變形鏈球菌葡糖基轉移酶過度表達株及其構建方法
2023-05-28 13:28:01
專利名稱：變形鏈球菌葡糖基轉移酶過度表達株及其構建方法
技術領域：
本發明屬於口腔預防醫學領域，尤其涉及一種變形鏈球菌葡糖基轉移酶過度表達株，還涉及一種變形鏈球菌葡糖基轉移酶過度表達株的構建方法。
背景技術：
齲病是危害人類健康的第三大疾病，目前已公認變形鏈球菌(Streptococcus mutans，以下稱變鏈菌)是最重要的致齲菌。在變鏈菌致齲毒力因子中，葡糖基轉移酶(glucosyltransferase，GTase)倍受關注。
變鏈菌含有三種GTase①葡糖基轉移酶-I(GTase-I)，又稱為細胞吸附型GTase(CAGTase)，主要以細胞結合的形式存在於細菌表面，僅合成非水溶性葡聚糖；②葡糖基轉移酶-SI(GTase-SI)，既能合成非水溶性葡聚糖又能合成水溶性葡聚糖；③葡糖基轉移酶-S(GTase-S)，僅能合成水溶性葡聚糖。變鏈菌葡糖基轉移酶通過合成葡聚糖，特別是非水溶性葡聚糖，在以下幾方面發揮致齲作用1.介導變鏈菌緊密地粘附於牙面；2.葡聚糖作為基質形成緻密的菌斑，使細菌所產生的酸不易擴散而較長時間儲留於牙面；3.菌斑「飢餓」時，為細菌的生存提供能量來源。
編碼葡糖基轉移酶-I(GTase-I)、葡糖基轉移酶-SI(GTase-SI)、葡糖基轉移酶-S(GTase-S)的基因分別是gtfB、gtfC、gtfD，已被克隆及測序。葡糖基轉移酶-I(GTase-I)與葡糖基轉移酶-SI(GTase-SI)的胺基酸序列高度同源，且抗葡糖基轉移酶-I(GTase-I)的多克隆抗體不能區分gtfB和gtfC的基因產物。
齲病被認為是人類最普遍的感染性疾病。關於免疫防齲的研究已有近30年歷史。近來的研究表明，利用致齲菌毒力因子製備疫苗是預防齲病的有效手段。用提純的細胞吸附型葡糖基轉移酶(CAGTase)免疫雞，將所獲得的抗細胞吸附型葡糖基轉移酶(CAGTase)抗體用於被動免疫獲得了明顯的抗齲效果。但由於變形鏈球菌所含細胞吸附型葡糖基轉移酶(CAGTase)量少，提取十分困難，成為妨礙細胞吸附型葡糖基轉移酶(CAGTase)疫苗實際應用的主要原因。
發明內容
本發明的目的在於提供一種變形鏈球菌葡糖基轉移酶過度表達株，通過構建變鏈菌細胞吸附型葡糖基轉移酶(CAGTase)過度表達株，解決了變鏈菌細胞吸附型葡糖基轉移酶(CAGTase)量少、提取困難的問題。
本發明的另一個目的在於提供一種製備細胞吸附型變形鏈球菌葡糖基轉移過度表達株的方法，用該方法構建的表達株對於研製細胞吸附型葡糖基轉移酶抗齲疫苗有廣泛的應用價值。
本發明技術方案如下首先，構建攜帶細胞吸附型葡糖基轉移酶(CAGTase)基因的大腸桿菌——鏈球菌穿梭質粒pZB1，並將變形鏈球菌葡糖基轉移酶過度表達株B29-33(pZB1)，CCTCCNOM201045轉化至變鏈菌細胞吸附型葡糖基轉移酶(CAGTase)缺陷突變株B29中(變鏈菌B29由邊專等人於日本大阪大學構建)，然後對變鏈菌葡糖基轉移酶(CAGTase)過度表達株進行篩選及對其特徵的研究，其步驟如下(1)根據菌落形態篩選變形鏈球菌葡糖基轉移酶過度表達株B29(pZB1)-33(CCTCC No.M201045)表現為菌落體積較小，較堅硬，菌落中間凹陷，深入嵌入瓊脂中。
(2)免疫印跡鑑定變鏈菌細胞吸附型葡糖基轉移酶CAGTase過表達株野生株MT8148含兩種能與葡糖基轉移酶-I(GTase-I)多克隆抗體反應的蛋白帶，分別代表葡糖基轉移酶(GTase-I 156KDa)和GTase-SI(148KDa)，B29因缺乏葡糖基轉移酶-I(GTase-I)故僅有葡糖基轉移酶-SI(GTase-SI)。29(pZB1)-4，B29(pZB1)-33(CCTCCNo.M201045)均表達出葡糖基轉移酶-I(GTase-I)，但B29(pZB1)-4的表達水平接近野生型變鏈株MT8148，而B29(pZB1)-33(CCTCC No.M201045)和B29(pZB1)-11過度表達葡糖基轉移酶-I(GTase-I)。
(3)測定細胞吸附型葡糖基轉移酶CAGTase酶活力變鏈菌B29轉化株葡糖基轉移酶-I(GTase-I)酶活力測定表明轉化株B29(pZB1)-4葡糖基轉移酶(GTase)酶活力與野生型MT8148相似，但B29(pZB1)-11和B29(pZB1)-33(CCTCC No.M201045)葡糖基轉移酶(GTase)酶活力顯著高於MT8148。
(4)蔗糖依賴性粘附試驗 結果表明變鏈菌野生型MT8148及變鏈菌葡糖基轉移酶-IGTase-I缺陷株B29的粘附水平、非水溶性葡聚糖合成量與接種量無關，但B29(pZB1)-33(CCTCC No.M201045)隨接種量的增加非水溶性葡聚糖合成增加但粘附水平下降。
(5)對陽性蛋白帶行薄層掃描以確定細胞吸附型葡糖基轉移酶(CAGTase)的高表達水平。
最後，進行變形鏈球菌細胞吸附型葡糖基轉移酶高表達株GTase-I基因上遊DNA序列分析。發明優點和效果
迄今為止，本項研究所獲得的細胞吸附型葡糖基轉移酶(CAGTase)過度表達株在國內、外尚未見報告。通過這些細胞吸附型葡糖基轉移酶(CAGTase)過度表達株，進一步探索了細胞吸附型葡糖基轉移酶(CAGTase)在變鏈菌致齲機制中的作用。同時，由於變鏈菌葡糖基轉移酶的量少，難以提取，曾阻礙了利用細胞吸附型葡糖基轉移酶(CAGTase)作為抗齲疫苗的研究。運用基因工程技術構建了變鏈菌細胞吸附型葡糖基轉移酶(CAGTase)過度表達株後，將其免疫奶牛，測得牛乳中含高水平的抗變鏈菌抗體。將該免疫牛奶用於自願受試人群含漱，結果顯示，牙舌面變鏈菌水平顯著下降。因此，構建的這些細胞吸附型葡糖基轉移酶(CAGTase)過度表達株，對於研製細胞吸附型葡糖基轉移酶(CAGTase)抗齲疫苗可能有潛在的應用價值。
圖1質粒(pTF37)的構建質粒(pSP73)用NdeI和HpaI消化，經聚丙烯醯胺凝膠電泳後分離出221bp多克隆區(multiclonal site)。質粒(pMW119)經PuvII消化，瓊脂糖凝膠電泳並分離出3.9Kb(千鹼)的DNA片段後與221bp DNA片段混勻，末端平齊後連接，所產生的重組質粒多克隆區有2個方向，如圖方向者為質粒(pTF37)。
圖2 質粒(pTF41)，質粒(pTF42)的構建質粒(pSK6)經KpnI和BglII消化後，分離純化GTase基因(5.0Kb)。將gtfB基因與經KpnI和BglII消化後的質粒(pTF37)連接。質粒(pSK16)經KpnI消化，分離提純gtfC基因(4.7b)。將gtfC基因與經KpnI和SphI消化後的pTF37連接，重組質粒為pTF42。
圖3 質粒(pZB1)和質粒(pZB2)的構建質粒(pVA838)經XbaI和SalI消化後分離出6.2Kb DNA片段，將該DNA片段與經XbaI和SalI消化後的pTF41連接，所產生的重組質粒為質粒(pZB1)。質粒(pVA838)經EcoRI和BamHI消化後，提取7.0Kb DNA片段與經EcoRI和BglII消化後的質粒(pTF42)連接，所產生的重組質粒為質粒(pZB2)。
圖4 變鏈菌葡糖基轉移酶(GTase-I)高表達株在輕唾培養基上菌落形態採用質粒(pZB1)轉化變鏈菌B29後分離到大量轉化株，其中多數在MS瓊脂上表現為粗糙菌落。根據轉化株特徵分別命名為B29(pZB1)-4、B29(pZB1)-33(CCTCC No.M201045)、B29(pZB1)-11。變鏈菌MT8148、B29及葡糖基轉移酶(GTase-I)高表達株在MS瓊脂上呈現出各不相同的菌落形態。變形鏈球菌葡糖基轉移酶過度表達株B29(pZB1)-33(CCTCC No.M201045)表現為菌落體積較小，較堅硬，菌落中間凹陷，深入嵌入瓊脂中。
圖5變鏈菌細胞吸附型葡糖基轉移酶GTase-I過度表達株免疫印跡分析一抗兔抗GTase-1多克隆抗體二抗鹼性磷酸酶標記羊抗免IgG免疫印跡清楚地顯示野生株MT8148含兩種能與葡糖基轉移酶(GTase-I)多克隆抗體反應的蛋白帶，分別代表葡糖基轉移酶(GTase-I 156KDa)和葡糖基轉移酶(GTase-SI148Kda)、B29因缺乏葡糖基轉移酶(GTase-I)故僅有葡糖基轉移酶(GTase-SI)。29(pZB1)-4、B29(pZB1)-33(CCTCC No.M201045)均表達出GTase-I，但B29(pZB1)-4的表達水平接近野生型變鏈株MT8148，而B29(pZB1)-33(CCTCC No.M201045)和B29(pZB1)-11過度表達GTase-I。B29(pZB1)-4上清樣本中還存在一條100KD的過度表達帶。
具體實施例方式
1.構建攜帶葡糖基轉移酶(CAGTase)基因的大腸桿菌—鏈球菌穿梭質粒(pZB1)本研究首先分離質粒(pSP 73)上多克隆區(multiclonal site)並連接至低拷貝質粒(pMW 119)，構成新質粒(pTF37)。將葡糖基轉移酶(GTase-I)及葡糖基轉移酶(GTase-SI)基因分別連接到質粒(pTF37)分別構成質粒(pTF41)和質粒(pTF42)。然後從源於鏈球菌質粒(pVA838)中分離鏈球菌複製子片段並連接至質粒(pTF41)和質粒(pTF42)，分別構成大腸桿菌-變形鏈球菌攜帶GTase基因穿梭質粒(pZB1)和質粒(pZB2)。具體步驟如下(1)構建質粒(pTF37) 質粒(pSP73)用NdeI和HpaI消化，經聚丙烯醯胺凝膠電泳後分離出221bp多克隆區(multiclonal site)。質粒(pMW119)經PuvII消化，瓊脂糖凝膠電泳並分離出3.9Kb(千鹼)的DNA片段後與221bp DNA片段混勻，末端平齊後連接，所產生的重組質粒多克隆區有兩個方向，如圖方向者為質粒(pTF37)(圖1)。
(2)構建質粒(pTF41)、質粒(pTF42) 質粒(pSK6)經KpnI和BglII消化後，分離純化GTase基因(5.0Kb)。將gtfB基因與經KpnI和BglII消化後的質粒(pTF37)連接(圖2)。質粒(pSK16)經KpnI消化，分離提純gtfC基因(4.7b)。將gtfC基因與經KpnI和SphI消化後的pTF37連接，重組質粒為pTF42。
(3)構建質粒(pZB1)和質粒(pZB2) 質粒(pVA838)經XbaI和SalI消化後分離出6.2Kb DNA片段，將該DNA片段與經XbaI和SalI消化後的質粒(pTF41)連接，所產生的重組質粒為質粒(pZB1)(圖3)。質粒(pVA838)經EcoRI和BamHI消化後，提取7.0Kb DNA片段與經EcoRI和BglII消化後的質粒(pTF42)連接，所產生的重組質粒為質粒(pZB2)。
在選擇載體質粒時其拷貝數是重要的考慮因素。含葡糖基轉移酶(GTase)基因的高拷貝質粒(pBR322)和pUC系列不能在大腸桿菌中生存。因為這類質粒在大腸桿菌中大量繁殖，其攜帶的葡糖基轉移酶(GTase)基因過度表達，在大腸桿菌細胞漿內合成多量葡糖基轉移酶(GTase)。葡糖基轉移酶(GTase)可能對大腸桿菌具有毒性作用，因此，在克隆這一蛋白基因時常採用低拷貝質粒。質粒(pMW119)為低拷貝質粒，攜帶了葡糖基轉移酶(GTase-I)基因和葡糖基轉移酶(GTase-SI)基因的質粒(pMW119)，分別為質粒(pSK6)和質粒(pSK16)，轉化大腸桿菌後，大腸桿菌能低水平表達葡糖基轉移酶(GTase)並穩定生長。
質粒(pSK6)和質粒(pSK16)僅攜帶能在大腸桿菌中複製的複製子，為了構建鏈球菌—大腸桿菌穿梭質粒，必須在質粒(pSK6)和質粒(pSK16)上加上能在鏈球菌中複製的複製子。質粒(pVA838)含這種鏈球菌複製子(圖3)。質粒(pVA838)經XbaI和SalI消化後可分離出完整的鏈球菌複製子，但質粒(pSK6)上缺乏SalI酶切區，為了解決這一問題，從質粒(pSP73)上分離出221bp的多酶切區(其中含XbaI和SalI單一酶切點)並將其整合至質粒(pMW119)，形成質粒(pTF37)。隨後將葡糖基轉移酶(GTase-I)基因和葡糖基轉移酶(GTase-SI)基因整合至質粒(pTF37)分別構建質粒(pTF41)和質粒(pTF42)。質粒(pTF41)既含葡糖基轉移酶(GTase-I)基因又具有SalI和XbaI酶切點，因而含鏈球菌複製子的質粒(pVA838)SalI和XbaI片段能整合至質粒(PTF41)而形成質粒(pZB1)。由於在質粒(pTF42)構建中已失去SalI和XbaI酶切點，因此質粒(pVA838)經BamHI和EcoRI消化、分離出鏈球菌複製子後將該片段連接於質粒(pTF42)的EcoRI和BglII上。因為BamHI和BglII為同裂酶(isoschizomer)產生相同的粘性末端，因而可以連接。通過紅黴素耐性挑選重組質粒，本研究所構建質粒見表1。由於質粒(pZB1)和質粒(pZB2)分別含大腸桿菌低拷貝複製子和鏈球菌複製子，故既能在大腸桿菌中生存複製也能在鏈球菌中生存複製。
表1質粒 特徵pTF37 Ampr(L)源於pMW119含來源於pSP73的多克隆區[4.05Kb]*pTF41 Ampr(L)源於pFT37含gtfB基因[9.0Kb]pTF42 Ampr(L)源於pFT37含gtfC基因[9.0Kb]pZB1 EmrAmpr(M)鏈球菌—大腸桿菌穿梭質粒含gtfB基因[15.2Kb]pZB2EmrAmpr(M)鏈球菌—大腸桿菌穿梭質粒含gtfC基因[16Kb]*[ ]內為質粒分子量，Kb千鹼基對，(L)低拷貝，(M)中等拷貝
2.質粒(pZB1)對變鏈菌細胞吸附型葡糖基轉移酶(CAGTase)陷突變株B29的轉化變鏈菌細胞吸附型葡糖基轉移酶(CAGTase)缺陷突變株B29由邊專等人在日本大阪大學構建。變鏈菌B29於變鏈菌轉化培養基(Todd-Hewitt培養基及5％失活馬血清)中37℃，18hr，以變鏈菌轉化培養基1∶40稀釋(10ml)，37℃，1.5hr，加入質粒(pZB1)至終濃度25ug/ml，37℃，2hr，離心；濃縮10倍，塗皿。
3.對變鏈菌葡糖基轉移酶CAGTase過度表達株的篩選及對其特徵的研究(1)採用質粒(pZB1)轉化變鏈B29後分離到大量轉化株，其中多數在MS瓊脂上表現為粗糙菌落。根據轉化株特徵分別命名為B29(pZB1)-4、B29(pZB1)-33(CCTCCNo.M201045)。B29(pZB1)-11。變鏈菌MT8148、B29及葡糖基轉移酶(GTase-I)高表達株在MS瓊脂上呈現出各不相同的菌落形態。變形鏈球菌葡糖基轉移酶過度表達株B29(pZB1)-33(CCTCC No.M201045)表現為菌落體積較小，較堅硬，菌落中間凹陷，深入嵌入瓊脂中(圖4)。
(2)免疫印跡清楚地顯示野生株MT8148含兩種能與葡糖基轉移酶GTase-I多克隆抗體反應的蛋白帶，分別代表葡糖基轉移酶GTase-I(156KDa)和葡糖基轉移酶GTase-SI(148KDa)。B29因缺乏葡糖基轉移酶(GTase-I)故僅有葡糖基轉移酶(GTase-SI)。29(pZB1)-4、B29(pZB1)-33(CCTCC No.M201045)均表達出葡糖基轉移酶(GTase-I)，但B29(pZB1)-4的表達水平接近野生型變鏈株MT8148，而B29(pZB1)-33(CCTCC No.M201045)和B29(pZB1)-11過度表達GTase-I(圖5)。B29(pZB1)-4上清樣本中還存在一條100KD的過度表達帶。
(3)變鏈菌B29轉化株葡糖基轉移酶(GTase-I)酶活力測定表明轉化株B29(pZB1)-4葡糖基轉移酶(GTase)酶活力與野生型MT8148相似，但B29(pZB1)-11和B29(pZB1)-33(CCTCC No.M201045)葡糖基轉移酶(GTase)酶活力顯著高於MT8148。
(4)蔗糖依賴性粘附試驗按Koga等描述的方法，測試菌於BHI肉湯中37℃生長18hr，將25μl、50μl、100μl和200μl該生長物分別接種至3ml含1％蔗糖的BHI肉湯中，30°水平角傾斜培養18小時。輕柔旋轉培養試管，將脫落菌體傾至另一試驗管中，粘附菌體量採用比色測量(OD550)並以佔總生長菌體數百分比表示。每份測試樣品一式三份。在另一次實驗中，接種菌液量為25μl，分別於培養時間15、18、21、24hr，測定蔗糖依賴性粘附水平。
非水溶性葡聚糖合成的測定在蔗糖依賴性粘附試驗後，菌體樣本合併，蒸餾水洗滌4次，懸混於3ml蒸餾水中，以葡萄糖為標準液，用蒽酮比色法測定總己糖量(代表非水溶性葡聚糖)。
結果表明變鏈菌野生型MT8148及變鏈菌葡糖基轉移酶-I(GTase-I)缺陷株B29的粘附水平、非水溶性葡聚糖合成量與接種量無關，但B29(pZB1)-33(CCTCC No.M201045)隨接種量的增加非水溶性葡聚糖合成增加但粘附水平下降。
4.變形鏈球菌葡糖基轉移酶高表達株GTase-I基因上遊DNA序列分析從變鏈菌B29(pZB1)-33(CCTCC No.M201045)，B29(pZB1)-11中提取DNA，轉化大腸桿菌JM109，於含氨苄青黴素(100ug/ml)和紅黴素(250ug/ml)的LB瓊脂中生長，篩選合適轉化株。
DNA測序方法按Sanger雙脫氧鏈終止法進行。
DNA測序引物為引物1 GAACGCGGCTACAATTAATAC 21mer引物2 GCCAGATGCTGTAAGCAGCG20merDNA測序反應RM反應液5×測序反應緩衝液 2ul標記緩衝液2ulDTT 1ulSequenase 2ulDATP-35S 0.5ulMn緩衝液 1ul混勻、靜置冰中備用2％ Soft agarose 3ml引物(OD280＝1)3ul待測DNA 7ul混勻後98℃，10min，37℃ 10min，加8.5ul RM反應液，37℃ 5min，分別取4.5ul加至ddG，ddA，ddT，ddC(每種2.5ul)中，37℃ 10min，加終止反應液4ul，70℃ 2min，立即上樣電泳。
電泳條件在恆壓1700V下預電泳30min，待電泳膠表面55℃時方上樣電泳。
電泳後膠處理凝膠取下，置於5％甲醇，5％乙酸中固定15min，在固定液加2000mlH2O漂洗5min，取出膠，吸乾水份，置於幹膠機中，80℃真空幹膠1hr，置於X片盒中-80℃感光過夜。
測序結果表明質粒pZB1與從B29(pZB1)-33(CCTCC No.M201045)和B29(pZB1)-11中所提質粒在GTase-I上遊區無任何差別(圖5)，說明pZB1在轉化進入變鏈菌過程中未發生突變。雖然pZB1在大腸桿菌宿主中為低拷貝質粒，但該質粒在變鏈菌中的複製數量尚不清楚，因此推測可能是由於pZB1在變鏈菌中的大量複製導致GTase-I基因數量增加而引起B29(pZB1)-33(CCTCC No.M201045)的GTase-I高表達。另外一種可能的機制是變鏈菌GTase-I基因的調控基因僅對染色體上的GTase-I基因有調控作用，因此，位於質粒上的GTase-I基因得以大量表達。
變鏈菌MT8148 GTase-I基因與變鏈菌GS-5株gtfB上遊比較存在著廣泛的一致性，這一結果與Fujiwara等的Southern雜交結果一致。因為變鏈菌MT8148與GS-5在遺傳型分類上為同一型，因此推測變鏈菌GTase基因可能在遺傳型同型菌株間高度保守。
權利要求
1.一種變形鏈球菌葡糖基轉移酶過度表達株，其特徵在於變形鏈球菌葡糖基轉移酶過度表達株B29-33，CCTCC NOM201045。
2.一種實現權利要求1所述的變形鏈球菌葡糖基轉移酶過度表達株的構建方法，包括下列步驟A、構建攜帶葡糖基轉移酶基因的大腸桿菌—鏈球菌穿梭質粒，首先構建質粒pTF37，質粒pSP73用NdeI和HpaI消化，經聚丙烯醯胺凝膠電泳後分離出221bp多克隆區，質粒pMW119經PuvII消化，瓊脂糖凝膠電泳並分離出3.9Kb的DNA片段後與221bp DNA片段混勻，末端平齊後連接；其次是構建質粒pTF41、質粒pTF42，質粒pSK6經KpnI和BglII消化後，分離純化GTase基因5.0Kb，將gtfB基因與經KpnI和BglII消化後的質粒pTF37，質粒pSK16經KpnI消化，分離提純gtfC基因4.7b，將gtfC基因與經KpnI和SphI消化後的pTF37連接，重組質粒為pTF42；最後構建質粒pZB1和質粒pZB2，質粒pVA838經XbaI和SalI消化後分離出6.2Kb DNA片段，將該DNA片段與經XbaI和SalI消化後的質粒pTF41連接，所產生的重組質粒為質粒pZB1，質粒pVA838經EcoRI和BamHI消化後，提取7.0KbDNA片段與經EcoRI和BglII消化後的質粒pTF42連接，所產生的重組質粒為質粒pZB2；B、質粒pZB1對變鏈菌細胞吸附型葡糖基轉移酶CAGTase陷突變株B29的轉化，變鏈菌B29於變鏈菌轉化培養基中37℃，18hr，以變鏈菌轉化培養基1∶40稀釋，37℃，1.5hr，加入質粒pZB1至終濃度25ug/ml，37℃，2hr，離心，濃縮10倍，塗皿；C、對變鏈菌葡糖基轉移酶CAGTase過度表達株的篩選，首先採用質粒pZB1轉化變鏈B29後分離到轉化株，其中在MS瓊脂上表現為粗糙菌落；D、變形鏈球菌葡糖基轉移酶高表達株GTase-I基因上遊DNA序列分析，從變鏈菌B29(pZB1)-33 CCTCC No.M201045，變鏈菌B29(pZB1)-11中提取DNA，轉化大腸桿菌JM109，於含氨苄青黴素和紅黴素的LB瓊脂中生長，篩選轉化株。
全文摘要
本發明公開了一種變形鏈球葡糖基轉移酶過度表達株方法及構建方法,採用變列鏈球菌葡糖基轉移酶過度表達株B29－33 pZB1,CCTCC NO:M201045,構建攜帶葡糖基轉移酶基因的大腸桿菌－鏈球菌穿梭質粒;質粒pZB1對變鏈菌細胞吸附型葡糖基轉移酶陷突變株B29的轉化;對變鏈菌葡糖基轉移酶過度表達株的篩選。本發明解決了變形鏈菌細胞吸附型葡糖基轉移酶量少,提取困難的問題,對抗齲疫苗有廣泛的應用價值。
文檔編號C12N15/63GK1369554SQ0211552
公開日2002年9月18日 申請日期2002年2月5日 優先權日2002年2月5日
發明者邊專 申請人:武漢大學