快速分離、篩選貝類微衛星標記的方法
2023-05-28 13:14:51
專利名稱：快速分離、篩選貝類微衛星標記的方法
技術領域：
本發明屬於貝類DNA分子遺傳標記技術，具體涉及一種快速分離、篩選貝類微衛星標記的技術方法。
背景技術：
近年來飛速發展的分子標記技術，尤其是以PCR為基礎的分子標記的廣泛應用，為個體的遺傳特徵和種群遺傳結構等分子遺傳學研究提供了有力的工具，其中具有代表性的標記系統——微衛星標記越來越受到青睞。微衛星(Microsatellite)，亦稱簡單串聯重複序列(Simple Sequence Repeats，SSRs)，是指以少數幾個核苷酸(多數為1～6個)為單位多次串聯重複的DNA序列。由於微衛星DNA廣泛存在於基因組中，並且極具多態性、穩定性高、特異性高、共顯性遺傳、檢測快捷，引物序列公開發表，易於在各個實驗室之間共用等優點，因此廣泛地用於遺傳疾病的診斷、遺傳連鎖圖的構建、基因的定位與克隆、親權分析、群體遺傳多樣性研究、種質鑑定、進化生物學研究等領域。
微衛星標記的應用一般需要經過以下四步1)獲得微衛星序列，2)微衛星引物的設計與優化，3)PCR擴增目的DNA，4)用適當的手段檢測擴增產物。其中第一步是限速步驟，同時也是最為複雜、最為耗時費力的步驟。自20世紀80年代中期微衛星標記開始受到廣泛關注以來，人們大多採用傳統的構建小型DNA文庫、利用SSR探針篩選陽性克隆的方法。但這種方法效率較為低下，尤其是在微衛星含量不是很豐富的物種，這種現象表現的尤為明顯。統計表明，在貝類中利用上述篩選方式得到的陽性克隆率僅為0.1～6.4％，平均1.96％。因此，傳統的篩選方式造成了人力和物力的極大浪費。近年來，隨著計算機和信息網絡的發展，從公用資料庫發表的序列中篩選微衛星DNA成為簡單廉價的方式，但是大多數物種，尤其是研究起步較晚的海洋和水產生物，在公用資料庫中的序列信息不足以滿足篩選的需要或者根本沒有任何序列信息。
不同的篩選方式以及其效率成為學者們關注和研究的熱點，不同的學者亦試用不同的篩選力法和策略以提高篩選效率，國內外不同的學者和實驗室也相繼報導了包括雜交篩選法(Hybridization Selection)、FIASCO(Fast Isolation by AFLP of SequencesContaining Repeats)法和RAPD—微衛星探針Southern雜交法等方法，但在貝類應用中都存在著共同的缺點陽性克隆率較低，效率較為低下。本發明富集文庫—菌落原位雜交快速分離、篩選貝類微衛星標記的方法多種貝類應用時發現，穩定性和重複性極好，並且陽性克隆率可以達到100％，一次篩選可以獲得上百甚至幾百個位點。
發明內容
本發明的目的是提供一種快速快速分離、篩選貝類微衛星標記的方法，以彌補已有技術的不足。
本發明是按照以下步驟完成的1)提取貝類的基因組DNA，4℃冰箱保存備用；2)利用上述提取的DNA，用已有的AFLP方法或者限制性內切酶方法獲得貝類基因組DNA片斷，並構建富集文庫；3)將富集文庫中的含有插入片斷的大腸桿菌菌落原位雜交，然後放射自顯影確定陽性克隆；4)陽性克隆測序並根據微衛星側翼序列設計引物擴增基因組DNA。
本方法可靠性和重複性極好，並且陽性克隆率可以達到100％，一次篩選可以獲得上百甚至幾百個位點，可以在一周之內獲得大量微衛星標記的有效的技術方法。
圖1富集文庫—菌落原位雜交快速分離、篩選貝類微衛星標記的技術方法的流程及原理示意圖。
圖2菌落原位雜交結果示圖。其中黑色斑點為陽性克隆放射自顯影留下的印記。
具體實施例方式1、提取貝類的基因組DNA，方法如下貝樣活體解剖後取閉殼肌約0.1克，加入500μl STE裂解緩衝液(NaCl100mM；EDTA1mM，PH＝8.0；Tris-HCl，10mM，PH＝8.0)，剪碎，再加入50μl SDS(10％)，以及5μl的蛋白酶K(20mg/ml)，56℃處理，直到裂解液澄清。加入等體積飽和酚(250μl)、氯方/異戊醇(24∶1)(250μl)，抽提3次。取上清液，加入等體積氯仿/異戊醇(500μl)抽提1次。取上清液，加入50μl NaAc(3M)，緩慢搖勻，加滿冰無水乙醇，12000轉離心10min。將核酸沉澱於管底。70％7醇(1000μl)洗滌沉澱並乾燥直到乙醇全部揮發。加入100μl的無菌水和少量RNase A，4℃冰箱保存。
2、富集文庫的構建，方法如下
1)貝類基因組DNA片斷獲得。在構建富集文庫時，貝類基因組DNA片斷的獲得可分別採用以下兩種方法①AFLP片斷的獲得AFLP分析參考Vos等(1995)的方法。引物和接頭由上海Sangon合成。EcoR I和Mse I各一個單位完全雙酶切300ng基因組DNA，T4連接酶將酶切片段連上接頭。PCR反應總體積為50μl，內含5μl連接產物，0.2mmol/L的引物(EOO，序列為5』-GACTGCGTACCAATTC-3』；MOO序列為5』-GATGAGTCCTGAGTAA-3』)，200mmol/L的dNTPs，200mmol/L的Mg2+，1×PCR反應緩衝液，2.5U的Taq DNA聚合酶。PCR反應為25個循環，每個循環包括95℃變性30s，56℃退火30s，72℃延伸1min；最後一次循環結束後72℃再延伸5min。PCR結束後，10個PCR反應產物混合乙醇沉澱，加入20uL三蒸水，95℃變性5分鐘待用。
亦可用以下方式獲得貝類基因組DNA片斷，即②限制性酶切片斷的獲得(以HaeIII為例，可根據基因組特點選擇其它四鹼基平端限制性內切酶)，具體方法為取約300ng櫛孔扇貝總DNA，在20μl體系中用2個單位的限制性內切酶HaeIII酶切3個小時。酶切後T4連接酶連上接頭，連接反應為30μl，其中含有酶切產物20μ1，接頭(接頭組成為21-mer5』-CTCTTGCTTGAATTCGGACTA-3』和25-mer5』-pTAGTCCGAATTCAAGCAAGAGCACA-3』)50ng，1×T4連接緩衝液，T4連接酶2U，反應在16℃下反應12小時。連有接頭的DNA經PCR擴增獲得多個拷貝，PCR反應總體積為25μl，其中含有DNA片斷的連接產物6μl，1μM的21-mer引物，200mmol/L的Mg2+，1×PCR反應緩衝液，1U的Taq DNA聚合酶。PCR反應為25個循環，每個循環包括95℃變性30s，55℃退火45s，72℃延伸1min；首次循環前預變性3min；最後一次循環結束後72℃再延伸5min。PCR結束後，10個反應體系混合乙醇沉澱，加入20μl三蒸水，95度變性5分鐘待用。
2)基因組片斷的富集。①雜交膜的準備取濃度為100μM的探針[以(GA)20和(CA)20為例]各0.5μl點在直徑約為5mm的Hybond N+雜交膜上，空氣中晾乾後80℃烘烤2個小時固定探針。將固定好探針的Hybond N+膜放在雜交液[50％(V/V)的甲醯胺、7％(W/V)的SDS、5×SSC、50mM的磷酸鈉(pH＝7.0)]中37℃預雜交72小時。然後將膜在1％的SDS中沸浴10min，去除沒有結合好的探針。②雜交將變性好的基因組DNA片斷加入到600μl的雜交液中，加入預雜交好的Hybond N+膜，37℃雜交1-2天。③洗脫洗膜採用如下嚴謹度用600μl的2×SSC，1％SDS(W/V)洗脫液在60℃下水浴下洗脫2次，每次15分鐘；用600uL的2×SSC，1％SDS(W/V)洗脫液在62℃下水浴30分鐘；用500μl的0.5×SSC，1％SDS(W/V)洗脫液在65℃下水浴30分鐘洗脫雜交片斷。將500μl的洗脫液中加入100μl的7.5M NH4Ac和600μl的異丙醇，-20℃冷凍2個小時以上(或者過夜)，4℃12,000轉離心20分鐘，將沉澱用-20℃預冷的75％乙醇洗2次，溶於20μl的三蒸水。
3)富集產物的克隆取洗脫片斷溶液2μl作為恢復PCR(Recovery PCR)的模板，反應為20個循環，最後72℃延伸30分鐘，其它PCR反應成分和條件同3.1)①和3.1)②。反應結束後乙醇沉澱，三蒸水溶解。富集DNA片斷的克降採用Takara公司的pMD18-T載體試劑盒，連接反應參照Takara公司pMD18-T載體試劑盒說明。將連接好的產物轉化至大腸桿菌DH5a菌株中，塗於含有X-gal的固體LB平板上。
3、菌落原位雜交篩選陽性克隆的方法為1)菌落重排與轉膜將轉化後的白斑重新挑起，有序的重排接種至新的固體LB培養基上，37℃培養至合適大小。培養好菌落轉至NC膜上(Immobilon-NC TransferMembranes，Millipore)，然後膜在空氣中乾燥10分鐘。然後NC膜放入變性緩衝液(0.5M NaOH，1.5M NaCl)中變性7分鐘，空氣乾燥10分鐘。中和緩衝液(0.5M Tris-HCl，pH 7.2；1.5M NaCl；1mM EDTA，，pH 8.0)中和2次，每次5分鐘。將中和好的NC膜空氣乾燥後放入80℃烘烤2小時固定質粒。
2)探針的標記探針的標記採用Amersham公司的Gene Images 3』-OligolabellingModule試劑盒。標記反應在37℃下標記70分鐘，80uL反應體系中含有100μM的探針1μl，Fluorescein-11-dUTP 5μl，1×緩衝液(Cacodylate Buffer)，32U的末端轉移酶(Terminal Transferase)。標記好的探針放入-20℃冰箱中備用。
3)雜交雜交系統採用Amersham公司的Gene Images ECL Detection Kit試劑盒。將烘烤好的NC膜放入雜交液[5×SSC，0.1％(W/V)SDS，稀釋20倍的液體封阻(Liquid Block，試劑盒提供)，0.5％(W/V)分子量為500000的多聚硫酸葡聚糖(Dextran Sulphate，MW 500000)]中預雜交1小時。然後將雜交液去除，加入足量的雜交液和標記好的探針，使雜交液的量為0.125-0.25mL/cm2，探針的濃度為5-10ng/mL，37度振蕩雜交過夜。
4)洗脫將雜交過夜的NC膜放在5×SSC，0.5％ SDS的洗脫液中室溫振蕩洗脫2次，每次5分鐘。然後在含有1×SSC，0.5％ SDS的洗脫液中37℃振蕩洗脫15分鐘，含有1×SSC，0.5％ SDS的洗脫液中42℃振蕩洗脫15分鐘。
5)抗體—抗原反應於放射自顯影將膜放入到含有稀釋20倍的液體封阻中封阻至少30分鐘，然後將膜放入到抗體液中反應30分鐘，抗體液含有1000倍稀釋的抗體(試劑盒提供)，0.5％(W/V)小牛血清，0.4M NaCl，0.1M Tirs-HCl(pH＝7.5)。處理完NC膜後，在暗室中壓上X-膠片，感光1h，進行顯影及定影。
6)陽性克隆的確定以及陽性克隆的測序按照原先確定的方位，將X—膠片、硝酸纖維素膜、平板三者進行對照，在相同的位置上挑出陽性克隆，搖菌送商業公司用M13引物測序。
4、在測序的基礎上，利用微衛星DNA兩側的序列的保守性設計特異性引物，用於擴增該位點的微衛星片斷。引物設計採用軟體Primer Premier 5.0和Oligo 6.44，引物設計採用以下嚴謹度(1)引物長度為19-25mer；(2)GC含量40％-60％；(3)退火溫度45-65度；(4)預期PCR產物長度為100-250bp。
下面以櫛孔扇貝為例通過實施例詳細敘述本發明1、DNA的提取取櫛孔扇貝閉殼肌約0.1克，加入500μlSTE裂解緩衝液(NaCl100mM；EDTA1mM，PH＝8.0；Tris-Cl，10mM，PH＝8.0)，剪碎，再加入50μl 10％的SDS(10％)，以及5μl 20mg/ml的蛋白酶K，56度處理，直到裂解液澄清。加入等體積飽和酚(250μl)、氯仿/異戊醇(24∶1)(250μl)，抽提3次。取上清液，加入等體積氯仿/異戊醇(500μl)抽提1次。取上清液，加入50μl NaAc(3M)，緩慢搖勻，加滿冰無水乙醇，12000轉離心10分鐘。將核酸沉澱於管底。70％乙醇(1000μl)洗滌沉澱並乾燥直到乙醇全部揮發。加入100μl的無菌水和少量RNase A，4度直到DNA全部溶解，紫外分光光度計定量備用。
2.富集文庫的構建對於富集文庫的構建，本發明敘述2種不同的方法AFLP片斷富集文庫和Hae III限制性酶切片斷富集文庫。
(1)AFLP片斷的獲得AFLP分析參考Vos等(1995)的方法。引物和接頭由上海Sangon合成。EcoR I和Mse I各一個單位完全雙酶切300ng基因組DNA，T4連接酶將酶切片段連上接頭。PCR反應總體積為50μl，內含5μl連接產物，0.2mmol/L的引物(EOO和MOO)，200mmol/L的dNTPs，200mmol/L的Mg2+，1×PCR反應緩衝液，2.5U的Taq DNA聚合酶。PCR反應為25個循環，每個循環包括95℃變性30s，56℃退火30s，72℃延伸1min；最後次循環結束後72℃再延伸5min。PCR結束後10個反應體系混合乙醇沉澱，加入20μl三蒸水，95℃變性5分鐘待用。
(2)限制性酶切片斷的獲得取約300ng櫛孔扇貝總DNA，在20μl體系中用2個單位的限制性內切酶HaeIII酶切3個小時。酶切後T4連接酶連上接頭，連接反應為30μl，其中含有酶切產物20μl，接頭(接頭組成為21-mer5』-CTCTTGCTTGAATTCGGACTA-3』和5』磷酸化的25-mer5』-pTAGTCCGAATTCAAGCAAGAGCACA-3』)50ng，1×T4連接緩衝液，T4連接酶2U，反應在16℃下反應12小時。連有接頭的DNA經PCR擴增獲得多個拷貝，PCR反應總體積為25μl，其中含有DNA片斷的連接產物6μl，1μM的21-mer引物，200mmol/L的Mg2+，1×PCR反應緩衝液，1U的Taq DNA聚合酶。PCR反應為25個循環，每個循環包括95℃變性30s，55℃退火45s，72℃延伸1min；首次循環前預變性3min；最後一次循環結束後72℃再延伸5min。PCR結束後，10個反應體系混合乙醇沉澱，加入20μl三蒸水，95℃變性5分鐘待用。
(3)Hybond N+膜的製備取濃度為100μM的探針(GA)20和(CA)20各0.5μl點在直徑約為5mm的Hybond N+雜交膜上，空氣中晾乾後80℃烘烤2個小時固定探針。
(4)預雜交將固定好探針的Hybond N+膜放在雜交液[50％(V/V)的甲醯胺、7％(W/V)的SDS、5×SSC、50mM的磷酸鈉(pH＝7.0)]中37℃預雜交3天。然後將膜在1％的SDS中沸浴10min，去除沒有結合好的探針。
(5)雜交和洗膜將變性好的PCR產物加到600μl的雜交液中，加入預雜交好的Hybond N+膜，37℃雜交1-2天。洗膜採用如下嚴謹度1)用600μl的2×SSC，1％SDS(W/V)洗脫液在60℃下洗脫2次，每次15分鐘；2)用600μl的2×SSC，1％SDS(W/V)洗脫液在62℃下水浴30分鐘；3)用500μl的0.5×SSC，1％SDS(W/V)洗脫液在65℃下水浴30分鐘洗脫雜交片斷。將500μl的洗脫液中加入100μl的7.5M NH4Ac和600μl的異丙醇，-20℃冷凍2個小時以上(或者過夜)，4℃12,000轉離心20分鐘，將沉澱用—20℃預冷的75％乙醇洗2次，溶於20μl的三蒸水。
(6)克隆富集片度取洗脫片斷溶液2μl作為恢復PCR(Recovery PGR)的模板，反應為20個循環，最後72℃延伸30分鐘。反應結束後乙醇沉澱，三蒸水溶解。富集DNA片斷的克隆採用Takara公司的pMD18-T載體試劑盒，連接反應參照Takara公司pMD18-T載體試劑盒說明。將連接好的產物轉化至大腸桿菌DH5a菌株中，塗於含有X-gal的固體LB平板上。
3菌落原位雜交(1)菌落轉膜將轉化後的白斑重新挑起，有序的重排接種至新的固體LB培養基上，37℃培養至合適大小。培養好菌落轉至NC膜上(Immobilon-NC Transfer Membranes，Millipore)，然後膜在空氣中乾燥10分鐘。然後NC膜放入變性緩衝液(0.5M NaOH，1.5M NaCl)中變性7分鐘，空氣乾燥10分鐘。中和緩衝液(0.5M Tris-HCl，pH 7.2；1.5M NaCl；1mM EDTA，，pH 8.0)中和2次，每次5分鐘。將中和好的NC膜空氣乾燥後放入80℃烘烤2小時固定質粒。
(2)探針的標記探針的標記採用Amersham公司的Gene Images 3』-Oligolabelling Module試劑盒。標記反應在37℃下標記70分鐘，80μl反應體系中含有100μM的探針1μl，Fluorescein-11-dUTP 5μl，1×緩衝液(Cacodylate Buffer)，32U的末端轉移酶(Terminal Transferase)。標記好的探針放入-20℃冰箱中備用。
(3)雜交雜交系統採用Amersham公司的Gene Images ECL Detection Kit試劑盒。將烘烤好的NC膜放入雜交液[5×SSC，0.1％(W/V)SDS，稀釋20倍的液體封阻(Liquid Block，試劑盒提供)，0.5％(W/V)分子量為500,000的多聚硫酸葡聚糖(Dextran Sulphate，MW 500,000)]中預雜交1小時。然後將雜交液去除，加入足量的雜交液和標記好的探針，使雜交液的量為0.125-0.25mL/cm2，探針的濃度為5-10ng/mL，37度振蕩雜交過夜。
(4)洗膜將雜交過夜的NC膜放在5×SSC，0.5％ SDS的洗脫液中室溫振蕩洗脫2次，每次5分鐘。然後在含有1×SSC，0.5％ SDS的洗脫液中37℃振蕩洗脫15分鐘，含有1×SSC，0.5％ SDS的洗脫液中42℃振蕩洗脫15分鐘。
(5)抗體抗原反應及X—射線自顯影將膜放入到含有稀釋20倍的液體封阻中封阻至少30分鐘，然後將膜放入到抗體液中反應30分鐘，抗體液含有1000倍稀釋的抗體(試劑盒提供)，0.5％(W/V)小牛血清，0.4M NaCl，0.1M Tirs-HCl(pH＝7.5)。處理完NC膜後，在暗室中壓上X-膠片，感光1h，進行顯影及定影。
(6)陽性克隆的挑選按照原先確定的方位，將X—膠片、硝酸纖維素膜、平板三者進行對照，在相同的位置上挑出陽性克隆，搖菌提取質粒測序。
4、陽性克隆測序將陽性克隆用液體LB培養基搖起後送商業公司用M13引物測定序列5、引物設計在測序的基礎上，利用微衛星DNA兩側的序列的保守性設計特異性引物，用於擴增該位點的微衛星片斷。引物設計採用軟體Primer Premier 5.0和Oligo 6.44，引物設計採用以下嚴謹度(1)引物長度為19-25mer；(2)GC含量40％-60％；(3)退火溫度45-65度；(4)預期PCR產物長度為100-250bp。
通過上述方法，一次共獲得櫛孔扇貝的陽性克隆324個，測序結果顯示全部324個陽性克隆全部含有微衛星重複，其中286個克隆可以設計引物。因此，充分驗證了本方法能快速分離、篩選貝類微衛星標記，即可以實現在短時間內獲得大量微衛星標記的快速有效的方法。
權利要求
1.快速分離、篩選貝類微衛星標記的方法，其特徵在於操作步驟1)提取貝類的基因組DNA 4℃冰箱保存備用；2)富集文庫的構建；3)菌落原位雜交；4)陽性克隆測序並根據微衛星側翼序列設計引物擴增基因組DNA。
2.根據權利要求1所述的富集文庫-菌落原位雜交快速分離、篩選貝類微衛星標記的技術方法，其特徵在於提取貝類的基因組DNA，步驟為貝樣活體解剖後取閉殼肌約0.1克，加入500μl STE裂解緩衝液(NaCl100mM；EDTA1mM，PH＝8.0；Tris-HCl，10mM，PH＝8.0)，剪碎，再加入50μl SDS(10％)，以及5μl的蛋白酶K(20mg/ml)，56℃處理，直到裂解液澄清。加入等體積飽和酚(250μl)、氯仿/異戊醇(24∶1)(250μl)，抽提3次。取上清液，加入等體積氯仿/異戊醇(500μl)抽提1次。取上清液，加入50μl NaAc(3M)，緩慢搖勻，加滿冰無水乙醇，12000轉離心10min。將核酸沉澱於管底。70％乙醇(1000μl)洗滌沉澱並乾燥直到乙醇全部揮發。加入100μl的無菌水和少量RNase A，4℃冰箱保存。
3.根據權利要求1所述的快速分離、篩選貝類微衛星標記的技術方法，其特徵在於富集文庫的構建。1)貝類基因組DNA片斷獲得在構建富集文庫時，AFLP片斷獲得的方法為EcoRI和Mse I各一個單位完全雙酶切300ng基因組DNA，T4連接酶將酶切片段連上接頭。PCR反應總體積為50μl，內含5μl連接產物，0.2mmol/L的引物(E00，序列為GACTGCGTACCAATTC；M00序列為GATGAGTCCTGAGTAA)，200mmol/L的dNTPs，200mmol/L的Mg2+，1×PCR反應緩衝液，2.5U的Taq DNA聚合酶；PCR反應為25個循環，每個循環包括95℃變性30s，56℃退火30s，72℃延伸1min；最後一次循環結束後72℃再延伸5min；PCR反應結束後，10個PCR反應產物混合乙醇沉澱，加入20μl三蒸水，95℃變性5分鐘待用。2)如權利要求3所述的貝類基因組DNA片斷獲得，限制性酶切片斷的獲得的方法為取約300ng櫛孔扇貝總DNA，在20μl體系中用2個單位的限制性內切酶HaeIII酶切3個小時。酶切後T4連接酶連上接頭，連接反應為30μl，其中含有酶切產物20μl，接頭(接頭組成為21-mer5』-CTCTTGCTTGAATTCGGACTA和5』磷酸化的25-mer5』-pTAGTCCGAATTCAAGCAAGAGCACA)50ng，1×T4連接緩衝液，T4連接酶6Weiss U，反應在16℃下反應12小時。連有接頭的DNA經PCR擴增獲得多個拷貝，PCR反應總體積為25μl，其中含有DNA片斷的連接產物6μl，1mM的21-mer引物，200mmol/L的Mg2+，1×PCR反應緩衝液，1U的Taq DNA聚合酶。PCR反應為25個循環，每個循環包括95℃變性30s，55℃退火45s，72℃延伸1min；首次循環前預變性3min；最後一次循環結束後72℃再延伸5min。PCR結束後，10個反應體系混合乙醇沉澱，加入20μl三蒸水，95度變性5分鐘待用。3)基因組片斷的富集。①雜交膜的準備取濃度為100mM的探針(GA)20和(CA)20各0.5μl點在直徑約為5mm的Hybond N+雜交膜上，空氣中晾乾後80℃烘烤2個小時固定探針。將固定好探針的Hybond N+膜放在雜交液[50％(V/V)的甲醯胺、7％(W/V)的SDS、5×SSC、50mM的磷酸鈉(pH＝7.0)]中37℃預雜交72小時。然後將膜在1％的SDS中沸浴10分鐘，去除沒有結合好的探針。②雜交將變性好的基因組DNA片斷加入到600μl的雜交液中，加入預雜交好的Hybond N+膜，37℃雜交1-2天。③洗脫洗膜採用如下嚴謹度用600μl的2×SSC，1％SDS(W/V)洗脫液在60℃下水浴下洗脫2次，每次15分鐘；用600μl的2×SSC，1％SDS(W/V)洗脫液在62℃下水浴30分鐘；用500μl的0.5×SSC，1％SDS(W/V)洗脫液在65℃下水浴30分鐘洗脫雜交片斷。再將500μ1的洗脫液中加入100μl的7.5M NH4Ac和600μl的異丙醇，-20℃冷凍2個小時以上，4℃12,000轉離心20分鐘，將沉澱用-20℃預冷的75％乙醇洗2次，溶於20μl的三蒸水；4)富集產物的克隆取洗脫片斷溶液2μl作為恢復PCR(Recovery PCR)的模板，反應為20個循環，最後72℃延伸30分鐘；PCR反應結束後乙醇沉澱，三蒸水溶解。富集DNA片斷的克隆T載體。將連接好的產物轉化至大腸桿菌DH5a菌株中，塗於含有X-gal的固體LA平板上。
4.根據權利要求1所述的快速分離、篩選貝類微衛星標記的方法，其特徵在於菌落原位雜交篩選陽性克隆的步驟如下1)菌落重排與轉膜將轉化後的白斑重新挑起，有序的重排接種至新的固體LB培養基上，37℃培養；培養好菌落轉至硝酸纖維素膜上，然後膜在空氣中乾燥10分鐘。然後硝酸纖維素膜放入變性緩衝液(0.5M NaOH，1.5M NaCl)中變性7分鐘，空氣乾燥10分鐘。中和緩衝液(0.5M Tris-HCl，pH 7.2；1.5M NaCl；1mM EDTA，，pH 8.0)中和2次，每次5分鐘。將中和好的硝酸纖維素膜空氣乾燥後放入80℃烘烤2小時固定。2)探針的標記探針的標記採用Amersham公司的Gene Images 3』-Oligolabelling試劑盒。標記反應在37℃下標記70分鐘，80μl反應體系中含有100mM的探針1μl，Fluorescein-11-dUTP 5μl，1×緩衝液(Cacodylate Buffer)，32U的末端轉移酶(Terminal Transferase)。標記好的探針放入-20℃冰箱中備用。3)雜交雜交系統採用Amersham公司的Gene Images ECL Detection試劑盒。將烘烤好的硝酸纖維素膜放入雜交液[5×SSC，0.1％(W/V)SDS，稀釋20倍的封阻液，0.5％(W/V)的多聚硫酸葡聚糖]中預雜交1小時。然後將雜交液去除，加入足量的雜交液和標記好的探針，使雜交液的量為0.125-0.25mL/cm2，探針的濃度為5-10ng/mL，37度振蕩雜交過夜。4)洗脫將雜交過夜的硝酸纖維素膜放在5×SSC，0.5％SDS的洗脫液中室溫振蕩洗脫2次，每次5分鐘。然後在含有1×SSC，0.5％SDS的洗脫液中37℃振蕩洗脫15分鐘，含有1×SSC，0.5％SDS的洗脫液中42℃振蕩洗脫15分鐘。5)抗體-抗原反應於放射自顯影將膜放入到抗體液中反應30分鐘後，在暗室中壓上X光膠片，感光1小時後顯影及定影。6)陽性克隆的確定以及陽性克隆的測序按照原先確定的方位，將X-膠片、硝酸纖維素膜、平板三者進行對照，在相同的位置上挑出陽性克隆，用M13引物測序。
5.根據權利要求1所述的快速分離、篩選貝類微衛星標記的方法，其特徵在於在測序的基礎上，利用微衛星DNA兩側的序列的保守性設計特異性引物，用於擴增該位點的微衛星片斷。引物設計採用軟體Primer Premier 5.0和Oligo 6.44，引物設計採用以下嚴謹度(1)引物長度為19-25mer；(2)GC含量40％-60％；(3)退火溫度45-65度；(4)預期PCR產物長度為100-250bp。
全文摘要
本發明涉及一種快速分離、篩選貝類微衛星標記的方法，首先提取貝類的基因組DNA，4℃冰箱保存備用；然後利用上述提取的DNA，用已有的AFLP方法或者限制性內切酶方法獲得貝類基因組DNA片斷，並構建富集文庫；接著將富集文庫中的含有插入片斷的大腸桿菌菌落原位雜交，然後放射自顯影確定陽性克隆；最後陽性克隆測序並根據微衛星側翼序列設計引物擴增基因組DNA。本方法可靠性和重複性極好，並且陽性克隆率可以達到100％，一次篩選可以獲得上百甚至幾百個位點，可以在一周之內獲得大量微衛星標記的有效的技術方法。
文檔編號C12N15/12GK1793357SQ20051004479
公開日2006年6月28日 申請日期2005年9月23日 優先權日2005年9月23日
發明者胡景傑, 包振民, 汪小龍, 戰愛斌, 惠敏, 陸維 申請人:中國海洋大學