大豆胞囊線蟲抗性相關Map-5149SNP標記及檢測方法與鑑定利用與流程
2023-05-28 13:44:56 2
本發明涉及生物技術領域，尤其涉及大豆胞囊線蟲抗性相關Map-5149SNP標記及檢測方法與鑑定利用。
背景技術：
大豆胞囊線蟲(Soybean Cyst Nematode，SCN)具有分布廣，危害重，傳播途徑多，寄主範圍廣，存活時間久等特點，是一種極難防治的土傳病害，其發生可對大豆生產造成毀滅性打擊，目前，該病害具有蔓延及日趨加重的趨勢，已經嚴重製約了大豆生產。實踐證明，培育和種植抗病品種是防治病害的最有效途徑。由於SCN抗性基因在遺傳上的複雜性和大豆胞囊線蟲生理小種的多樣性，利用傳統抗病表型鑑定和育種方法培育抗大豆胞囊線蟲病的品種不但需要花費很長的時間，而且難於成功，已經不能夠滿足當前抗線育種的發展。隨著分子標記的開發和使用，分子標記輔助選擇(Molecular marker-assisted selection，MAS)成為可以節約人力、物力和加速育種進程的有效方法(Cregan et al.1999)。MAS的最大優點是在不需要評估表型特徵的情況下，通過確認是否帶有目標基因而鑑定出抗性植株。
經典遺傳分析表明，大豆胞囊線蟲的抗性是受多個位點控制的數量性狀，雖然兩個主要抗病位點(rhg1和Rhg4)被克隆(Cook et al.Science,2012；Liu et al.Nature,2012)，但無法解釋全部抗性變異，無法滿足育種需要，有必要繼續發掘新的抗病基因。大豆起源於我國，我國的抗源最豐富，其中蘊藏著優異抗病基因。關聯分析，又稱關聯作圖(Association Mapping)，是一種以LD(Linkage Disequlibrium)分析為基礎，直接對基因型變異和表型變異進行分析，從而把那些與性狀有關聯的基因鑑定出來(Khush et al.2001)，關聯分析方法已成為發掘與表型相關分子標記的強有力工具。新型分子標記—SNP因為具有在基因組中數量多、分布廣泛、可高通量檢測等優點而在近年廣泛用於鑑定多基因控制的複雜性狀。隨著SNP標記數量的不斷增多，高通量的SNP分型平臺不斷推出，包括BeadArray(Illumina)，GenomeLab SNP stream(Beckman)和MegAllele(Affymetrix)等，其中Illumina公司的BeadArray晶片鑑定技術具有高效、高通量、成本低、準確性好等優點，適合位點數從幾十到幾千的中等通量基因分型研究，實驗成功率>99％，是理想的中等通量基因分型檢測的解決方案，目前已被廣泛用於人類、擬南芥、水稻等物種的SNP分型。
技術實現要素：
本發明的一個目的是提供檢測大豆基因組中Map-5149SNP位點的多態性或基因型的物質的用途。
本發明提供的檢測大豆基因組中Map-5149SNP位點的多態性或基因型的物質在鑑定或輔助鑑定大豆對大豆胞囊線蟲3號生理小種抗性中的應用。
所述檢測Map-5149SNP位點的多態性(即等位基因)或基因型具體可為檢測Map-5149SNP位點的核苷酸種類。
本發明另一個目的是提供檢測大豆基因組中Map-5149SNP位點的多態性或基因型的物質的另一個用途。
本發明提供了檢測大豆基因組中Map-5149SNP位點的多態性或基因型的物質在製備鑑定或輔助鑑定大豆對大豆胞囊線蟲3號生理小種抗性產品中的應用。
本發明第三個目的是提供檢測大豆基因組中Map-5149SNP位點的多態性或基因型的物質的第三個用途。
本發明提供的檢測大豆基因組中Map-5149SNP位點的多態性或基因型的物質在鑑定或輔助鑑定抗病大豆中的應用；所述病為由大豆胞囊線蟲3號生理小種引發的病；
或檢測大豆基因組中Map-5149SNP位點的多態性或基因型的物質在製備鑑定或輔助鑑定抗病大豆產品中的應用；所述病為由大豆胞囊線蟲3號生理小種引發的病。
本發明第四個目的是提供檢測大豆基因組中Map-5149SNP位點的多態性或基因型的物質的第四個用途。
本發明提供了檢測大豆基因組中Map-5149SNP位點的多態性或基因型的物質在鑑定或輔助鑑定與大豆胞囊線蟲3號生理小種抗性相關的單核苷酸多態性中的應用；
或檢測大豆基因組中Map-5149SNP位點的多態性或基因型的物質在製備鑑定或輔助鑑定與大豆胞囊線蟲3號生理小種抗性相關的單核苷酸多態性產品中的應用。
本發明第五個目的是提供檢測大豆基因組中Map-5149SNP位點的多態性或基因型的物質的第五個用途。
本發明提供了檢測大豆基因組中Map-5149SNP位點的多態性或基因型的物質在篩選或輔助篩選抗病大豆中的應用；所述病為由大豆胞囊線蟲3號生理小種引發的病；
或檢測大豆基因組中Map-5149SNP位點的多態性或基因型的物質在製備篩選或輔助篩選抗病大豆產品中的應用；所述病為由大豆胞囊線蟲3號生理小種引發的病。
上述應用中，所述大豆基因組中Map-5149SNP位點基因型為TT或CC；
所述Map-5149SNP位點位於大豆基因組第8條染色體的Glyma.08g234500基因的第2307位；所述Glyma.08g234500基因的核苷酸序列為序列1。
所述檢測大豆基因組中Map-5149SNP位點的多態性或基因型的物質包括Map-5149SNP固定用於檢測Map-5149SNP位點的探針組的SNP基因型晶片；
所述探針組由序列表中序列1所示的單鏈DNA分子、序列表中序列2所示的單鏈DNA分子和序列表中序列3所示的單鏈DNA分子組成。
本發明的第六個目的是提供一種鑑定或輔助鑑定大豆對大豆胞囊線蟲3號生理小種抗性的方法。
本發明提供的方法，包括如下步驟：檢測待測大豆基因組Map-5149SNP位點基因型，若所述待測大豆基因組Map-5149SNP位點基因型為TT，則所述待測大豆為或候選為抗病品種；若所述待測大豆基因組Map-5149SNP位點基因型為CC，則所述待測大豆不為或候選不為抗病品種；所述病為由大豆胞囊線蟲3號生理小種引發的病；
所述檢測待測大豆基因組Map-5149SNP位點基因型採用下述固定用於檢測Map-5149SNP位點的探針組的SNP基因型晶片檢測。
本發明第六個目的是提供檢測大豆基因組中Map-5149SNP位點的多態性或基因型的物質。
本發明提供的檢測大豆基因組中Map-5149SNP位點的多態性或基因型的物質，為a)-d)中的任一種產品：
a)鑑定或輔助鑑定大豆對大豆胞囊線蟲3號生理小種抗性的產品；
b)鑑定或輔助鑑定抗病大豆的產品；所述病為由大豆胞囊線蟲3號生理小種引發的病；
c)鑑定或輔助鑑定與大豆胞囊線蟲3號生理小種抗性相關的單核苷酸多態性產品；
d)篩選或輔助篩選抗病大豆產品；所述病為由大豆胞囊線蟲3號生理小種引發的病；
所述Map-5149SNP位點的所在基因為大豆基因組第8條染色體的Glyma.08g234500基因；所述Glyma.08g234500基因的核苷酸序列為序列1；
所述Map-5149SNP位點為序列表中序列1第2307位。
上述產品中，所述檢測大豆基因組中Map-5149SNP位點的多態性或基因型的物質包括Map-5149SNP固定用於檢測Map-5149SNP位點的探針組的SNP基因型晶片；
所述探針組由序列表中序列1所示的單鏈DNA分子、序列表中序列2所示的單鏈DNA分子和序列表中序列3所示的單鏈DNA分子組成。
本發明的實驗證明，本發明篩選出Map-5149SNP位點，通過檢測其的基因型可以在品種早期對育種材料進行大豆胞囊線蟲3號生理小種抗性，極大提高了育種過程中抗病品種的選擇效率、縮短育種時間，對於抗大豆胞囊線蟲品種的培育效果顯著。
具體實施方式
下面實施例中表3的高代品系是以中國農業科學院作物科學研究所繁育的中品03-5373(張姍姍等，作物學報,2013,39(10):1746-1753；劉章雄等，大豆科學，2008,27(6):911-914)為母本、中黃13(ZDD23876)為父本雜交構建F2群體、株行混收法繁殖 F2-4、單粒傳法繁殖F5～F10而衍生的F5:10代高代品系。
下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規方法。
下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業途徑得到。
實施例1、Map-5149SNP位點是與大豆胞囊線蟲3號生理小種抗病相關的單核苷酸多態性
Map-5149單核苷酸多態性位點位於Glyma.08g234500基因核苷酸序列(序列1)第2307位，其基本信息見表1。
表1、Map-5149SNP單核苷酸多態性位點基本信息
二、Map-5149SNP基因型與大豆胞囊線蟲3號生理小種抗病的關聯分析
1、大豆品種對大豆胞囊線蟲3號生理小種的抗病檢測
將表2和表3中的大豆品種均在田間病圃與溫室兩種環境條件下接種大豆胞囊線蟲3號生理小種。在田間採用完全隨機區組試驗設計方案，重複三次。田間種植行寬0.65米，行長1.5米，株間距0.05米。溫室採用盆栽鑑定，每個品種種植3盆，每盆種植5株。出苗30天後，對田間和溫室的每份材料均隨機選擇長勢相同10株進行鑑定，數每株胞囊數，計算每個鑑定品種的平均胞囊數。為了檢測胞囊指數(Female Index，FI)差異，每隔40行以中品03-5373作為抗病對照，中黃13作為感病對照。以基於胞囊指數劃分的抗病等級評估每個品種的抗性。胞囊指數的計算公式為FI＝(鑑定品種每株平均胞囊數/感病對照品種的平均胞囊數)X 100％，每份材料以離其最近的中黃13為感病對照品種)。抗感分級標準如下，FI＝0-9為抗病(Resistant,R)；FI＝10-29為中抗(moderately resistant,MR)；FI＝30-59為中感(moderately susceptible,MS)；FI＝60+為感病(susceptible,S)，結果如表2和表3所示。
2、基因型晶片檢測SNP基因型
1)、Map-5149 SNP位點基因型晶片的製備
根據自主開發的全基因組SNP數據集，篩選Rhg4區間(長度為2.8Mb)的Map-5149 SNP位點設計成Map-5149 SNP位點基因型鑑定晶片，具體如下：
根據SNP位點分析設計和人工合成Map-5149SNP探針組：
探針A：ACTTCGTCAGTAACGGACTTATTGTTGAGGGATTGGCGAGT(序列2)；
探針B：GAGTCGAGGTCATATCGTTTATTGTTGAGGGATTGGCGAGC(序列3)；
探針C：ATCTCTTCGTAAATCTCAATCGGAAGGGTTGAGCCTAACGTCTTGGTCTGCCTATAGTGAGTC (序列4)；
Map-5149 SNP位點基因型晶片為將上述人工合成的Map-5149SNP探針組的3條探針均固定到晶片(美國Iillumina公司)上，得到Map-5149 SNP位點基因型晶片。
2)、基因型檢測
利用Iillumina的SNP檢測平臺對表2中所示的133個大豆品種和表3中所示的244個大豆高代品系進行SNP基因型鑑定，具體如下：
(1)、提取各個品種的基因組DNA 250ng。
(2)、將待檢測DNA樣品加入含有預先根據SNP位點設計的探針組OPA的晶片微珠。
(3)、晶片的微珠上連接有地址序列的互補序列，通過地址序列完成雜交，並在晶片上進行單核苷酸鹼基延伸，得到一段包含該SNP位點的片斷。
(4)、清洗和掃描晶片。
(5)、利用BeadArray Reader軟體根據螢光顏色判讀並輸出分型結果，確定待測品種的基因型。結果如表2所示。
表2為大豆品種SNP位點基因型
上述表2涉及的品種均記載在如下文獻中：王國勳.中國大豆品種資源目錄.北京:中國農業出版社,1982；常汝鎮,孫建英.中國大豆品種資源目錄:續編一.北京:農業出版社,1991；常汝鎮,孫建英,邱麗娟,陳一舞.中國大豆品種資源目錄:續編二.北京:中國農業出版社,1996；張姍姍，李英慧，李金英，邱麗娟.優良品系中品03-5373系譜的遺傳解析及抗大豆胞囊線蟲病相關標記鑑定.作物學報,2013,39(10):1746-1753.
表3為中品03-5373和中黃13衍生的217個大豆高代品系SNP位點基因型
表2結果顯示，34個大豆抗病品種中30個品種的Map-5149 SNP位點的等位基因基因型為TT；17個大豆感病病品種中15個品種的Map-5149 SNP位點的等位基因基因型為CC。
計算表2中抗病品種或品系鑑定效率(攜帶TT等位基因的抗病品種/所有的抗病品種)，抗病品種或品系鑑定效率為88.2％。
計算表2中感病品種或品系鑑定效率(攜帶CC等位基因的感病品種/所有的感病品種)；感病品種鑑定效率為88.2％。
表3結果顯示，中品03-5373和中黃13雜交衍生的28個抗病高代品系中，26個高代品系的Map-5149 SNP位點的等位基因基因型為TT；189個大豆感病高代品系中116個高代品系的Map-5149 SNP位點的等位基因基因型為CC。
計算表3中抗病高代品系鑑定效率(攜帶TT等位基因的抗病高代品系/所有抗病高代品系)，抗病高代品系鑑定效率為92.9％。
計算表3中感病高代品系鑑定效率(攜帶CC等位基因的感病高代品系/所有感病高代品系)，感病高代品系鑑定效率為61.4％。
上述方法可以用於鑑定待測大豆對大豆胞囊線蟲3號生理小種的抗性。