應是一種非常常見的病理學，主要發生在工業化國家中。變態反應中介入了若干免疫病理學機制，特別是所謂的I型過敏性超敏感性。I型超敏感性的病理生理學是基於一種親細胞抗體IgE產生的增加。在最初接觸即致敏後，針對外來物質即變應原產生IgE抗體。
IgE抗體能與血液嗜鹼細胞和組織肥大細胞表面上的IgE受體結合，其平均壽命從血液中的幾個小時延長到組織中的幾個月。變應原與細胞結合的IgE抗體的隨後接觸能引起鄰近抗體的交聯，其能觸發向細胞質的信號級聯，從而導致細胞脫粒和炎症介質如組胺、血清素(serotonine)和激肽(kinines)的釋放。
最常見的變應性疾病有鼻炎、哮喘和特應性皮炎。變應性哮喘是一種慢性炎症疾病。哮喘的免疫發病機制不僅涉及IgE依賴機制(I型過敏應答的原因)，還涉及T細胞，尤其是所謂的Th2細胞亞型。Th2淋巴細胞通過其它細胞的募集和活化，尤其通過造成嗜曙紅細胞募集和活化的IL-5產生誘發和維持炎症應答。嗜曙紅細胞在支氣管高反應性的發生中起著重要的作用，它是哮喘的一個基本特徵。
常見的變應原有花粉，房塵蟎(house dust mites)、黴菌、藥品、食物、動物毛髮和皮屑。室內的變應原特別是房塵蟎是呼吸變態反應和哮喘最相關的起因。
變應性疾病的臨床表現通常用抗組胺藥、β-激動劑、sodiumchromoglicate和皮質激素進行治療。這些治療劑一般是不適當的，因為它們是純粹針對症狀的並不影響疾病的發病機理(ethiopathogeny)。現在，廣泛的認識到需要更加有效的治療方法，特別是特異性免疫療法或治療性疫苗。
傳統上，用變應原提取物進行脫敏處理(也稱為特異免疫療法)被廣泛用於變應性疾病的治療中。在這種類型的治療中，病人定期皮下注射給予特異性令人厭惡的變應原。一開始注射小劑量的變應原，如果沒有出現變應性反應，則加大劑量。開始時每周注射給藥一次，隨後劑量逐漸增加直至達到每月一次或每半個月一次的維持劑量。這個治療需維持數年(WHO Position Paper.Allergen ImmunotherapyTherapeutic Vaccines against Allergic Diseases.Geneva，January 1998)。
雖然該方法被認為對於一些變應性疾病是相對有效的，但免疫療法的安全性還是受到了置疑。在治療中，病人可能遭受嚴重過敏反應的痛苦，最後甚至是致命的。另外，3年中大約為100-200次的高數量的注射給藥，對它的實際應用構成了嚴重的缺陷。不良的病人順應性和過早的治療放棄經常導致達不到預期效果。
近幾年來，對變應性學科中IgE免疫應答誘發機制的認識已經取得了很大的進步。B細胞的IgE產生通過Th2免疫細胞應答的特異性機制激發，特別是，它通過經由Th2細胞的IL-4的過量產生誘發。Th2細胞不僅病理學上涉及它們的調節作用(通過T細胞提供的接觸信號介導，IL-4誘發類別轉換為B淋巴細胞中的IgE)，還涉及直接參與遲髮型變應性炎症應答和哮喘慢性炎症的效應期。
與周圍環境變應原的接觸，另外還有自己的遺傳體質，都導致了變應性敏化現象的發生，並引起變應性反應的觸發。
使病人在變應原免疫療法中取得臨床改善的免疫機制仍然不能完全被解釋。儘管如此，已知一些免疫學變化的發生，IL-4和IL-5分泌的減少和IFN-γ和IgG水平的增加與變應原特異性IgE的長期減少相關聯。這些變化表示了Th2應答模式的減少，也就可能誘發不致病的並發Th1模式(WHO Position Paper.Allergen ImmunotherapyTherapeutic Vaccinesagainst Allergic Diseases.Geneva，January 1998)。
Th1/Th2應答模式首先通過經由Th細胞分泌的細胞因子的典型模式來進行區別，即Th1分泌IFN-γ和IL-2和Th2分泌IL-4和IL-5(Mossman，T.R.，Cherwinski，H.，Bond，M.W.，Giedlin，M.To，和R.L.Coffman.1986.Two types of murine T helper cell clones.I.Definition according to profiles of lymphokine activities andsecreted proteins.J.Immunol.1362348-2357)。另一方面，可以確定決定血清Ig類/亞類特徵的誘發應答的類型。從而，鼠Th1模式誘發優選IgG2亞類的抗體(IFN-γ依賴型)，而Th2誘發IgE和IgG1亞類(IL-4依賴型)。在人體中，Th1與IgG1/IgG3抗體相關聯和Th2與IgE相關聯。
雖然變態反應的發病和發展是由環境因素引起的，但個體形成Th2/IgE應答的傾向中的主要作用是遺傳性指令(Holgate ST.Environmental Genetic and interaction in allergy and Asthma.JAllergy Clin Immunol 1999；1041139-1146)。因此，變應性父母的後代比非變應性父母的孩子有更大的機率患變應性疾病。如果父母親，母親或父親患有變應性疾病的話，該機率分別估計為75、50和25％。那就意味著如果對於父母應用診斷系統，能夠很大程度的預測人群中個體的行為。另外，眾所周知的是，病理學Th2模式的建立出現在生命的最初6-24月內。環境因素如暴露於細菌感染確實可以引起發病，誘發Th1模式，其下調了變應性Th2模式(Holt PG，Programming ofAllergen Specific Th-memory during Childhood.Proceedings XVIIInternational Congress of Allergology and Clinical ImmunologySydney 2000.Allergen Clin Immunol International Suppl.1，2000pp 83-85)。這些發現暗示設計在幼童早期能防止對變應原形成Th2應答的預防性抗變應性疫苗的可能性。這些疫苗可基於被理論上認為在哺乳期間有效的Th1佐劑。
一些方法被嘗試用於改善變應原免疫療法，目的為了減少它們的不良作用，保留並擴大它們的優點。特別是，已知已經使用一些方法去修飾變應原，使得它的變應原性(即它被1gE抗體識別的能力)和免疫接種後誘發IgE抗體的能力可能被降低，以及增加了它們的免疫原性(即其誘發治療性或可能的保護性應答的能力)。其中有通過變應原吸附產生貯存效果(佐劑)的物理方法，也有對變應原進行修飾的化學方法，其將變應原與其它化合物或在它們自己中間通過共價連接。
所使用的一些物理試劑有酪氨酸(專利No.GB 1,377,074)，酪氨酸酯(專利US 4,428,932)；脂質體(專利申請WO 89/10753)；單磷醯脂質A(Monophosforil Lipid A)(MLA)(專利US 5,762,943)；皂角苷(Saponine)(專利US 4,432,969)和傳統上的一些如氫氧化鋁或磷酸鈣。
用於變應原聚合的化學試劑有甲醛(Marsch DG等，Studies onallergoids from naturally occurring allergens.III Preparationof Ragweed pollen allergoids by aldehyde modification.J.AllergyClin.Immunol.1981；68449-59)；藻酸鹽(Corrado OJ等，Allergy1989；44108-5)和戊二醛(專利GB 1,282,163)。另外還有MPEG(Dreborg等，Crit Rev Ther Drug Carrier Syst.1990；6315-65)和多糖綴合物(歐洲專利申請EP 3497 008 A2)。
這些解決辦法在一些情況下(例如Glutaraldehyde polymerizedallergens，Alumadjuvanted，Grammer等，Modified forms of allergenimmunotherapy，J Allergy Clin Immunol 1985；44108-15)可能增加動物模型中變應原特異性IgG滴度。儘管如此，這些抗體種類的增加並不必然意味著病人的臨床改善，特別是當IgE抗體平行增加時。事實上，在不同的變應性反應中也涉及一些IgG亞類(小鼠中的IgG1和人體中的IgG4)，由於其與肥大細胞表面短暫結合的能力。
在另一方面，人類的臨床數據顯示IgG抗體的增加與臨床改善並無直接的關係，表明這些抗體在由治療誘發的調節機制中起著次要的作用(Rak S.Lowhagen O.，Venge P.Bronchial The effect of immunotherapy onhyperresponsiveness and eosinophil cationic protein inpollen-allergic patients.J Allergy Clin Immunol 1988；82470-80和Jutel M，Müller Or，Fricker M，Rihs S，Pichler W，DahindenC.Influence of bee venom immunotherapy on degranulation andleukotriene generation in human blood basophiles.Clin ExpImmunol 1996；121112-18)。
儘管與傳統變位原提取物比較經化學修飾的變應原(稱為類變應原(allergoid))在治療過程中具有一些有關次要副作用有所減少的優點，但它們不會產生顯著的臨床改善(Bousquet等，J.AllergyClin.Immunol.1989；84546-56和Grammer等，J Allergy Clin.Immunology 1985；76397-401)。到目前為止臨床試驗中所用的類變應原(經戊二醛或甲醛修飾的)的另一個缺陷是實際不可能獲得一種標準化的組合物，因為由變應原提取物通過化學反應獲得的最終產品是多肽和其它生物分子的不均勻混合物。在這些反應中，不可避免的形成具有不同聚合程度或化學修飾的分子種類，其中就有不需要的並且難以除去的副產物。
氫氧化鋁僅僅是用於減少達到與沒加佐劑的變應原相同的效應必須注射的次數，這歸功於它的貯藏(depot)和緩慢釋放的效果。儘管如此，已知該佐劑刺激IgE產生，這在動物體和人體內差不多，誘發典型的Th2模式，從而在其給藥期間可能會加強致病的變應性應答。
磷酸鈣和酪氨酸也被用作吸附劑以形成貯藏效果，並緩慢釋放變應原。然而，在治療的有效性和安全性上這些製劑與用水或明礬輔佐的提取物相比沒有顯示出顯著的優點(Altintas DU等，Comparison betweenthe use of adsorbed and aqueous immunotherapy material inDermatophagoides pteronyssinus sensitive asthmatic patients.Allergologie et Immunopathologie 1999；27(6)309-317)。
目前存在的、先前提及的解決辦法還沒有在動物或人體中達到完全有效的免疫調節(表現為抑制或減少Th2模式或誘發Th1)，而且減少注射次數病人中沒有顯示出臨床有效性。
含變應原的脂質體的使用在專利申請WO 89/10753中已有記載。其中認為由於脂質體具有脂質的和微粒的性質，因此它們除了能形成貯藏並且減少產物的變應原性，而且還能影響對免疫系統的抗原呈遞機制(WHO Position Paper.Allergen ImmunotherapyTherapeuticVaccines against Allergic Diseases.Geneva，January 1998)。然而，這些方法仍具有不能廣泛用於臨床實踐的缺陷。其中包括製劑缺乏穩定性和以一致的方式將變應原包含入脂質體的技術的可利用性。脂質體製劑在貯藏或對病人給藥期間缺乏穩定性將對治療的安全性產生嚴重的影響，因為變應原從脂質體中可能不可控的釋放會引起嚴重的過敏反應，類似於水性形式的變應原。而且，還沒有獲得誘發有效免疫應答，如影響Th1/Th2平衡或誘發非致病的或產生保護的模式的確定證據。
近來更多的方法設法使用帶有Th1應答佐劑誘導物的變應原製劑，如單磷醯脂質A(MLA)(專利US 5,762,943)和專利WO9823735中記載的熱休克蛋白(HSP)，也稱為分枝桿菌彈性蛋白。MLA，一種LPS的去毒變體，在實驗小鼠模型中能減少特異性IgE和增加IgG水平。儘管如此，也未能證明它能有效減少變應性應答的Th2細胞成分。因此，它的用途被嚴格的限制於以I型超敏反應機制為主的變應性疾病，不包括哮喘。另一個主要缺陷是，雖然LPS的毒性已被減弱但並沒完全除去(Baldrick P等，Vaccine 20，2002 737-743)，這將限制其在小孩中的用途。至於HSP，還沒有任何實驗證據表明在動物模型或人體中，臨床有關的變應原與這些蛋白混合或綴合能產生變應原特異性Th2應答的變化。
來自革蘭氏陰性菌外膜的蛋白脂質體用於對抗感染性疾病的預防性疫苗中的用途在如下文獻中已有記載，Ruegg CL和cols.(Preparation of proteosome-based vaccines.J ImmunologicalMethods 1990；135101-9)；Lowell和cols.(Proteosome-Lipopeptide vaccinesEnhancement of for ImmunityMalaria CS Peptides.Science 1988；240800-2)；和專利US5,597,572。在後者中，主要記載了來自腦膜炎奈瑟氏球菌(Neisseriameningitidis)血清組B的外膜蛋白脂質體或小囊泡(OMV)。並且認為它經證實的在人體中的免疫原性和保護原性與它的微粒結構、加入OMV中的脂低聚糖(LPS)痕量、多糖C、脂質組分和吸附入明礬中相關。
由於OMV的特殊結構和組成，儘管含有LPS，這些疫苗製劑在人體或動物體內都不會引起毒性效應。在另一方面，仍能保持LPS的免疫調節劑和佐劑效應。
基於這種蛋白脂質體的抗腦膜炎球菌的疫苗已經被成功的使用超過5000萬劑量，並證明用於預防腦膜炎奈瑟氏球菌血清組B和C是安全、非反應原性和有效的。而且它還能被安全地用於哺乳期。它還顯示出能將非T細胞依賴型多糖C抗原轉換為T細胞依賴型。該疫苗在人體和動物體中優先誘發Th1模式，特徵在於誘發淋巴組織增生；抗OMV IgG抗體(人體中IgG1亞類和小鼠中IgG2a亞類)；IFN、IL-2和IL-12，蛋白和mRNA水平上。它並不誘發抗OMV IgE，也不增加蛋白或mRNA水平上的總IgE和IL-4、IL-5水平(Infect Immun.2001，69(72001)4502-4508)。就像平常的適應性免疫一樣，通過該疫苗誘發的應答，對產品中所含的細菌性抗原是特異性的，從而對於常見的一般變應原沒有誘發免疫應答的證據。
本發明的目的就是要得到一種用於治療或預防目的的基於使用細菌蛋白脂質體的藥物組合物。該組合物，一旦被用於變應性病人就能將變應原誘導的變應性Th2應答轉換為細胞Th1應答。本發明還涉及使用該疫苗組合物的免疫接種方案。本發明的另一個目的是提供一種能防止具有遺傳性過敏症家族史的孩子出現和發生變應性疾病的藥物組合物。
該組合物可含有一種或多種變應原，它們可以偶聯到蛋白脂質體上或與其同時給藥，誘發變應原特異的治療或保護性免疫應答。該應答的特徵在於與傳統的免疫療法相比IgE抗體產生減少，不誘發IL-5，以及IgG1抗體亞類(在人體中)和IgG2a抗體亞類(在小鼠中)，和IFN-γ(在兩者中)的誘發。這些特徵表明了Th1型免疫應答的誘發和從變應原性Th2應答到細胞Th1的轉換。
本發明的另一個目標是提供將變應原偶聯到蛋白脂質體或其它佐劑上的方法，以及提供了一種適於非胃腸道途徑給藥的藥物組合物。
本發明的新穎性首先在於來自革蘭氏陰性菌和特別是來自腦膜炎奈瑟氏球菌B外膜蛋白的蛋白脂質體的應用。這些蛋白脂質體(單獨或與多糖一起)以非共價或共價方式與一種或多種變應原蛋白偶聯，隨後向變應性受試者給藥。
本發明的特別的新穎性是，該藥物組合物通過僅用兩次注射誘發對包含其中的變應原特異性免疫應答的調節，將其變為非致病和保護性Th1模式。
另一個創新方面是該藥物組合物在變應性父母的後代或早期診斷為遺傳性過敏症個體中的預防性應用。
另外的創新點是用於將製劑的主要成分特別是蛋白脂質體與變應原非共價偶聯的方法，以及用於該目的經純化的變應原的用途。
在本發明中，使用蛋白脂質體或OMV，純化自革蘭氏陰性菌培養物、特別是如專利US5,597,572中所記載的腦膜炎奈瑟氏球菌B培養物。
本發明中，雖然也能使用多糖變應原，但優選使用蛋白或糖蛋白性質的變應原。這些變應原獲自天然變應原性來源材料，使用已知的提取和純化方法或通過在微生物或高等生物細胞中表達和克隆以重組形式獲得。或者，可以使用根據天然變應原的胺基酸序列化學合成的多肽。特別是，優選呼吸變應原首先得自屬於室塵蟎科(Pyroglyphidae)或甜食蟎屬(Glyciphagidae)族的房塵蟎，特別是屬於表皮蟎屬(Dermatophagoldes)或Blomia屬和尤其是屬於絲泊塵蟎(Dermatophagoides siboney)，房塵蟎(Dermatophagoidespteronyssinus)或粉塵蟎(Dermatophagoides farinae)種。這些蟎類的純化的變應原優選來自任何可用的商業變應原提取物，該提取物首先進行冷凍乾燥或通過超濾濃縮至蛋白含量為10-100mg/mL，隨後在50-100％硫酸銨溶液中進行鹽析沉澱。將沉澱物再混懸於水溶液中並通過使用具有如下基質之Sephacryl S-100，Sephacryl S-200，Sephacryl S-300或Superdex 75的凝膠過濾色譜法進行分離。收集相應於10-60kDa分子量的峰。該級分主要含有組1(25kDa糖蛋白Ders 1，Der p 1，Der f 1)和組2(15kDa蛋白Der s 2，Der p 2，Der f 2)主要變應原。或者，對各個主要變應原進行分離純化步驟，優選使用抗組1和抗組2單抗親和色譜法，隨後，將所有成分加入製劑中與蛋白脂質體偶聯，或者分別與其偶聯。
兩種基本成分(變應原和蛋白脂質體)的偶聯通過共價或非共價連接完成的。這種選擇需要考慮每個特異變應原的性質。對於非共價偶聯，蟎類變應原以0.1-1g/10g蛋白脂質體的比例包埋入蛋白脂質體中。該偶聯方法利用了兩種成分之間的疏水和親脂相互作用；該方法通過在60至600rpm轉速下機械攪拌30-60分鐘而進行。所得到的混合物可以直接以水溶液形式或吸附到氫氧化鋁凝膠上給藥。在後者中，變應原可以在與蛋白脂質體偶聯之前先吸附到凝膠上，或者優選在蛋白脂質體吸附後再加入凝膠上。氫氧化鋁的量可以是蛋白脂質體量的10到25倍，同時保持前面提及的變應原與蛋白脂質體的含量比例。在pH值6至8的範圍內，通過在60-600rpm攪拌下進行吸附到明礬凝膠上的過程。
使用主要變應原特異的Mab-ELISA檢測變應原吸附到明礬凝膠中的效力，如抗-Der s 1 ELISA(Sewer等，Int Arch Immunol Immunol2000；123242-248)和抗-Der s 2 ELISA(Heymann PW，Chapman MD等，J Allergy Clin Immunol 1989；831055-1067)。
變應原與蛋白脂質體的偶聯也能通過使用交聯劑或間隔基(spacer)進行共價連接而完成，所述間隔基能與蛋白脂質體上可用的胺基酸基團偶聯，隨後將間隔基馬來醯亞胺基與變應原分子上的游離巰基(SH)偶聯。蟎主要變應原蛋白(組1和2)中就存在這樣的游離SH基團，儘管如此，它們也能通過減少二硫橋或用已知化學方法進行蛋白的衍生在其它的變應原中被誘發。所得到的綴合物隨後通過透析或超濾純化，最後通過凝膠過濾色譜法(Sephacryl S-300或Superdex 200)去除綴合試劑以及未結合的變應原。為了誘發適當的免疫應答，變應原分子必須佔綴合物總量的1至10％。綴合物在適宜的水性賦形劑中或吸附至氫氧化鋁凝膠上或在其它適當的貯藏佐劑中以注射途徑給藥。
本發明還包括通過上述方法的親脂性殘基(如16至20個碳的兩性脂肪酸)與變應原的綴合，促進其非共價摻入蛋白脂質體。
或者，該疫苗組合物可能包括不會影響被誘發的細胞模式和對變應原預期應答強度的其它抗原。多糖，特別是來自腦膜炎奈瑟氏球菌的多糖C能用於此目的。它們以非共價形式加入製劑中，以0.5到4倍於蛋白脂質體量的比例。
本發明還包括一些在花粉和植物食物變應原來源中發現的多糖性質的變應原的用途，如交叉反應性糖類決定簇(CCD)(Aalberse，RC.Crossreactivity of IgE antibodies to allergens.Allergy 56(6)，2001，pp478-490)。在該情況中，變應原以與腦膜炎奈瑟氏球菌多糖C相同的方式加入製劑中。
令人意想不到的是，該疫苗組合物僅以兩劑量通過非腸胃道途徑給藥，不僅誘發先前已知的對蛋白脂質體抗原的特異性Th1應答，還有直接對抗製劑中所包括的抗原的類似Th1應答。令人驚奇的是，Th1應答佔優勢，儘管製劑中使用了氫氧化鋁，保留了貯藏效應。該應答特徵在於細胞因子模式，具有高水平的IFN，IL-5不誘發，還有變應原特異性IgG2a抗體的誘發和小鼠中IgE和IgG1抗體的減少。該組合物的給藥不會影響先前免疫接種誘發的對抗細菌性抗原的已經存在的應答。
所提出的解決方法具有如下優點該疫苗組合物誘發的免疫效應能解決如下問題過敏性I型超敏應答(IgE和IgG1的減少)，和遲髮型炎症和慢性變應性反應(IL-5減少)，因而它可以有效的治療哮喘。治療效果歸功於在非變應性情況下變應原對免疫系統的呈遞，並且它與用變應原提取物的傳統免疫療法相比以減少的注射次數和縮短的時間獲得。該效果不僅能有利的被用於變應性病人的治療，而且還能阻止變應性疾病在帶有早期變應性狀態個體中的發生或阻止對其它變應原的新變應性敏化的發生。
作為一種免疫修飾佐劑，蛋白脂質體的免疫效應在生命的最初幾個月即哺乳期內是有效和安全的。它使那個年齡的孩子在疾病還沒出現或發展時，為了達到預防目的進行疫苗給藥成為可能。它對於具有變應性家族史而因此具有高概率發病的那些孩子特別有用。
將活性成分吸附入貯藏佐劑，特別是氫氧化鋁中，製劑的變應原性(即IgE的結合能力)相對於相似劑量的水溶液變應原減少了10倍以上。這就意味著顯著減少了給藥期間嚴重過敏反應的風險。另外，吸附入凝膠可減少有可能引起活性成分降解的化學反應的動力學，從而延長了製劑貯存期的穩定性。
經純化的變應原和特別是經純化的表皮蟎屬類的蟎類變應原(包括組1和2變應原)的應用促進了產物組合物的標準化。隨後，可以精確的測定或適合製劑中變應原的含量和分析它與蛋白質脂質體偶聯或吸附入與氫氧化鋁凝膠的效力。另外，在共價偶聯中，由於兩種成分的分子量的顯著差異，能很容易的從活性化合物中(蛋白脂質體-變應原綴合物)分離出不需要的副產物(如變應原-變應原聚合物)。這種分離可以通過商業可得的分子篩色譜法進行。該技術可以被用於不同性質的變應原，從而可能在同一製劑中使用多種變應原。
本發明的另一個優點在於產物雖然含有少量的LPS，但是無毒性，在另一方面，保持了它們的免疫原效應。這就使其適合安全的給藥於人特別是小孩子。
蛋白脂質體還可以將T非依賴型抗原，如糖類轉換為T依賴型抗原。該特徵也能有利的用於多糖性質的變應原，如CCD。
本發明通過如下具體的實施例進行進一步描述。
實施例1.蟎類變應原的獲得和純化變應原來自全部的蟎培養物，其中包括死蟎、鱗屑、排洩物顆粒以及低分子量的培養基成分。在如下溶液之一中提取變應原PH值接近生理值的碳酸氫銨，碳酸氫鈉，磷酸鹽緩衝鹽水或鹽水。粗提物通過離心分離和過濾進行澄清，並通過凝膠過濾色譜法(Sephadex G-25)或透析過濾法(界限值5-10kD)或兩種方法除去低分子量成分。隨後，產物通過超濾法濃縮並冷凍乾燥以確保其穩定性。為了進一步純化變應原，將經冷凍乾燥的提取物再混懸於水溶液中並在50-100％的硫酸銨溶液中進行鹽析沉澱。將沉澱物再混懸於水中並通過Superdex 75的凝膠過濾色譜法進行分離。收集10-60kDa分子量範圍內的中間峰。該級分主要含有組1(25kDa)和組2(15kDa)主要變應原。最後收集到的級分被再次冷凍乾燥，用於被重建成適當的濃度與蛋白脂質體偶聯。
實施例2.蛋白脂質體的獲得它開始於腦膜炎奈瑟氏球菌B培養物。通過離心收穫生物質並使用洗滌劑，酶和超聲處理進行提取。通過離心除去細胞碎片，用核酸酶消化處理上清液以除去核酸。通過超速離心回收提取物，將其再混懸於洗滌劑溶液中，並通過分子分離色譜法除去其餘的低和中間分子量成分進行純化。所獲得的蛋白脂質體，含有被包埋入它們結構中的少於10％的核酸和大約10％的LPS；但是無游離形式。任選地，以蛋白脂質體含量的0.5到4倍的比例加入莢膜多糖，其來自Gold和Gotschlich(Gold等，1969-1970，WHO Bull.45279-282和Gotschlich等，1969，J.Exp.Med.1291349-1365)所述的腦膜炎奈瑟氏球菌血清組C。任選地，以蛋白脂質體量的10到25倍的比例加入氫氧化鋁作為附加的佐劑。保持最後的PH值在7,0±0,4。保證蛋白脂質體-多糖複合物在明礬凝膠上的吸附超過80％和LPS的含量低於6％。被包埋入蛋白脂質體中的LPS，允許對免疫系統足夠的呈遞以減少有害毒性反應的可能性。硫柳汞可作為防腐劑加入，達到0.005-0.02％的最後濃度。將最終所得到的產物進行生物學和物理化學質控分析。
實施例3.吸附到氫氧化鋁上的製劑變應原性(IgE結合活性)的測定表達為人體IgE抗體結合能力的的變應原性，可通過IgE-抑制ELISA測定。該測定法測定了樣品溶液抑制IgE與包被變應原的固相結合的能力。在這種情況中，所用的樣品製劑是根據實施例1純化的D.siboney變應原，與根據實施例2所得的蛋白脂質體混合，然後吸附到氫氧化鋁凝膠上。最初的Der s 1變應原濃度為4μg/mL，變應原活性為400BU/mL(BU根據第2版Nordic Guidelines for theRegistration of Allergenic Products的定義的生物學單位。在SkinPrick Test中10 000BU/mL等於10mg/mL鹽酸組胺。)根據下述步驟進行ELISA。用參比變應原提取物包被聚苯乙烯微量培養板。用PBS-BSA1％封閉非特異性結合位點。隨後，通過平行溫育血清與逐漸增加量的變應原樣品和參比物完成IgE血清混合物的抑制。通過包被在板上的變應原捕獲沒被抑制的IgE。在洗去非特異性結合抗體後，通過加入過氧化酶標記的抗IgE Mab，對結合到變應原上IgE進行檢測。在加入適當的顯色底物後，使用ELISA板讀器測定反應產物的顏色強度。用平行線統計方法進行結果的分析和說明。建立參比物和樣品抑制曲線，並進行線性回歸分析，以驗證每個樣品曲線和參比曲線之間的平行性。最後，通過平行線之間水平距離的反對數計算出相對效力。
通過對所給樣品的分析，得出如下結果變應原活性21.2BU/mL(IC95％ 13.6-32.4)。該值表示僅為水溶液中變應原的最初活性的5.3％。
實施例4.顯示總IgE的較少誘發的方案和劑量的確定。
對Balb/c小鼠在以下星期以Der s 1為1或5μg/鼠的濃度通過肌內途徑免疫接種變應原(Al)+明礬(A)兩次0和2(短期方案)或0和4(長期方案)，用於確定免疫方案(劑量間隔時間)和變應原濃度。在短期方案中，在0，2和5星期時對動物取血，在長期方案中在0，4和7星期時取血。通過ELISA測定血清混合物中總IgE水平。
如附圖1所示短期方案誘發的IgE應答顯著小於長期方案。另一方面，在所有方案中較低的變應原濃度(1μg)均不能誘發IgE。因為該原因，使用短期方案和大約1μg/鼠變應原劑量來進行下述實驗。
為了更精確地確定劑量，Balb/c小鼠在0和2星期時被再次通過肌內途徑免疫接種兩次，並在0和4星期時取血。組I用蛋白脂質體+血清組C腦膜炎奈瑟氏球菌多糖+Al(OH)3。組II，III和IV分別用Al(OH)3+如下劑量0,5；1,25或2,5μg/鼠的變應原。通過ELISA測定血清混合物中的總IgE水平。如附圖2所示在被評估任何一組中IgE均沒有顯著的增加。
實施例5.變應原的加入對蛋白脂質體-特異性應答的無影響和變應原特異性IgG亞類應答的調節Balb/c小鼠在0和2星期時通過肌內途徑免疫接種兩次，用於確定變應原對針對蛋白脂質體抗原應答的影響。組I用蛋白脂質體+多糖C+Al(OH)3(Va)。組II，III和IV分別用0,5，1,25和2,5μg/鼠的變應原+Va。在第一次免疫接種後的第0，15和35天時取血。通過ELISA測定蛋白脂質體和變應原特異性IgG亞類應答。如附圖3所示檢測到高IgG抗蛋白脂質體滴度，令人驚奇的是，變應原的加入並沒有產生任何影響。在IgG亞類應答(附圖4)中也沒有檢測到任何影響。高IgG2a滴定度是通過佐劑誘發的優先Th1應答的表示。附圖5顯示出不同變應原特異性IgG亞類的刺激。值得注意的是，在較低變應原濃度特別是1,25和0,5μg時，IgG2a水平的增加。對變應原IgG2a應答的誘發反映出佐劑能將Th2應答調節為Th1。
實施例6.用蛋白脂質體或變應原進行體外激發後的免疫接種的小鼠脾細胞的IFN-γ的產生和IL-5不產生。細胞因子產生與變應原特異性IgG亞類應答的關係。佐劑製劑之間的比較蛋白脂質體+多糖C+Al(OH)3和單獨的Al(OH)3。
Balb/c小鼠在0和2星期時免疫接種兩劑量，用於確定Th1(IFN-γ)和Th2(IL-5)細胞應答。組I用蛋白脂質體+多糖C+Al(OH)3(Va)。組II，III和IV分別用0,5，1,25和2,5μg/鼠的變應原+Va。組V首劑量用Va和第二劑量用0,5μg變應原+Va。在最後劑量的七天後將動物處死。通過常規技術取出並處理脾，在蛋白脂質體或變應原的存在下培養細胞。72小時後，收集培養物上清液並通過ELISA進行處理以測定IFN-γ和IL-5。
所有組中蛋白脂質體激發的細胞培養物誘發IFN-γ產生，與已知的通過該佐劑誘發的Th1模式相一致。然而，當用兩次變應原注射給藥時(組II)或使用Va的在先劑量和單一的變應原注射時(組V，附圖6)，在用0,5μg變應原劑量免疫接種的這些組中，IFN-γ產生令人驚奇的被加強。令人驚奇的是，所有組中的變應原激發也能誘發IFN-γ應答。意外的是，以0,5μg變應原免疫接種的組對於兩種變化情況的應答(variant)都比較高兩次變應原注射或具有在先Va給藥的僅一種變應原注射(附圖7)。蛋白脂質體或變應原激發後沒有檢測出IL-5應答。這些結果反映通過佐劑可將變應原-誘發的Th2模式調節為Th1模式.。
進行其它類似的實驗來確定變應原特異性IgG和IgG亞類抗體。通過上述相同的方案對小鼠免疫接種，但是僅使用吸附入Al(OH)3的變應原。在第一次接種後的第0，15和35天取血。通過ELISA評估血清IgG應答。與Al(OH)3相比，使用Va佐劑時變應原特異性IgG應答顯著的增高。令人驚奇的是，最低變應原劑量0.5和1,25μg的佐劑間的差異比較大。然而，對於兩種佐劑，用最高變應原劑量獲得最高的變應原特異性IgG應答(附圖8)。對於所有佐劑和組合的主要IgG亞類是IgG1。然而，用所有含Va的組合物誘發了IgG2a亞類，反之在兩個最高的變應原劑量(2.5和1,25μg)時用Al(OH)3僅獲得微小的陽性值。相反的，令人驚奇的是，在最低劑量變應原(0,5μg)時發現兩種佐劑間對於IgG2a應答的最大差異。在那種情況下，發現對於Al(OH)3是陰性，對於Va是陽性(附圖9)。
實施例7.變應原特異性IgE的誘發和功能的測定Balb/c小鼠在0和2星期時免疫接種兩次，用於測定變應原特異性IgE應答。組I用Al(OH)3。組II用蛋白脂質體+多糖C+Al(OH)3(Va)。組III和IV分別用1和5μg變應原+Al(OH)3。組V和VI用0,5；1,25和2,5μg變應原+Va。在第一次接種後的0、15和35天對動物取血。IgE應答通過在雄Wistar大鼠中進行被動皮內過敏反應(PCA)進行定性和半定量評估。應答變量通過時間和陽性血清稀釋度和斑點密度任意單位表示。
在0天(To)，第二次時(T15)和第二次14天後(T35)時提取血清。可以從表1中看出(PCA中反應斑點的強度和最終陽性血清稀釋度)，組V到VII(使用疫苗組合物時)的最終陽性稀釋度低於組III和IV(明礬)。兩者的光密度相同。這就表示變應原特應性IgE應答的大量減少。在陰性對照組(I和II)中沒有發現應答。
陰性對照組(I和II)中，應答值是負值。在組III中，在第35天觀察到陽性值，10660的強度，其在高達1∶16稀釋度時可檢測到。組IV，在第一次後(15天)稀釋至1∶8時獲得強度為9345的陽性值。在第35天，稀釋至1∶32時發現強度為39843的高效應答。相反，令人驚奇的是，用Va給藥的組，變應原特異性IgE應答非常的低，僅在第35天時顯示出低強度並且僅在低稀釋度時可檢測到。值得注意的是，對於最低變應原劑量(0,5μg)，僅在使用未稀釋的血清(1∶1)時可檢測到最小應答，當血清被稀釋至1∶2時就消失了(附圖10和表1)。這些結果顯示出使用最低變應原劑量時，Va佐劑相比較於Al(OH)3具有較低的IgE誘發，這與在先實施例的結果一致，其中總IgE較低和IFN-γ和IgG2a較高。
表1
圖例Al，Al(OH)3；P，蛋白脂質體；PC，腦膜炎奈瑟氏球菌血清組C的多糖；A，變應原和(*)第一次後的天數實施例8.變應原與蛋白脂質體的共價偶聯。
通過化學綴合的共價偶聯可以通過一些已知的方法進行，例如專利U.S 4.695.694和專利申請US SN 362,179；555,558；555,974；555,966和555,339中描述的方法。優選的方法使用同雙功能試劑如戊二醛和琥珀酸酐，其能通過游離氨基基團偶聯兩個分子。變應原蛋白和蛋白脂質體中可發現這些游離氨基，特別是賴氨酸殘基。另外，可以使用異雙功能試劑，優選N-羥基琥珀醯亞胺(Hydroxisuccinimide)-馬來醯亞胺酯(如MBS，MPS，SMPB，GMBS，EMCS)。這種情況中反應的進行，首先通過交聯劑與蛋白脂質體上可用的氨基偶聯，隨後通過交聯劑馬來醯亞胺基團與變應原分子上的游離巰基偶聯。如下描述了絲泊塵蟎(Dermatophagoides siboney)經純化的變應原與蛋白脂質體使用戊二醛法形成綴合物的例子，和用該綴合物對小鼠免疫接種被誘發應答的例子。
綴合根據實施例1的純化的變應原蛋白被加入pH7.0，200μg/mL蛋白脂質體PBS溶液中，最後的變應原濃度為20μg/mL。加入1體積0,4％的戊二醛，並搖蕩1小時。加入25mol/L甘氨酸(最終濃度)停止反應；隨後調pH至7.0-7.8。通過Sephadex G25柱的凝膠過濾除去沒有偶聯的戊二醛。為了進一步純化綴合物，除去殘留的游離變應原，產物通過事先加入去氧膽酸鈉洗滌劑至終濃度為1％的SephacrylS-300色譜柱。收集第一峰，其相當於基質排除體積。隨後通過PBS透析除去洗滌劑。得到的產物通過截留值為10 000Kda的膜超濾(Amicon，USA)濃縮10倍。通過變應原特異性單克隆抗體夾心酶聯免疫分析法(sandwich ELISA)測定綴合物中的Der s 1含量。通過PBS稀釋調節濃度至用於吸附過程的適當值10μg/mL。最後產物通過0.2μm膜過濾進行滅菌。
吸附過程將1.2mg/mL氫氧化鋁和待綴合的10μg/mL變應原溶液等體積混合於pH7.0的PBS中。在200rpm輕柔搖蕩混合物30分鐘。通過在280nm檢測上清液的吸光度檢驗蛋白與鋁凝膠的吸附，得到的值大於90％。
免疫接種三組Balb/C小鼠(每組7隻)分別用變應原的PBS溶液(″Ds″)，或變應原-蛋白脂質體綴合物的PBS溶液(″PLS-Ds″)，或氫氧化鋁中的變應原-蛋白脂質體綴合物(″[PLS-Ds]Alum″)兩劑量免疫接種。對於所有變化情況Der s 1變應原濃度是5μg/mL。在第0和4星期時通過腹腹內途徑注射給藥。在開始試驗時(0)和4和8星期時對小鼠取血。
結果通過ELISA測定總IgE和變應原特異性IgG，還有，IgG1，IgG2a和IgG2b亞類血清抗體。另外，通過在Wistar大鼠中的被動皮膚過敏反應法(PCA)測定變應原-特異性IgE應答。抗體應答的結果顯示於附圖11中。值得注意的是，一般而言，含有綴合物的變化情況誘發的IgG應答顯著高於單獨的變應原。這對於所有IgG亞類也是同樣有效的IgG1，IgG2a和IgG2b。然而，在含綴合物的PBS溶液變化情況中(即沒用氫氧化鋁凝膠)的總IgE應答比較低。另外，PCA結果顯示這些變化情況不會誘發任何可檢測到的變應原特異性應答(高於陰性對照)，然而所有游離的變應原和吸附到氫氧化鋁上的綴合物分別在稀釋至1∶1和1∶10時誘發可檢測到的應答。
實施例9.具有多種變應原的製劑在一個疫苗組合物中不同變應原的製劑可以通過非共價偶聯(通過混合或吸附入氫氧化鋁凝膠中)或實施例8所述的共價偶聯實現。在這種情況中，每個變應原分別與蛋白脂質體綴合，最後一起製劑。本實施例中公開了在來自不同蟎種的三種變應原的非共價製劑的製備，所述蟎種在熱帶區域非常普遍(房塵蟎、絲泊塵蟎和Blomia tropicalis)。
根據實施例1分別對所述蟎種進行製備。對於Blomia，使用整體冷凍乾燥的提取物，無需分離。使用Mab-ELISA測定Der p 1，Der s 1和Blo t 5主要變應原的含量。根據實施例3，使用IgE抑制ELISA測定總變應原活性。經冷凍乾燥的變應原以濃度為20μg/mL(對於Der p1和Der s 1)或10μg/ml(對於Blo t 5)的重懸於pH7.0的PBS，並且通過0.2μm膜過濾滅菌，使變應原活性達到4000BU/mL。蛋白脂質體以終濃度為200μg/mL分別被加入每個變應原中。將溶液在150rpm下輕柔攪拌勻化30分鐘。隨後，等體積的溶於pH7.0的PBS中的氫氧化鋁2mg/mL被加入每種變應原溶液中並混合，在150rpm下輕柔攪拌60分鐘。可以通過在280nm檢測上清液的吸光度來檢驗蛋白與鋁凝膠的吸附。最後，混合三種變應原產物並輕柔攪拌10分鐘。通過ELISA(INDOOR Biotech，UK)分析混懸液的上清液的Der p 1，Der s1和Blo t 5，和通過用於蛋白含量測定的羅氏蛋白定量法(Lowry method)，可以證明變應原和蛋白脂質體幾乎完全被吸附到凝膠上。根據實施例3測定殘留的變應原活性(沒被吸附的)。可以發現，超過90％的變應原被吸附和變應原活性的減少低於20％。
將兩份0.5mL劑量的製劑(總變應原含量3.33μg Der s 1和Der p 1，1.17μg Blo t 5)對Balb/c小鼠通過腹膜內途徑給藥，兩次給藥間間隔三星期。在免疫接種方案開始後的七星期，通過ELISA測定變應原特異性IgG抗體。可以發現，對所有變應原的平衡的抗體應答，分別對房塵蟎，絲泊塵蟎和Blomia tropicalis的比例為2∶2∶1。所檢測到的平均IgG水平比用PBS中變應原混合物免疫接種所得到的值高80％。


附圖1顯示了短期方案(0-14天)誘發的總IgE量少於長期方案(0-28天)。在短期方案中免疫接種後的第0，15和35天取血和長期方案中免疫接種後第第0，28和35天取血。Va蛋白脂質體+來自腦膜炎奈瑟氏球菌血清組C的多糖+Al(OH)3；A變應原；Al∶Al(OH)3.變應原劑量1和5μg/鼠。如其所示，在第二次注射後，長期方案中用5μg進行免疫接種的組的IgE應答高於短期方案。事實上，短期方案中具有相同濃度的組中的第二應答具有減少的傾向。
附圖2可以發現的是，什麼濃度的變應原可以產生總IgE的更少誘發。在免疫接種後的第0，15和35天取血。Va蛋白脂質體+來自腦膜炎奈瑟氏球菌血清組C的多糖+Al(OH)3；A變應原；Al∶Al(OH)3.變應原劑量0.5；1.25和2.5μg/鼠。值得注意的是，用0.5μg變應原劑量誘發的總IgE的量相似於佐劑對照組(Va)。其他兩種變應原濃度(1.25和2.5)不會增加總IgE水平。
附圖3顯示出包含多少變應原不會影響蛋白脂質體特異性IgG應答。在免疫接種後的第0，15和35天取血。Va蛋白脂質體+來自腦膜炎奈瑟氏球菌血清組C的多糖+Al(OH)3；A變應原；Al∶Al(OH)3.變應原劑量0.5；1.25和2.5μg/鼠。值得注意的是在疫苗組合物中包含在第一和第二劑量後不會影響對蛋白脂質體抗原的應答(與用沒有變應原的佐劑混合物(Va)給藥比較)。
附圖4可見包含變應原不會影響蛋白脂質體特異性IgG亞類應答。在免疫接種後的第0，15和35天取血。Va蛋白脂質體+來自腦膜炎奈瑟氏球菌血清組C的多糖+Al(OH)3；A變應原；Al∶Al(OH)3.變應原劑量0.5；1.25和2.5μg/鼠。用包括變應原的疫苗組合物免疫接種，其相比於單獨的佐劑混合物(Va)，保持不變的蛋白脂質體特異性IgG亞類模式。
附圖5顯示出低變應原濃度可以誘發多少變應原特異性IgG2a抗體。在免疫接種後的第0，15和35天取血。Va蛋白脂質體+來自腦膜炎奈瑟氏球菌血清組C的多糖+Al(OH)3；A變應原；Al∶Al(OH)3.變應原劑量0.5；1.25和2.5μg/鼠。兩個最低變應原濃度(0.5和1.25)誘發IgG2a應答。
附圖6涉及經蛋白脂質體-誘發的IFN-γ產生的測定。在第二次免疫接種(2星期)後的第7天提取脾細胞。Va蛋白脂質體+來自腦膜炎奈瑟氏球菌血清組C的多糖+Al(OH)3；A變應原；Al∶Al(OH)3.變應原劑量0.5；1.25和2.5μg/鼠。1Va+Va-A0,5首次用Va注射和第二劑量時用Va+0.5μg變應原。最低變應原濃度增加了蛋白脂質體-誘發的IFN-γ產生。
附圖7涉及經變應原-誘發的IFN-γ的測定和在先給藥的佐劑無影響。在第二次免疫接種(2星期)後的第7天提取脾細胞。Va蛋白脂質體+來自腦膜炎奈瑟氏球菌血清組C的多糖+Al(OH)3；A變應原；Al∶Al(OH)3.變應原劑量0.5；1.25和2.5μg/鼠。1Va+Va-A0,5最初用Va注射和第二劑量時用Va+0.5μg變應原。對於所有的變應原濃度均發現有經變應原-誘發的IFN-γ產生，但是在最低濃度值時更高。佐劑混合物的在先注射不會影響應答。
附圖8可見最低變應原劑量可以誘發疫苗組合物和氫氧化鋁之間變應原特異性IgG應答的顯著差異。在第二劑量後的第14天取血清。在第0和27天注射給藥。Va蛋白脂質體+來自腦膜炎奈瑟氏球菌血清組C的多糖+Al(OH)3；A變應原；Al∶Al(OH)3.變應原劑量0.5；1.25和2.5μg/鼠。可以發現的是，最低劑量(0.5和1.25)誘發的變應原特異性IgG應答顯著高於最高劑量誘發的。
附圖9涉及變應原特異性IgG2a的誘發。在第二劑量後的第14天取血清。在第0和27天注射給藥。Va蛋白脂質體+來自腦膜炎奈瑟氏球菌血清組C的多糖+Al(OH)3；A變應原；Al∶Al(OH)3.變應原劑量0.5；1.25和2.5μg/鼠。可以發現，所有含有Va的變化情況與僅包含明礬吸附的變應原的變化情況相比誘發的變應原特異性IgG2a應答更顯著。
附圖10其顯示了通過被動皮膚過敏反應測量，疫苗組合物組(組V到VII)與陽性對照組(組III和IV)相比變應原特應性IgE的減少。Va蛋白脂質體+來自腦膜炎奈瑟氏球菌血清組C的多糖+Al(OH)3；A變應原；Al∶Al(OH)3。在0天(To)，第二劑量期時的(T15)和第二劑量後的第14天(T35)時提取血清。組(V-VII)中的應答低於用明礬吸附的變應原免疫接種的組(III和IV)。在陰性對照組(I和II)中沒有發現應答。
圖例-，無；+，有；A，變應原；Va，蛋白脂質體+來自腦膜炎奈瑟氏球菌的多糖+氫氧化鋁；Al，氫氧化鋁。
附圖11.其涉及對變應原-蛋白脂質體綴合物的變應原特異性抗體應答。在不同變化情況中Ds(游離變應原)；Ds-PLS(與蛋白脂質體綴合)；[Ds-PLS]明礬(吸附到氫氧化鋁上的綴合物)，小鼠用5μg Ders 1免疫接種兩次。在第一次免疫接種後的8星期評估應答。豎條代表標準差。
權利要求
1.用於變應性疾病的疫苗組合物，含有a)來自革蘭氏陰性菌的蛋白脂質體，其能誘發細胞介導的Th1應答模式；b)一種或多種天然狀態或經修飾的變應原；和c)合適的佐劑。
2.根據權利要求1的疫苗組合物，其中所述的蛋白脂質體來自奈瑟氏球菌屬(Neisseria genus)的細菌。
3.根據權利要求2的疫苗組合物，其中所述的蛋白脂質體來自腦膜炎奈瑟氏球菌(Neisseria meningitidis)。
4.根據權利要求3的疫苗組合物，其中所述的蛋白脂質體來自腦膜炎奈瑟氏球菌B血清組。
5.根據權利要求1-4的疫苗組合物，其中所述的組合物每劑量含20到75μg的蛋白脂質體。
6.根據權利要求1的疫苗組合物，其中所述的變應原是能在人體或動物體內引起變應性敏化的肽、糖肽或多糖性質的。
7.根據權利要求6的疫苗組合物，其中所述的變應原來自家蟎。
8.根據權利要求7的疫苗組合物，其中所述的變應原來自表皮蟎屬(Dermatophagoides genus)的家蟎。
9.根據權利要求8的疫苗組合物，其中所述的變應原來自絲泊塵蟎(Dermatophagoides siboney)種的家蟎。
10.根據權利要求8和9的疫苗組合物，其中所述的主要變應原是組1(Der s1，Der p1，Der f1)變應原和組2(Der s2，Der p2，Der f2)變應原。
11.根據權利要求1-10的疫苗組合物，其中變應原與每10質量單位蛋白脂質體的比例為0.1到10，每劑量含0.25到7.5μg。
12.根據權利要求6所述的疫苗組合物，其中親脂性殘基與變應原共價偶聯。
13.根據權利要求12所述的疫苗組合物，其中所述的親脂性殘基是具有16到20個碳原子的兩性脂肪酸。
14.根據權利要求1所述的疫苗組合物，其中所述的佐劑選自氫氧化鋁和磷酸鋁。
15.根據權利要求14所述的疫苗組合物，其中所述的佐劑以與每質量單位蛋白脂質體10到25的比例加入，並且每劑量中其最終含量為250到1000μg。
16.根據權利要求1所述的疫苗組合物，其中所述的組合物還含有天然或合成的多糖。
17.根據權利要求16所述的疫苗組合物，其中所述的多糖來自奈瑟氏球菌屬。
18.根據權利要求17所述的疫苗組合物，其中所述的多糖來自腦膜炎奈瑟氏球菌種。
19.根據權利要求18所述的疫苗組合物，其中所述的多糖來自腦膜炎奈瑟氏球菌血清組C。
20.根據權利要求16-19所述的疫苗組合物，其中所述多糖以每質量單位蛋白脂質體0.5到4的比例加入。
21.權利要求1-13中任一項所述的疫苗組合物的製備方法，其中所述的表皮蟎屬的蟎變應原通過如下步驟製備和純化a)變應原提取物通過冷凍乾燥或超濾濃縮至蛋白濃度為10到100mg/mL；b)在50-100％硫酸銨溶液中沉澱和選擇沉澱物；c)通過使用如下基質之一Sephacryl S-100，Sephacryl S-200，Sephacryl S-300或Superdex 75的分子篩色譜法分部分離，選擇分子量為10-60kDa的級分；d)冷凍乾燥和超濾濃縮至蛋白濃度為10到100μg/mL；e)變應原與蛋白脂質體以每10質量單位的蛋白脂質體為0.1到1的偶聯比例偶聯；f)在60到600rpm攪拌30到90分鐘。g)加入選自氫氧化鋁和磷酸鋁的一種的佐劑，以每質量單位蛋白脂質體為2到6的比例；h)在60到600rpm下攪拌勻化混合物30到90分鐘。
22.根據權利要求21的方法，其中根據步驟(e)的變應原與蛋白脂質體的偶聯是共價或非共價偶聯。
23.根據權利要求21和22的方法，其中所述的方法還包括如下步驟a)以每質量單位蛋白脂質體0.5到4的比例加入多糖；b)在60到600rpm下攪拌勻化混合物30到90分鐘。
24.預防或治療變態反應的方法，包括使用根據權利要求1到20所述的疫苗組合物通過非胃腸道或黏膜途徑以2到4劑量的方案進行給藥，劑量間間隔期為2到6星期。
全文摘要
本發明涉及免疫學領域，免疫－變態反應和尤其是用於調節對變應原免疫應答的佐劑或載體的用途。本發明的目的是為了製備一種使用細菌蛋白脂質體的具有治療或預防作用的藥物製劑，其應用於變應性個體時能將Th2和IgE依賴性變應性應答轉換為保護性Th1應答；而且它還能阻止仍然為非變應性個體中變應性的出現和發展。該疫苗組合物含有與變應原偶聯的來自革蘭氏陰性菌的蛋白脂質體和任選的含有其他佐劑或抗原。本發明還涉及製備創造性疫苗組合物方法以及用所述疫苗組合物的兩劑量的免疫接種方案。
文檔編號A61K39/35GK1658900SQ03813167
公開日2005年8月24日 申請日期2003年5月8日 優先權日2002年5月8日
發明者M·D·S·J·拉斯特岡薩雷斯, 馬丁 O·G·佩雷斯, 羅薩多 A·萊伯瑞達, 馬丁奈茲 I·比多特, 坎伯 艾隆索 J·M·德爾, 拉斯特 D·A·佩雷斯, 拉莫斯 E·菲森達, 維格尼爾 C·扎亞斯, 馬丁奈茲 C·羅德裡格斯, 岡薩雷斯 V·G·希爾拉, 拉斯特 J·E·佩雷斯, 戈瑞納達 G·R·布拉喬 申請人:血清疫苗研究生產中心芬雷學院, 國家生物醫學中心