具有反式互補的基因組缺陷的呼吸道合胞病毒的製作方法

2023-05-28 01:53:06 2

專利名稱：具有反式互補的基因組缺陷的呼吸道合胞病毒的製作方法
技術領域：
本發明涉及疫苗接種領域，更具體地是涉及針對由肺病毒(例如呼吸道合胞病毒(RSV))引起的疾病的疫苗。本發明涉及攜帶RSV基因組的RSV病毒體，其中RSV基因組中的對於感染性所必需的基因已經失活，而相應的野生型基因產物對病毒體構成反式互補。本發明還涉及生產所述RSV病毒體的方法和它們在疫苗上的用途，以及涉及生產針對肺病毒進行疫苗接種的方法。
背景技術：
人呼吸道合胞病毒分類上屬於肺病毒(Pneumovirus)屬，副粘病毒科。它是嬰兒、老年人和免疫缺陷個體中急性下呼吸道疾病的主要病因。它也是青少年和成年人中上呼吸道疾病的重要病因。目前該領域中沒有有效的h-RSV疫苗。
RSV是RNA包膜病毒，其在表面表達兩個主要抗原附著蛋白G和融合蛋白F。兩個蛋白都顯示可激發保護性抗體。G是兩個已知h-RSV亞組A和B的決定簇。在這兩組中發現了抗原差異。G蛋白表現出高度變異，其在組A和組B中僅有53％的胺基酸同源性，並且在組A的G蛋白序列中表現多達20％的差異(Mufson 1988，Cane 1991)。
目前，使用以RSV富集的免疫球蛋白(Respigam)或合成的人源抗F單克隆抗體(Palivizumab)的被動式免疫處理，來用於處理和保護一些易患病的未滿月嬰兒(如早產嬰兒)免受RSV感染(Robinson 2000，Greenough 2000)。RSV病理有兩個主要方面由病毒自身引起的細胞傷害和由過度反應的免疫系統引起的組織傷害。後者在疫苗設計中是高度複雜的因素。
RSV感染是季節性的，限於冬季並且在北半球高峰期是在年底左右。RSV可感染每一個兩歲之前小孩，很多病例被感染過兩次。較大的個體平均每隔一年被感染，這取決於環境；緊密接觸嬰兒和小孩的人具有50％的風險。病毒通過緊密接觸以飛沫或汙染表面進行傳播。RSV不能有效地通過氣溶膠傳播；病毒顆粒相對不穩定。在初次感染期間，病毒從上呼吸道(URT)到下呼吸道(LRT)的體內傳播主要通過吸入在URT上皮細胞中產生的病毒顆粒而發生。不能排除以形成合胞體的方式進行傳播，並且這種傳播在LRT感染中可能起次要作用。
通常，RSV病理始於URT；侵入部位是鼻，少部分經過眼而不是口。當限於URT組織時，儘管在成人中有時是急性的，該疾病限於普通感冒。然而，當病毒到達LRT時，在無保護的個體中會發生細支氣管炎和肺炎。在幼嬰中，這可危及生命，大約1/100需要住院和機械通氣，在這些幼嬰中超過1％會死亡。在老年人中，RSV誘發的LRT疾病是住院的主要因素；懷疑RSV導致25％的流感樣疾病。
對RSV的免疫應答是複雜的。通常，接觸h-RSV可建立抗LRT疾病的保護性應答。該應答隨年齡增加而減弱，導致老年人群對RSV的更高敏感性。針對URT疾病的長效持久保護表明是不可行的；甚至在同一季節中再次感染很常見，這並不是由於病毒變異引起的。抗RSV感染的保護包括可預防LRT疾病的、針對血液中循環的病毒蛋白質F和G的抗體。通過抗F和G的黏膜抗體可控制URT感染，但這些抗體的壽命有限。需要針對迄今尚未得到鑑定的病毒蛋白質的CD8+T細胞，來清除受感染組織的病毒，但是看來它們的存活時間過短或不能從其儲備庫中高效募集。更可能的是，這可能是由G基因中編碼的RSV表達的因子引起的(Srikiatkhachom，1997a)。
RSV疾病的重要方面是病理學免疫增強作用。在有限的病例中，通過從過量吸引的粒細胞釋放的細胞因子對感染組織的作用，細胞免疫應答可加重RSV疾病。該反應涉及宿主易患病的體質，但也可能涉及出生後首次RSV感染的時機。不幸的是，用福馬林滅活RSV的早期免疫試驗顯示在這些接種情況中，免疫普遍加劇了對野生型(wt)病毒感染的病理(Kim 1969)。RSV中含有的因子是造成該現象的原因，且它顯然是由福馬林處理而釋放的。此後的40年中，逐漸表明病毒G蛋白是這些問題的主要介質，但仍舊不清楚機理(Srikiatkhachorn 1997b)。無論如何，使用超出病毒體範圍的G蛋白進行接種(即在滅活病毒製劑中，作為沒有完全包被在膜中或肽結構中的表達產物)，看起來在模型體系中可導致免疫增強。因此，儘管G蛋白在某種程度上有利於RSV免疫力，它的性質也使疫苗設計變得複雜。
最初候選的活RSV疫苗包括冷傳代型或溫度敏感型突變體。前者通過在不斷降低的溫度中培養而被減毒，導致依賴於低溫進行生長，而後者突變體通過化學或放射誘發突變被製成依賴於特定的、通常是高溫進行複製。這些候選的活疫苗呈現出減毒不足或減毒過度(Crowe 1998)。
作為中和抗體的主要目標，可從RSV-F或G蛋白衍生候選的亞單位疫苗。候選的亞單位疫苗PFP2(純化的F蛋白)對RSV血清反應陽性病人是安全的，但不能提供針對LRT感染和相關病症的完全保護(Gonzalez2000)。另一亞單位疫苗是由多肽組成的BBG2Na，其包含融合到鏈球菌G蛋白的白蛋白結合結構域的h-RSV-G的胺基酸130-230(Power 1997)。BBG2Na在新生小鼠中誘導2型T輔助細胞的應答，並不引發肺的免疫病理(Siegrist 1999)。但還沒有有關保護作用的數據。目前在動物模型中研究用於平衡體液和細胞免疫應答的新佐劑的用途(Plotnicky，2003)。
在動物模型中已經研究了編碼RSV-F和G抗原作為候選疫苗的質粒-DNA載體的用途。這些疫苗在齧齒動物中誘導保護性應答(Li，2000)，不過，在一種齧齒動物中用野生型病毒攻擊後，發現RSV-F DNA候選疫苗的免疫小鼠可產生輕度增強的肺部炎性應答(Bembridge 2000)。在人體中使用質粒DNA疫苗的可行性還不得而知，並且在充分研究了並更重要地是接受該方法(特別是嬰兒)之前將至少花費15年。由表達RSV蛋白的活重組載體構建基於載體輸送系統的候選疫苗。例如，表達RSV-F和G的重組牛痘病毒可在小鼠中提供保護，但在黑猩猩中缺乏該效果(Collins 1990)。問題是根據在人群和嬰兒的主目標群中存在的(母體)抗痘病毒抗體，這些系統是否是安全(特別是牛痘病毒)和可行的。
一些候選疫苗是基於通過反求遺傳學產生的重組活RSV。研究的一個方向集中在通過將造成冷適應和溫度敏感的單個或組合突變體導入重組病毒中，來減毒這些病毒。由於減毒過度或減毒不足，這些候選疫苗沒有一個是可用的。研究的另一方向集中在缺失一個或多個病毒非結構基因。現在僅有有限的關於這些病毒在模型系統中性質的資料(Jin2003)。
對於研製RSV疫苗的可選擇的方法是使用牛RSV。只具有人F蛋白或具有人F和G蛋白的嵌合牛RSV，被用於評價其在黑猩猩中的效率。該候選疫苗的複製有限，其程度不能保護動物抵抗野生型h-RSV攻擊(Buchholtz 2000)。
因此，目前本領域中沒有有效可用的h-RSV疫苗。所有已在動物中測試過的RSV候選疫苗不能用於人。因此，在本領域中存在有效、安全的RSV疫苗的長期需求，而本發明的目的正是提供此類疫苗。
發明描述定義在本文及其權利要求中，動詞「包含(包括)」及其變化形式用於它的非限制性意義，來表示該詞後所納入的項目，但不排除沒有特別提到的項目。另外，不定冠詞「一個(種)」所涉及的要素不排除存在多於一個(種)要素的可能，除非上下文清楚地規定有且只有一個(種)要素。因此不定冠詞「一個(種)」通常指「至少一個(種)」。
本文所用的術語「病毒體」指在脂質包膜中含有核衣殼蛋白、病毒基因組和複製酶複合物的病毒顆粒，其中所述的脂質包膜含有病毒結構糖蛋白。
術語「病毒感染性」、「感染性病毒」、「感染性病毒顆粒」或「感染性病毒體」指能侵入合適的宿主細胞並開始病毒複製循環的病毒、病毒顆粒或病毒體，不管它能否導致產生感染性的新病毒。
發明詳述本發明的第一個方面涉及肺病毒病毒體。該病毒體包括在編碼肺病毒感染性所必需的蛋白質的基因中存在突變的病毒基因組，其中突變導致僅由病毒基因組產生的病毒缺乏感染性，並且病毒體包括病毒體感染性所必需的形式和量的所述蛋白質。
肺病毒優選是呼吸道合胞病毒(RSV)，更優選是人或牛RSV。人RSV可以是亞組A或B病毒，優選是臨床分離的、更優選是體外未被過度傳代的分離株(如實施例中所述，優選是傳代少於10、8、6或5次)。因此，任何RSV株或分離株可用於本發明的範圍中，從而可理解的是通過具體的人RSV分離株98-25147-X(稱為RSV分離株X)僅僅用於舉例說明本發明。更優選的是病毒是最近的臨床分離株，從而規定「最近」指不到10、8、6、4、3或2天前進行第一次分離。可以理解的是，儘管病毒體中的核苷酸序列不必對應於最近分離株的核苷酸序列，但優選本發明的病毒體中的蛋白質的胺基酸序列與最近臨床分離株中的蛋白質序列相同。
病毒基因組在至少一個編碼肺病毒感染性所必需的蛋白質的病毒基因中包括至少一個突變，其中病毒感染性如上所述。因此，肺病毒感染性所必需的蛋白質是本發明的病毒體侵入合適宿主細胞並開始病毒複製循環能力所必需的蛋白質，其中複製循環不必導致產生新的感染病毒。在本發明優選的病毒體中，突變引起病毒體在體內(即在合適的宿主機體)缺乏感染性，其中病毒體對於體外培養的合適宿主細胞仍是有感染性的。
在本發明優選的病毒體中，編碼肺病毒感染性所必需的蛋白質的突變基因是編碼病毒結構蛋白的基因。本文中肺病毒的結構蛋白被理解是在野生型感染性病毒的病毒體中存在的蛋白質。在本發明的病毒體中被突變的、編碼結構蛋白的基因優選是編碼附著蛋白G和/或融合蛋白F的基因，其中最優選是G蛋白。缺失和/或功能滅活編碼G蛋白的基因，適於幾個目的並可預防目前RSV候選疫苗的許多問題和併發症。一個目的是疫苗安全性缺失G蛋白的RSV在其宿主中是高度減毒的(Karron1997，Schmidt 2002)，因為它不能有效地感染宿主。一個併發症是G蛋白非常相關於引起不必要的免疫學應答，包括加劇的免疫病理(Alwan1993，Srikiatkhachom 1997b)和在某些遺傳易感性條件下可能使得免疫系統偏向於易於發生過敏症(和哮喘)狀態(Openshaw 2003，Peebles2003)。可通過缺失或失活G基因預防這種情況。包含在編碼G附著蛋白的基因中具有失活突變的病毒基因組、並包含病毒體感染性所需的形式和量的G附著蛋白的本發明肺病毒病毒體，稱為「ΔG+G」(肺)病毒或病毒體。類似地，在編碼G附著蛋白的基因中具有失活突變的、但沒有功能量的G蛋白作為反式互補的病毒體，稱為「ΔG」(肺)病毒或病毒體。
因此使用外部編碼的、感染所必需的蛋白質，可瞬時和功能性重建本發明的肺病毒病毒體。外部編碼的、感染所必需的蛋白質優選是附著蛋白G/或融合蛋白F，其中最優選是G蛋白。外部編碼的、感染所必需的蛋白質優選是與存在於病毒體中的基因組相同的病毒亞組(A或B)。外部編碼的、感染所必需的蛋白質更優選與存在於病毒體中的基因組是同源的，從而意味著在被失活之前，該蛋白質具有與在病毒基因組中編碼的胺基酸序列相同的胺基酸序列。或者，這可意味著外部編碼的蛋白質的胺基酸序列與存在於野生型病毒體中的序列相同，其中野生型病毒體與一個或多個內部編碼的蛋白質的胺基酸序列同它們在本發明的病毒體中的對應序列具有100％相同性。
在本發明的病毒體中，必需結構蛋白基因中的突變是導致僅由該病毒基因組產生的病毒缺乏該蛋白質或表達生物學失活的蛋白質的突變。僅由病毒基因組產生的病毒被理解為在缺乏病毒基因組反式互補的任何編碼序列的情況下僅從病毒體中存在的病毒基因組產生的病毒。因此病毒體中存在的病毒基因組不能指導必需結構蛋白的表達。通過技術人員熟知的多種方法可實施該過程，包括如翻譯起始密碼子的失活、將終止子導入編碼的蛋白質N末端附近、該基因的一個或多個移碼突變、該基因的一個或多個片段的缺失。優選通過缺失編碼必需結構蛋白的至少10、20、50、75、90或95％的序列，來失活該基因。然而，最優選地是包含缺失編碼蛋白(全)序列的突變的病毒體。
本發明顯然包括存在多於一個突變的病毒體。具體地說，多於一個病毒蛋白質編碼基因可包括所述蛋白功能的失活或變異的突變，或包括導致如上所述的病毒體缺乏該蛋白的突變。例如，本領域已知的冷傳代或熱敏感突變可聯合失活本發明中以上公開的必需結構蛋白。
從感染的宿主機體清除肺病毒樣RSV，需要合適的細胞免疫，病毒沒有感染上皮細胞就不會產生有效的細胞免疫。然而，本發明突變型肺病毒缺乏體內感染宿主細胞所必需的蛋白質的遺傳信息。因此本發明公開用於生產突變型肺病毒的方法，其包括在(反式)互補缺乏感染所需的蛋白質的細胞中複製突變型肺病毒。
因此在本發明另一方面中，涉及用於生產以上所述的突變型肺病毒病毒體的方法。該方法是用於生產肺病毒病毒體的方法，其中病毒體包含在編碼肺病毒(體內)感染性所必需蛋白的基因中具有突變的病毒基因組，該突變導致僅由病毒基因組產生的病毒缺乏感染性，以及病毒體包含病毒體感染性所需形式和量的所述蛋白質。所述方法包括步驟(a)用包含具有以上所述突變的病毒基因組的肺病毒來感染第一宿主細胞培養物，其中宿主細胞包含可指導所述蛋白質以病毒體感染性所需的形式和量在宿主細胞中瞬時性或組成型表達的表達載體；和(b)從感染的宿主細胞培養物中回收病毒體。從感染的宿主細胞培養物中回收病毒體包括從培養基回收或從細胞回收，或者二者都可。
第一宿主細胞是能複製肺病毒並且能或不能同時反式表達病毒體感染性所必需的蛋白質的任何宿主細胞。用於該目的的適宜宿主細胞是例如非洲青猴腎細胞培養物(例如1990年EMEA許可的Vero，ECACC lot10-87，第134代)。
在本發明優選的方法中，根據包括下列步驟的方法生產用於感染第一宿主細胞培養物的肺病毒(a)對第二宿主細胞提供可指導下列物質在宿主細胞中表達的一個或多個表達載體(i)在編碼對肺病毒(體內)感染性是必需的蛋白質的基因中具有突變的病毒基因組RNA，其中突變導致僅由該病毒基因組產生的病毒缺乏感染性；和(ii)肺病毒聚合酶複合物和任選地一種或多種另外的病毒蛋白質；和(b)培養第二宿主細胞從而生產病毒體。在優選的方法中，使用與第二宿主細胞相同或不同的宿主細胞，通過一種或多種另外的細胞感染步驟，擴增由第二宿主細胞產生的病毒體。
第二宿主細胞是能複製肺病毒並且能或不能同時反式表達病毒體感染性所必需的蛋白質的任何宿主細胞。用於該目的的適宜宿主細胞是例如非洲青猴腎細胞培養物(例如1990年EMEA許可的Vero，ECACC lot10-87，第134代)。第二宿主細胞可以相同於或不同於第一宿主細胞。
在本發明的方法中，從在噬菌體DNA依賴性RNA聚合酶啟動子的控制下的病毒DNA拷貝轉錄病毒基因組RNA，從而對(第二)宿主細胞提供可在噬菌體DNA依賴性RNA聚合酶的宿主細胞中指導表達的表達載體。優選地，噬菌體DNA依賴性RNA聚合酶是T7、T3或SP6聚合酶。
從第二宿主細胞的一個或多個表達載體表達的肺病毒聚合酶複合物至少包括從表達載體的對應的基因或cDNA所表達的L、P、N蛋白。為了提高裸露病毒基因組RNA的病毒組裝和包裝效率，在第二宿主細胞任選地表達一種或多種另外的病毒蛋白質。適於該目的的病毒蛋白質優選包括病毒基質膜蛋白，其中特別優選是M2-1蛋白。優選從被導入宿主細胞並在其中表達的病毒分離株的病毒基因組衍生L、P、N、M2-1、G或F蛋白，但或者使用來自其它異種病毒或非病毒源的同源蛋白。
技術人員可理解的是用於在第一和/或第二宿主細胞中表達病毒基因組RNA、依賴DNA的RNA聚合酶、肺病毒聚合酶複合物和任選的更多的病毒蛋白質以及必需結構蛋白的各種表達載體和調控序列(例如啟動子)，是本領域中可得到的(參見Sambrook and Russell(2001)″Molecular CloningA Laboratory Manual(第三版)，Cold Spring HarborLaboratory，Cold Spring Harbor Laboratory Press，New York)。
對於RNA病毒的反求遺傳學，即重組RNA病毒(例如本發明的病毒體)的表達，將病毒基因組RNA的cDNA拷貝克隆入質粒，並位於在一定條件下允許從DNA複製RNA的序列的控制下。通常，將用於噬菌體RNA聚合酶的啟動子序列位於RNA基因組的DNA拷貝的上遊，同時將用於RNA聚合酶的適宜終止子位於基因組的下遊。將自主剪切核酶序列位於終止子序列的上遊，以允許通過適當的終止子核苷酸合成RNA。通常需要適當的終止子序列從合成的RNA來拯救病毒。對於非分段的負鏈RNA病毒，需要聚合酶複合物(用於副粘病毒的N、P和L蛋白)連同基因組RNA和反基因組RNA進行共表達，來獲得重組病毒(參見Neumann 2002和本文實施例中的實例)。
其它優選的方法包括分離和/或純化本發明的病毒體，和/或將這些病毒體配製到藥物組合物中的更多步驟。對於有經驗的病毒學家而言用於分離和/或純化病毒體的方法是眾所周知的。例如包括多種離心技術(如差速或密度離心)或層析技術的方法。用於將本發明的病毒體配製到藥物組合物中的方法至少包括將病毒體與如下定義的藥學上可接受的載體進行混和的步驟。
在另外的方面中，本發明涉及包含上述的或上述的方法中可獲得的病毒體的組合物，以及藥學上可接受的載體。優選組合物是適於作為疫苗的藥物組合物，即組合物優選是疫苗。
在另一方面中，本發明還提供包含根據本發明的作為活性成分的病毒體和藥學上可接受的載體的藥物製劑。也可將藥學上可接受的穩定劑、滲透劑、緩衝劑、分散劑等等摻入藥物組合物中。優選的形式取決於給藥和治療性應用的計劃方式。藥物載體可以是適於將重建的病毒膜輸送到病人的任何親和性無毒物質。通過水、緩衝鹽溶液、甘油、聚山梨醇酯20、Cremophor EL，以及辛酸/癸酸甘油酯的水性混合物，舉例說明適於鼻內投藥的藥學上可接受的載體，並可對其緩衝處理以提供中性pH環境。
為了通過吸入給藥，使用合適的推進劑(如二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷、二氧化碳或其它合適的氣體)，以來自施壓器或霧化器的氣溶膠噴霧器的形式可便利地輸送本發明的藥物組合物，其中病毒體存在於如所述用於鼻內投藥的載體中。至於施壓的氣溶膠，通過提供輸送可計量數量的閥來確定劑量單位。
用於製備鼻內或吸入組合物的方法是本領域眾所周知的，並在多種資料來源中得到更具體地描述，包括，例如Remington′s PharmaceuticalScience(15th ed.，Mack Publishing，Easton，PA，1980)(出於所有目的，在此全部引用作為參考)。因此，可將病毒體作為活性成分配製到任何適於免疫接種的製劑中，來允許或促進免疫接種製劑有效地施用於個體，優選是人或活家畜或農畜(例如牛、豬、馬、山羊、綿羊)，其中該製劑還包括載體、佐劑、穩定劑、溶解劑、防腐劑和本領域公知的賦形劑。
在另外的方面中，本發明通過對需要預防或治療的對象施用本發明上述的、或上述可得到的治療性或預防性有效量的病毒體(包含所述病毒體的藥物組合物)，涉及用於抗肺病毒感染的接種方法，或預防或治療肺病毒感染的方法。優選地，通過鼻內施用病毒體。
本發明同樣涉及本發明上述的、或上述可得到的、用於作為藥物的病毒體，優選用於抗肺病毒感染的免疫接種藥物、或用於預防或治療肺病毒感染的藥物。本發明還涉及本發明的病毒體在製備用於抗肺病毒疾病或感染的免疫接種的藥物中、或用於預防或治療抗肺病毒疾病或感染的藥物中的用途。藥物優選是用於鼻內給藥的製劑。
包含本發明用於免疫接種的病毒體的組合物優選經鼻內施用於合適的宿主。在一個實施方案中，保護小牛免受b-RSV感染。還在另一實施方案中，保護人(優選嬰兒和老年人或免疫缺陷的個體)免受h-RSV感染。製劑優選包括適於以鼻內滴劑或噴劑給藥的製劑，優選是鼻噴劑。組合物中的ΔG+G肺病毒顆粒只感染上呼吸道上皮細胞一次，因為從最初感染的URT上皮細胞產生的第二代病毒體缺乏其從基因組被除去編碼序列的G附著蛋白。因此這些ΔG病毒體在宿主機體體內是無感染性的。然而，最初的單循環感染使得產生適宜的細胞免疫——即能清除野生型病毒感染的應答——以針對肺病毒(或特別是RSV)，而抗F的保護性抗體——即可預防下呼吸道感染的抗體——通過疫苗和無感染性子代被激發。如Palivimuzab處理的效力所示，抗F抗體可有效地限制RSV感染，其中Palivimuzab是抗F的人源單克隆抗體。這是本發明的重組肺病毒減毒型活疫苗的效力基礎。這些活病毒疫苗解決了許多與目前肺病毒候選疫苗有關的問題。在病毒體的天然環境中G蛋白的存在允許產生適宜的細胞免疫，卻又避免了分離的G蛋白不需要的免疫效應，所述免疫效應是分別造成對牲畜和人中b-RSV和h-RSV病原體的免疫增強的主要原因。
附圖描述

圖1PRSVXΔG的構建圖。上方的線條代表具有所示基因的RSV分離株X基因組RNA。下方的盒子代表RT-PCR產物和用於構建的寡核苷酸雙螺旋。盒子裡的數字表示如表I所列的寡核苷酸數。指出了用於克隆而導入的限制性位點。以下顯示最終的克隆圖圓形物是質粒，箭頭顯示克隆順序。
圖2顯示RSV分離株X和pRSVXΔG序列之間差異的對比。顯示了基因組方向對比的序列。指明了pRSVXΔG僅僅不同於RSV分離株X的核苷酸。相同序列用圓點(.)表示，缺口用(-)表示。基因起始信號是單下劃線，基因終止信號是雙下劃線，並在圖注中指明了基因。盒子畫出了由導入的核苷酸突變引起的限制性酶識別位點。
圖3在RSV RT-PCR擴增產物，和a)Mlul、b)Xmal、c)SexA-1、d)SnaB-1的消化產物中序列標記的鑑定圖。
圖4RSV分離株X和ΔG-RSV分離株X的生長曲線圖。用MOI＝0的病毒感染Vero細胞(實線)和Hep-2細胞(虛線)，並於37℃孵育。在所示的時點收集細胞，並測定對Vero細胞的CCID50滴度。
表I用於RT-PCR克隆RSV分離株X的引物。
表II.用於克隆輔助質粒和克隆用於構建穩定細胞系的質粒的引物。
表III.用於對來自RSV感染的Vero細胞RNA進行診斷性RT-PCR的引物。
表IV.以ΔG-RSV分離株X進行免疫以保護棉鼠(cotton rat)免受RSV感染和RSV誘導的病理的免疫試驗結果。
實施例通過非限制性實施例來舉例說明本發明，其中所述實施例僅僅用於舉例說明本發明的特定實施方案，不應當錯誤地作為限制本發明的廣泛範圍或任何方面。
實施例1病毒分離株、病毒分離、增殖和儲存重組h-RSV克隆的基礎是來自萊頓大學醫學中心診斷實驗室(theLeiden University Medical Centre diagnostic laboratory)的臨床RSV分離株。從病人上分離後，該病毒被命名為98-25147-X，其衍生於1998年12月21-24日期間的Hep-2細胞的診斷試驗。後來確定它屬於亞型A分離株，並稱作RSV分離株X。將該病毒在裝有DMEM(Gibco)、10％FCS、青黴素/鏈黴素/穀氨酸的T75瓶中以Hep-2細胞傳代4次，並隨後在裝有DMEM(Gibco)、10％FCS、青黴素/鏈黴素/穀氨醯胺的T75瓶中以Vero2細胞傳代5次。將得到的RSV分離株X作為工作上清液並在25或45％蔗糖中保存於-135℃。
實施例2編碼病毒基因組的RSV-X cDNA的構建通過酚-胍異硫氰酸鹽(Trizol，Invitrogen)提取感染Vero細胞的RSV分離株X上清，獲得總RNA。使用Thermoscript(Invitrogen)反轉錄酶和隨機六聚物引物，通過反轉錄來製備cDNA。該cDNA可在使用了高保真Taq聚合酶(Invitrogen)和含有限制性酶識別位點的特異引物(表I和序列表)的PCR中作為模板。根據RSV-A2(Genbank登錄號M74568)和RSV-RSS2(Genbank登錄號U39662)公開的序列，來設計引物。
首先分別將PCR產物克隆入不同的載體以下列出引物對、載體、限制性酶識別位點以及得到的載體名RSV021/RSV047pCAP載體(Roche)，平端成為Mlu N1，pCAP3(SH/M/P區)；RSV018/019pCAP載體，平端成為Mlu N1，pCAP2(G區)；RSV016/RSV017PUC21，Mlu I/Bam HI，pUK5(M2-2/M2-1/F區)；RSV024/RSV025aPUC21，Bam HI/Afl II，pUK1(NS2/NS1區)；RSV022/RSV023PUC21，EcoR V，pUK4(N區)；RSV014/RSV015PUC21，Kpn I/Mlu I，pUK2(L區)。
對從兩個獨立cDNA模板衍生的至少兩個單獨克隆進行測序；在第三個克隆上對含有該兩個克隆差異的區域進行測序。如果需要，使用技術人員已知的標準分子生物技術修補克隆。得到覆蓋了用於克隆的引物結合位點的額外PCR產物，並進行測序。通過基因組RNA的聚腺苷醯作用確定5』基因組末端，隨後用含有下列引物的寡核苷酸進行RT-PCR
引物ALG018TTAAAAGCTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT，和NS1基因引物RSV 126AATTCTGCAGGCCCATCTCTAACCAAAGGAGT。
用Hind III/Pst I將該片段克隆入pUC21。通過RACE(cDNA末端的快速擴增法)聯合PCR法確定3』末端。裝配所有的序列來生產RSV-X共有序列(Seq ID No.1)。
使用BigDye末端試劑盒，通過PCR循環測序法確定所有的序列，並通過ABI Prism310遺傳分析儀進行分析。
實施例3ΔG-RSV分離株X全長質粒的構建通過連續連接PCR片段，來裝配橫跨整個RSV分離株X基因組的全長cDNA(圖1)。用於噬菌體T7聚合酶的啟動子位於「尾」端之前。為了產生正確的3』末端，將cDNA「前導」末端融合肝炎Δ病毒核酶(HDVR)並隨後融合T7RNA聚合酶轉錄物終止子(參見圖1)。
首先，用T4DNA激酶使編碼RSV026/RSV027寡核苷酸和RSV028/029寡核苷酸的HDVR和T7終止子的兩組互補寡聚物進行磷酸化、雜交，並由Rsr II/Not I連接到克隆pUK1(含有基因NS1/NS2)中，從而生成質粒pUK3。然後，將含有N的克隆pUK4的Xma I/Sex AI片段經過Xma I/Sex AI酶切連接入質粒pUK3。該質粒(pUK6)含有N基因直到融合HDVR和T7終止子的3』前導序列的區域。
其次，用Xma I和已補平Hind III的位點，將質粒pCAP3的Xma I/EcoRV片段插入質粒pUK5，這生成質粒pUK8。隨後，用BssH II和BsiW I消化pUK 8，並用Klenow聚合酶補平末端並進行再次連接。該質粒含有基因M2-2、M2-1、F、SH、M以及P，並命名為pUK9。
為了合成用於RSV分離株X cDNA的低拷貝載體，用T4 DNA激酶將兩個互補寡聚物，即
RSV011AGCTTGCGGCCGCGTCGACCCGGGACGCGTCGATCGGGTACCAT，和RSV012CGATGGTACCCGATCGACGCGTCCCGGGTCGACGCGGCCGCA進行磷酸化、雜交並插入鹼性磷酸酶處理過的和Cla I/Hind III消化過的質粒ACYC 184(New England Biolabs)。得到的質粒命名為pACYC184-MCS。隨後，插入含有T7啟動子和L基因的pUK2D的MluI-Knp I片段，該中間載體命名為pACYCl。然後，使用Xma I/Not I，將從N基因直到3』前導序列的區域(包括融合的HDVR和pUK6的T7終止子序列)加到pACYC1，這生成中間質粒pACYC2。最後，將含有M2-2、M2-1、F、SH、M和P基因的pUK9的Xma I/Mlu I片段摻入pACYC2，生成包含缺失G基因的分離株X的RSV全基因組的質粒pACYC3。後者質粒的序列分析顯示在被修補的HDVR區中的缺失，並且所得質粒命名為pRSVXΔG。
除了構建體pRSVXΔG，還生成了構建體pACYC24，其中通過反向PCR反向互補基因組RSV分離株X插入物。從該構建體可合成反基因組RSV RNA。在pACYC24中，將T7啟動子位於3』前導序列之前，而將HDVR和T7終止子融合到5』尾序列。
將用於構建pRSVXΔG的所有限制性酶識別位點定位在RSV基因間隔區，並且不改變編碼序列或影響轉錄信號(如圖2所示)。
實施例4輔助質粒的構建如下構建表達幾個RSV蛋白的輔助質粒。從實驗室分離株RSV-A2(ATCC#VR1302)可衍生所有需要的基因。在Hep-2細胞上空斑純化病毒，並隨後用於感染Vero細胞。通過酚-胍異硫氰酸鹽(Trizol，Invitrogen)從這些細胞提取總RNA，並用高保真Taq聚合酶(Invitrogen)和分別特異於RSV基因L、P、N和M2-1的引物組(參見表II)進行RT-PCR。隨後使用如表II所示的限制性酶識別位點，將PCR產物克隆入表達質粒pcDNA3、pcDNA6或pCI。使用BigDye終止子試劑盒(AppliedBiosystems)，通過PCR循環測序法確定克隆序列，並通過ABI Prism310遺傳分析儀進行分析。
實施例5構建產生G蛋白的Vero細胞系使用以下幾種方法構建產生RSV-G蛋白的細胞系在方法1中，使用如表II所示的引物在來自RSV-A2或RSV分離株X感染的Vero細胞的RNA上進行RT-PCR，將來自RSV-A2或RSV分離株X的G基因、或者來自RSV-A2的G基因(其中通過引物RSV033和RSV034的修飾，已經失活內部的翻譯起始密碼子)克隆入表達載體pcDNA3或pcDNA6(Invitrogen)。使用化學劑CaCl2、基於脂質體的共沉澱法或電泳法(Ausubel 1989)，將質粒導入Vero細胞。可使用適於分離穩定細胞的兩種方法。在第一種方法中，轉染後72小時，使用含有選擇性培養基、用於pcDNA3的zeocin和用於pcDNA6的殺稻瘟菌素的不同稀釋度的新鮮培養基，以分開細胞。每3-4天對細胞補給選擇性培養基，直到鑑定到細胞灶。挑選單個克隆，並轉入96孔平板，或者以不同稀釋度進行種植以在96孔平板中得到單個細胞。通過免疫染色技術或使用了RSV G特異抗體的FACS，測試抗生素抗性克隆對RSV-G的表達。將表達G的克隆進行傳代，並稱其是表達G的穩定細胞系。第二種方法包括在轉染72小時後使用RSV-G特異抗體進行FACS分選。將表達細胞的RSV-G以連續稀釋法種植，來在96孔板中得到單個細胞，並用選擇性培養基培養。在選擇性培養基上傳代單個細胞克隆，隨後再次測試RSV-G的表達，從而得到表達RSV-G的細胞系。
在方法2中，使用Flp-In系統(Invitrogen)以生產在染色體位置具有插入位點的靶基因的Vero細胞，其中所示的染色體位置允許靶基因不同水平的表達。將通過方法1從質粒衍生的但具有G翻譯起始密碼子周邊序列的修飾(用引物RSV151導入表II)以允許高翻譯水平的RSV-G基因，使用系統-一般方法插入這些細胞系中的每一個，從而得到穩定表達不同水平的G蛋白的Vero細胞系。
在方法3中，通過用含有來自方法1的G基因的表達質粒進行轉染，或通過用牛痘病毒Ankara(MVA)(Sutter 1992)進行感染，或通過表達G蛋白的雞痘病毒(Spehner 1990)，使得Vero細胞瞬時表達G蛋白。
實施例6產生噬菌體T7聚合酶的細胞系的構建使用引物ALG022和ALG023(表II)，從含有噬菌體T7聚合酶基因的噬菌體pPRT7(van Gennip 1997)中PCR擴增該基因。使用Hind III/XbaI，將PCR產物克隆入pcDNA6b載體中，從而生成質粒pc6T7pol。根據製造商(Invitrogen)的建議，使用Lipofectamine 2000來轉染Vero細胞。轉染72小時後，分開細胞並在含有殺稻瘟菌素的新鮮培養基中生長。每3-4天對細胞供養新鮮培養基，並分開兩次以得到更大的培養體積。轉染20天後，使用Lipofectamine 2000通過報告質粒pT7-IRES2-EGFP轉染殺稻瘟菌素抗性細胞。為了構建質粒pT7-IRES2-EGFP，通過由Hind III/BamH1在質粒p-EGFP-N1(Clonetech)插入編碼T7啟動子序列(ALG32AGCTAATACGACTCACTATAGGGAGACGCGT和ALG33GATCACGCGTCTCCCTATAGTGAGTCGTATT)的一組互補寡聚物來構建第一質粒pT7-EGFP。然後，通過由Xmal-Notl將質粒pT7-EGFP的T7-EGFP片段克隆入質粒p-IRES2-EGFP，構建pT7-IRES2-EGFP。通過FACS分選表達EGFP的細胞，並以有限稀釋法進行培育，以得到單個細胞克隆。測試表達T7RNA聚合酶的單個克隆的穩定性，並在大培養體積中生長並進行保存。
實施例7生產重組ΔG-RSV分離株X病毒的方法將Hep-2細胞在DMEM+10％FCS(胎牛血清)+青黴素/鏈黴素/穀氨醯胺中培養，而Vero細胞及其衍生物在M 199+5％ FCS+青黴素/鏈黴素/穀氨醯胺中培養。將細胞在10mm2的培養皿中於37℃培養直至80％平板密度。對於Vero和Hep-2細胞，轉染前用修飾過的Ankara-T7(MVA-T7)(Sutter 1992，Wyatt 1995)或雞痘-T7病毒(Britton 1996)以MOI＝3(感染複數＝3)感染細胞，並將其在32℃孵育60分鐘，以允許表達噬菌體T7聚合酶。用Optimem培養基(Optimem 1 with glutamax，Invitrogen)洗滌細胞(Hep-2、Vero或Vero-T7細胞)，隨後使用Optimem(總體積500μl)中的Lipofectamine2000(Invitrogen)，通過編碼RSV的N、P、L和M2.1基因的輔助質粒和質粒pRSVXΔG來轉染細胞。加入以下量的質粒1.6μg pRSVXΔG、1.6μg pcDNA6-A2-N、1.2μg pcDNA3-P、0.4μg pcDNA6-A2-L、0.8μg pcDNA6-A2-M2.1。在32℃孵育3-4小時後，加入補充了2％FCS的500μl Optimem培養基，並將細胞在32℃孵育3天。然後刮取細胞，並將刮取的細胞混合物和含有拯救性病毒的培養基用於感染在DMEM+2％FCS+青黴素/鏈黴素/穀氨醯胺中生長的Vero或Hep-2細胞的新鮮培養物。後一過程重複4-5次，以得到高滴度的病毒上清。
通過從感染Vero細胞的ΔG-RSV分離株X中分離的RNA進行RT-PCR和通過單一限制性酶消化得到的產物，來確定ΔG-RSV分離株X病毒，其中將限制性酶的識別位點導入pRSVXΔG(圖2)。RSV分離株X作為對照。
為了鑑定RSV中的序列標記，用RSV分離株X或ΔG-RSV分離株X以MOI＝0.1感染Vero細胞。感染72小時後，從培養上清分離RNA，並作為RT-PCR的模板。在重組ΔG-RSV分離株X病毒的插入序列標記的兩側設計引物。在RT-PCR後，用合適的限制性酶消化得到的產物。得到下列消化產物(圖3)a)通過引物RSV065(GTCCATTGTTGGATTTAATC)和RSV093(CAAGATAAGAGTGTACAATACTGTC)進行PCR，並用Mlu-I進行消化，以產生RSV分離株X的937bp預期片段和ΔG-RSV分離株X的459和478bp片段；b)通過引物RSV105(GTTGGATTGAGAGACACTT)和RSV113(AGTATTAGGCAATGCTGC)進行PCR，並用Xma-I進行消化，以產生RSV分離株X的880bp預期片段和ΔG-RSV分離株X的656和224bp片段；c)通過引物RSV112(CCCAGTGAATTTATGATTAG)和RSV160(AATTGGATCCATGGACACAACCCACAATGA)進行PCR，並用Sex A-I進行消化，以產生RSV分離株X的694bp預期片段和ΔG-RSV分離株X的492和202bp片段；d)通過引物RSV098(TGGTAGTTCTCTTCTGGCTCG)和RSV114(ATCCCCAAGTCATTGTTCA)進行PCR，隨後用SnaB-I進行消化，以產生RSV分離株X的1820bp預期片段和ΔG-RSV分離株X的507和387bp片段。
與RSV分離株X相比，在Vero和Hep-2細胞上確定ΔG-RSV分離株X的生長特徵。
表III.對來自RSV感染的Vero細胞的RNA進行診斷性RT-PCR的引物
實施例8生產重組ΔG+G-RSV分離株X病毒的方法將從轉染的Vero細胞衍生的ΔG-RSV分離株X病毒傳代幾次，以獲得至少105pfu/ml(每毫升空斑形成單位)的滴度。然後將不同MOI的病毒用於感染可生產RSV-G蛋白的Vero細胞系。從培養基和/或從細胞中收集得到的ΔG+G-RSV分離株X，並通過免疫檢測技術分析病毒體中G蛋白的存在情況。在Vero或Hep-2細胞上確定感染性滴度，並通過對提取自被ΔG+G-RSV分離株X病毒感染的細胞中的病毒RNA進行RT-PCR，來確定ΔG基因組的完整度。將病毒在25％或40％蔗糖中保存於-135℃。
實施例9以ΔG-RSV分離株X進行免疫以保護棉鼠動物模型免受RSV感染和RSV誘導的病理的方法在棉鼠(每組4-6隻5-6周齡的棉鼠，雌雄都有)中進行保護試驗。在試驗初期，根據Prince(2001)的描述，動物顯示出對RSV感染敏感，並呈現出嚴重的疫苗介導的肺病理，這十分類似於人的情況。在鼻內施用RSV後，肺病理的特點是支氣管/細支氣管的內部和周邊的炎症浸潤以及上皮細胞增生。通過用福馬林失活的RSV-A2進行肌肉免疫、隨後用RSV-A2進行鼻內攻擊，可顯示更嚴重的病理。至於前述的病理，觀察血管周滲透和細支氣管周滲透以及肺泡炎，特徵在於免疫介導的病理。這些觀察結果被用作所有免疫和攻擊試驗的「內」對照。用RSV製劑進行鼻內(兩個鼻孔)感染和免疫棉鼠。對棉鼠肺進行光學顯微鏡病理學檢查；使用具有可產生CCID50滴度的RSV特異ELISA的肺勻漿連續稀釋法和使用可產生pfu滴度的RSV特異抗體，在攻擊後或感染/免疫後的不同時間點檢測病毒對Vero細胞的滴度。用ΔG-RSV分離株X免疫兩次後，充分保護棉鼠避免肺的RSV分離株X引起的感染和病狀。在表IV中總結了幾個試驗的結果。
表IV
1病毒滴度，pfu/ml的對數值2每隻動物所用的體積(μl)，每個鼻孔為該體積的一半3每克肺的病毒滴度的對數值，檢測限為102CCID50
參考文獻Alwan WH，Record FM，Openshaw PJ.Phenotypic and functionalcharacterisation of T cell lines specific for individual respiratory syncytial virusproteins.J Immunol.1993，150(12)5211-8.
F.M.Ausubel，R.Brent，R.E.Kingston，D.D.Moore，J.G.Seidman，J.A.Smith，K.Struhl，Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley and Sons，New York，1997Bembridge GP，Rodriguez N，Garcia-BeatoR，Nicolson C，Melero JA，Taylor G.DNA encoding the attachment(G)or fusion(F)protein of respiratory syncytial virusinduces protection in the absence ofpulmonary inflammation.J Gen Virol.2000，81(Pt10)2519-23.
Britton P，Green P，Kottier S，Mawditt KL，Penzes Z，Cavanagh D，Skinner MA.Expression of bacteriophage T7 RNA polymerase in avian and mammalian cells by arecombinant fowlpox virus.J Gen Virol.1996，77(Pt 5)963-7.
Buchholz UJ，Granzow H，Schuldt K，Whitehead SS，Murphy BR，Collins PL.Chimeric bovinc respiratory syncytial virus with glycoprotein gene substitutions fromhuman respiratory syncytial virus(HRSV)effects on host range and evaluation as alive-attenuated HRSV vaccine.J Virol.2000，74(3)1187-99.
Cane PA，Matthews DA，Pringle CR.Identification of variable domains of theattachment(G)protein of subgroup A respiratory syncytial viruses.J Gen Virol.1991，72(Pt 9)2091-6.
Collins PL，Purcell RH，London WT，Lawrence LA，Chanock RM，Murphy BR.Evaluation in chimpanzees of vaccinia virus recombinants that express the surfaceglycoproteins of human respiratory syncytial virus.Vaccine.1990，8(2)164-8Crowe JE Jr.Immune responses ofinfants to infection with respiratory virusesand live attenuated respiratory virus candidate vaccines.Vaccine.1998，16(14-15)1423-32.Review.
Gonzalez IM，Karron RA，Eichelberger M，Walsh EE，Delagarza VW，Bennett R，Chanock RM，Murphy BR，Clements-Mann ML，Falsey AR.Evaluation of the liveattenuated cpts 248/404 RSV vaccine in combination with a subunit RSV vaccine(PFP-2)in healthy young and older adults.Vaccine.2000，18(17)1763-72.
Greenough A，Thomas M.Respiratory syncytial virus preventionpast andpresent strategies.Expert Opin Pharmacother.2000，1(6)1195-201.
Jin H，Cheng X，Traina-Dorge VL，Park HJ，Zhou H，Soike K，Kemble G.Evaluation of recombinant respiratory syncytial virus gene deletion mutants in Africangreen monkeys for their potential as live attenuated vaccine candidates.Vaccine.2003，21(25-26)3647-52.
Karron RA，Buonagurio DA，Georgiu AF，Whitehead SS，Adamus JE，Clements-Mann ML，Harris DO，Randolph VB，Udem SA，Murphy BR，Sidhu MS.Respiratorysyncytial virus(RSV)SH and G proteins are not essential for viral replication invitroclinical evaluation and molecular characterisation of acold-passaged，attenuated RSVsubgroup B mutant.Proc Natl Acad Sci USA.1997，94(25)13961-6.
Kim HW，Canchola JG，Brandt CD，Pyles G，Chanock RM，Jensen K，ParrottRH.Respiratory syncytial virus disease in infants despite prior administration ofantigenic inactivated vaccine.Am J Epidemiol.1969，89(4)422-34.
Li X，Sambhara S，Li CX，Ewasyshyn M，Parrington M，Caterini J，James O，Cates G，Du RP，Klein M.Protection against respiratory syncytial virus infection byDNA immunization.J Exp Med.1998，188(4)681-8.
Lofland JH，O′Connor JP，Chatterton ML，Moxey ED，Paddock LE，Nash DB，Desai SA.P alivizumab for respiratory syncytial virus prophylaxis in high-risk infantsa cost-effectiveness analysis.Clin Ther.2000，22(11)1357-69.
Mufson MA，Belshe RB，Orvell C，Norrby E.Respiratory syncytial virusepidemicsvariable dominance of subgroups A and B strains among children，1981-1986.J Infect Dis.1988，157(1)143-8.
Neumann G，Whitt MA，Kawaoka Y.A decade after the generation of a negative-sense RNA virus from cloned cDNA-what have we learned？J Gen Virol.2002，83(Pt11)2635-62.Review.
Openshaw PJ，Dean GS，Culley FJ.Links between respiratory syncytial virusbronchiolitis and childhood asthmaclinical andresearch approaches.Pediatr Infect DisJ.2003，22(2Suppl)S58-64；discussion S64-5.Review.
Peebles RS Jr，Hashimoto K，Graham BS.The complex relationship betweenrespiratory syncytial virus and allergy in lung disease.Viral Immunol.2003；16(1)25-34.Review.
Plotnicky H，Siegrist CA，Aubry JP，Bonnefoy JY，Corvaia N，Nguyen TN，Power UF.Enhanced pulmonary immunopathology following neonatal priming withformalin-inactivated respiratory syncytial virus but not with the BBG2NA vaccinecandidate.Vaccine.2003，21(19-20)2651-60.
Power UF，Plotnicky-Gilquin H，Huss T，Robert A，Trudel M，Stahl S，Uhlen M，Nguyen TN，Binz H.Induction of protective immunity in rodents by vaccination witha prokaryoticalIy expressed recombinant fusion protein containing a respiratorysyncytial virus G protein fragment.Virology.1997，230(2)155-66.
Prince GA，Curtis SJ，Yim KC，Porter DD.Vaccine-enhanced respiratorysyncytial virus disease in cotton rats following immunization with Lot 100 or a newlyprepared reference vaccine.J Gen Virol.2001，822881-8.
Robinson RF，Nahata MC.Respiratory syncytial virus(RSV)immune globulinand palivizumab for prevention of RSV infection.Am J Health Syst Pharm.2000，57(3)259-64.Review.Erratum inAm J Health Syst Pharm 2000 Apr 1；57(7)699.
Sambrook J.，Fritsch EF，Maniatis T.Molecular Cloning.A Laboratory Manual，2nd ed.Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY，1989Schmidt U，Beyer J，Polster U，Gershwin LJ，Buchholz UJ.Mucosalimmunization with live recombinant bovine respiratory syncytial virus(BRSV)andrecombinant BRSV lacking the envelope glycoprotein G protects against challengewith wild-type BRSV.J Virol.2002，76(23)12355-9.
Siegrist CA，Plotnicky-Gilquin H，Cordova M，Berney M，Bonnefoy JY，NguyenTN，Lambert PH，Power UF.Protective efficacy against respiratory syncytial virusfollowing murine neonatal immunization with BBG2Na vaccineinfluence of adjuvantsand maternal antibodies.J Infect Dis.1999，179(6)1326-33.
Spehner D，Drillien R，Lecocq JP.Construction of fowlpox virus vectors withintergenic insertionsexpression of the beta-galactosidase gene and the measles virusfusion gene.J Virol.1990，64(2)527-33.
Srikiatkhachorn A，Braciale TJ.Virus-specific CD8+T lymphocytesdownregulate T helper cell type 2 cytokine secretion and pulmonary eosinophiliaduring experimental murine respiratory syncytial virus infection.J Exp Med.1997a，186(3)421-32.
Srikiatkhachorn A，Braciale TJ.Virus-specific memory and effector Tlymphocytes exhibit different cytokine responses to antigens during experimentalmurine respiratory syncytial virus infection.J Virol.1997b，71(1)678-85.
Sutter G，Moss B.Nonreplicating vaccinia vector efficiently expressesrecombinant genes.Proc Natl Acad Sci USA.1992，89(22)10847-51.
Van Gennip HG，van Rijn PA，Widjojoatmodjo MN，Moormann RJ.Recovery ofinfectious classical swine fever virus(CSFV)from full-length genomic cDNA clonesby a swine kidney cell line expressing bacteriophage T7 RNA polymerase.J VirolMethods.1999，78(1-2)117-28.
Wyatt LS，Moss B，Rozenblatt S.Replication-deficient vaccinia virus encodingbacteriophage T7 RNA polymerase for transient gene expression in mammalian cells.Virology.1995，210(1)202-5.
序列表110DE STAAT DER NEDERLANDEN，VERTEGENWOORDIGD DOOR DE MINISTER VANVOLKSGEZONDHEID，WELZIJN EN SPORT120具有反式互補的基因組缺陷的呼吸道合胞病毒130P210823 pct16033170PatentIn version 3.1210121115213212DNA213Human respiratory syncytial virus4001acgagaaaaa aagtgtcaaa aactaatatc tcgtagttta gttaatatac atataaacca 60attagatttg ggtttaaatt tattcctcct agatcaaaat gataatttta ggattagttc 120actagaagtt attaaaaatt atataattat taattttaaa taactataat tgaatacagt 180gttagtgtgt agccatggga atttttatta taagattttt gttcattatt cattatggaa 240gttgtataac aaactacctg tgattttaat cagtttttta agttcattgg ttgtcaagct 300gtttaacaat tcacttagat gaggatatgt agattctacc atatataaat gattatagtt 360taattctgtt gatctgaaat ttaaaacatg attgaaccac tttaagatgt tcatgtgctt 420atgatttata agtttattgc tgaaaacttc attacgtcca gctatagaat aagatagtat 480atctccacta acaacactct ttagtttaga caatgcagta ttaattcctt tttttgttat 540agggtaacaa agaaagggta tcaaactctt aatatttgca tcaatagact ctttatcagc 600cttcttaggc atgatgaaat ttttggttct tgatagtatc aatttagcat tttgtactac 660attaaatact gggaacacat ttgcaggacc tattgtaagg actaagtaaa cttcagatcc 720ctttaactta ctgcctaagc atacataagt ttttaatata gttatgttgt ctaatttgaa 780atcgatatca tcttgagcat gatattttac tattaacgta catttattaa ctgaagaaca 840gtacttgcat tttcttacat gcttgctcca ctctattata attttattcc agttgactgt 900tacaggcaat tcagcatcac agacaaaaag gctgataggt tcagcaaact ttatatgtaa 960ataagaccaa tgaatgttgt tggttgcatc tgtagcagga atggtcaaat tttcaccata1020atcaatgttg atatgtccat tgtacagcct taaaaactca attggtaaac tatgatcatt1080acaatctttc agacttctgt aaatatatct tatatcagga tgaagttcca ctactgtacg1140caataataaa ttccctgctc cttcacctat gaatgctata caattaggat ctttaatttt1200aaggtctttt aaaatatact ctatactaat tttacaacct gtagaactaa atacaaaatt1260gaatctatta atatgatgcc aaggaagcat gcaataaagt gatgtgctat tgtgtactaa1320
agatatttga tgagaagtag tagtgtaaag ttggttagat ttggctgtat tacctgaatg1380atctataatt ttatcaatca caaccgtagg aaataaatta tacaaatctt gtctgctgta1440attggttcta atcattgtag acgatttaat aagcttctta ttagataaca atggtaacat1500tattgagtca acatttttac ctatacaata gtcattcagt gtctttttat cattactttt1560aaccggattg gttagtatat tttctagggt ttctggtgta ggatgatata atttgttgta1620attactttct aattcagaat tagcaatcct tatatgttta gttaatagat gagtattatc1680tgagaagtta taattaatgt aaaaaagatt agaagtataa aattcatcat tgaatttgtg1740tttattttta atgtatattc tatctatatt tatcaatccc attctaacaa gatctatata1800agttaatatt gctttcatat gtgttggatg ataatctatg ttaacaaccc aagggcaaac1860tgtgaattct gctacattaa gacgtttaag aaaccatagt ttgaagctat gacatccttt1920tactctatgt aaacttgcat cctggctaag aatgtatttg ataacttttt gttctaaaaa1980taccttagac atagacttcc aataactact gtctattaat tccaatacac ataggagatc2040tgaagtattc atatcacact ccagctttgc tctgctgtaa cctttatgaa aacacaagag2100atatgtctta taagcattga agaaaacttt caaattaatg aacatatgat cagttatata2160tccctctccc caatcttttt caaaaatacc tttagaatct ttcataagtt gtataatcag2220aatccaatgt ccagctaaat tagtacttaa aatgtaagta ttatgaaaat agtcagatat2280cttatgcgcc aatattaaat tagaattaac attagatcca gattttagtg ttttattact2340taagaataat tccacatatt gagtcaaact tattttgtct ggtaaaaaca tatgctgttt2400ttgtatcact tgttttaact tgtgaatatc aacatcacct gtgaatatgg gaggtttcat2460caaatgtatc tcattaagct tgggtatgag aataattctg ttaggacata cattagtaaa2520ttgttctact actgacatta agctaaggcc aaagcttata cagttttgga atactatatc2580aatatcttca tcaccatact tttctgttaa tatgcgatta atagggctag tatcaaagtg2640atagtttgta gttctatagg ctggtattga tgcagggaat tcacatggtc tactactgac2700tgtaagacga tgcaaatagt taacacttaa atattgtgga aataattttt tggccttctc2760atatgctaac ccaagagttc ctatgctaag ttcctccatg aattcatcct tgttatctat2820agatgcatac acccaatcca attttgctaa tagatctatt tgatctctct gttttttggt2880taaaacttgt ctattataaa ctggcattgt ttttttctct tgtgtagatg aaccaaccca2940tggtttagtg ggtcctctct caccacgtgt taaactgttg acattatatt tctctatgat3000tatgccacta gctatagtgc ttgttgtata tttgatgtcc attgtataca tgatactggg3060tgatgtaaca ccaactatat tggataaaga ccaagatctt tctctaacat atttacttaa3120ttcagtaata cttaggtttt ccatactcaa tatttctctt ttatctctgt tacaatctaa3180tggtaatatc cttataagca aagttatgtt tttcctcatc atctcagtgg ctctatcaat3240
atctgttaag tctatggcag aagtcttttc cagtatgtta gttatagatt ttgtaccgga3300tataagattt actattttct ctgctttata aaagggtaaa ctttcataaa caactcttag3360cccgtgagga tatgtaggtt ctatattttg cataatatca ttaagatcta tctctgtagt3420ggtatagtgt tgtgcacttt tggagaatat tttgtttgga gctgtgctca aaacctcagt3480aactgccagt ctattgattt cactagtaat tttagcttgc ctctcagatc ctaaagcttg3540aggatctctc atcaatgtta caaattcagc attagggttt ttgtcaaacg tgattatgca3600tgttaagaat ttattcaatc tatcatctga cagatcttga agtttatctt ttaaatcatg3660gtttgtataa taactaagta tgaacacaga gtgaactata gcctctgtga gaaaatcagg3720agttcttcta tagaaacttc gatataacaa gttgggatca ccaccaccaa ataacatggg3780caaattcata tacaatgtta atgctgtatc aatattatca agattaaaaa aggtttttaa3840gtgttttaga acctttaata tgtccaaata taatttgttg ttacataatg catgattttt3900tagttgtaaa gcaatttgat tatataacca tacatttcta aatattaaac tgcataatag3960actttcacct ctatattcta attcttgtgt caaactacct atagattcta gactcacttt4020gaaatcatca agtatagtgt ttatccacgg tcccactctt aggactttct ttatactagc4080tgggtaatat acaccgttat gttggatcgt tttactcata aattgcatat ctcttgatat4140ataagtctca gttcctttta atttgtggcc tatgcctgca tactctttat acagtaattt4200gagactgttt aatgctagca aataatctgc ttgagcatga gtttgacctt ccatgagtct4260gactggttta cttatatcta ttgattgatt gtcaccatta attaaagcag taattgagaa4320tttccctttg agagatatta gatctaatag tgatatagct tctatggtcc atagtttttg4380acaccaccct tcgataccac ccatatgata tctatataat ccactttgct catctacatt4440gttaagatct acaatatgat cccttatata ggggggtgca tgcctatatg tgcatattat4500tgtgacatga ggaatagtta aatgtaacca ggaaaataga gattgtacac catgcagttc4560atccagtaca tcactacaaa tacatgatgt ttcatatcga aatgcttgat tgaatttgct4620gagatctgtg atgatagagc acttactaat gtaattgttg taattatcat tgtaacgatt4680tgatttgtta cttattcctg ctttcaattc taatattttc tgtagttcta gatcaccata4740tcttgtaaga ctttcaggga aaaattgtaa aatgttttca gctatcattt tctctgctaa4800tatttgaact tgtctgaaca ttcctggttg cattgcaaac attctaccta cactgagttc4860tctttcttta cctgtcaatg ataccacatg attagggttg ttaagataac tttgattaac4920tacacagttg tataaatcac attcattgaa tttgttatct cttaaatagt actctaatac4980tcttcttgat ttatcactct cagagaattt taacttttca tgttctatat aattttgtat5040gtgtgacggc atataatttc tagggaaact agtccatatt aaatttttag gaggtgatat5100agccttatca tttatgatca tttcgagatc cactttttta ggcaatcgaa actcccgata5160gaaacgtagt cctgatagaa caatcaaatc tctttctgta agttccaaca aggaaggata5220
agtgtttagt ttatagtaag ttaaccatct taagggtaaa acaatggcat tccttaaagt5280aggccatctg ttgtaattat ttacaaaccc ttttataatt ctatatataa aggcacctct5340taacatactc aaactgctta acaagtaaaa tttggtctcg ttgcaattaa ctttaacagc5400atccatggct tgtctttcat ctaccattgg gtgtccaaat attctgaaca aaaaatataa5460ttcactcaga ttgttaaggt tattgtcacc tgcaagctta attaatttta ggaacttact5520taatagaatt atccatctgc catttattat attatcggat actgtcttat ctaataatgt5580atgacatact cttgatagca gatttttctg agctttatta gcagcatctg tgatgttgtt5640gagcatacta ttataaaacc gttttctgaa ttgatcttct tctgttatat ttaaaattag5700agacataata aatccctcta cctcttttat tatgtagaac ccctcattgt gaaatagttt5760tagtatacaa tctccataaa ggaataattg tgtcaagata acattattga atccacatct5820taagcctaag cttttattta atgtgttcaa acagttacta atccatgtaa tcaaacaaac5880atttaatcta ctaaggctaa tatctttcca tgtcaagaat tgattatagg ttgtcacagt5940aattcttttg agttccttat gataaactat acaaccatat tgattcaaaa taaattggaa6000tccattaaga gtatgattat ctatcaatat aaaaccatgg ttttttacct cactagatcg6060atactgtgtt aatatgctgt ttaattttgt gtataaatta aaccaatgta ttaaccatga6120tggaggatgt tgcatcgaac acattaattt cttcaagagt gttgttttga ttgtatcttt6180ttgttttgta gagtgatttt tgtctgcttt aagatgagat tgattatcct taacagctaa6240aagtatatca tctttgatta tggttgtaat aactgagttg tcttcatctt gtccattgtt6300ggatttaatc ttgtcttttt ctttaagccc cagtttattc agtatagcat agactttgac6360atcactaatt tctatagctc ttcttattat ctttttaagt aaattagtgg tagtaatctg6420ttctgacgag gtcatactct tgtatgtcat aagtaatgac tgaaaatagg taggttcttc6480tatttttatt tcacctttat gatacttaga tattaaggac tgtgttatat ttagtttctt6540tagatttatg tgttctatta atggattttg tctactaatt aagttggtat aatcattttt6600gagataagga ccattgaata tgtaacttcc taaagcatta cattctgaga aagaaataac6660accttttaaa taactatcag ttagataaac attagcagaa tttccattaa taatgggatc6720cattttgtcc catagcttga attgtttgag ttaatagttt gatgatgtgg taagcattag6780gattgagtgt tatgacacta atatatatat tgtgtatata tcatcattaa tacctagatg6840ttgtagaaaa ttttgagttg catcaatcaa gtcttgagag gtccaatgga tttcattgaa6900tggttgattc ggtgagtata tatggttatt ttggttggtt tgattgatat atagtgtgtt6960tttttgatta tacatagtaa ctctacaact acttgttatt agtatggaat ttatactaca7020aggatatttg tcaggtagta tcattatttt tggcatggtc gttcgtatca ctaacagttg7080attcttttgg gttattgatg gttatgctct tgtggatatc caatgtgttt ttgatggttt7140
tcttcaatac atctgccggc aatcttttta acagatgaat agtttgttta ttgtttttcc7200tgttgctttc aatatatgat atgacagtat tgtacactct tatcttgggt gaatttggct7260cttcattgtc ccttagtttt ttgatgtcat cactgttgag ttcagtgagg agtttgctca7320tggcaacaca tgctgattgt ttagttatat tatttattga tcctatataa ctctctagca7380ctccaactac accgagggca tactcttctg ttctgtccaa ctctgcagct ccacttattt7440ctgataaagt atctatgctt ttatccatag acttaagtat tctgtttaac ataaaatttt7500gtcttacaag cagtgcatgg ggtggccatt caaaataatt atgactaaaa tggcacctct7560tgccattcaa gcaatgacct cgaatttcaa atttgcaagg attccttcgt gacatatttg7620ccccagttct tatttttaca aatagtaagt taatctggta ttcaattgtt ttatataact7680ataaaatagg aatctactta aatagtgtaa gtgagatggt ttatagatga aagttgtgat7740gaagttcaaa ttttaagaaa atccaatgat agatgggtta tctatggtta gatagtgaac7800cattgtaaga atatgattag gtgctatttt tattcagcta ctaaatgcaa tattgtttat7860accactcagt tgatccttac ttagtgtgac tggtgtgctt ctggccttgc aatatagaag7920cagtccaact gcaattaatg ataacaatat tactataatc actataatta tagtagttat7980catgatattt gtggtggatt taccagcatt tacattatgt aataattcat ctgatttacg8040aataaatgct agactctggt taatcttctc attgacttga gatattgatg catcaaattc8100atcagagggg aacactaatg ggtcatagaa atttattatt ggttcacctt ttacatagag8160acttttgcct tcttgcttat ttacataata taatgtatta cctacagaca cagtatccac8220ccccttattt gatacataat cacacccgtt agaaaatgtc tttatgatcc cacgattttt8280attggatgct gtacatttag ttttgccata gcatgacaca atggctccta gagatgtgat8340aacggagctg cttacatctg tttttgaagt cataattttg caatcatatt tggggttgaa8400tatgtcaatg ttgcagagat ttacctcact tggtaatgtt aaactgttca ttgtatcaca8460aaatacccga tttgattgaa ctttacatgt ttcagcttgt gggaagaaag atactgatcc8520tgcattgtca cagtaccatc ctctgtcggt tcttgttaag cagatgttgg acccttcctt8580tgtgttggtt gtacatagtg gggatgtgtg cagtttccaa caaggtgtat ctattacacc8640atatagtggt aattgtacta catatgctaa gacttcctcc tttattatgg acatgataga8700gtaactttgc tgtctaacta tttgaacatt gttggacatt aactttttct gatcatttgt8760tataggcata tcattgatta atgataataa ttcactatta gttaacatat aagtgcttac8820aggtgtagtt acacctgcat tgacactaaa ttccctggta atctctagta gtctgttgtt8880cttttgttgg aattctatca cagtttcaat gtttgatatg ctgcagcttt gcttgttcac8940aataggtaac aactgtttat ctatatagtt tttgagatct aacactttgc tggttaagac9000actgactcca tttgataagc tgactacagc cttgtttgtg gatagtagag cacttttgat9060tttgttcact tccccttcta ggtgcaagac cttggatacg gcaatgccac tggcgattgc9120
agatccaaca cctaacaaaa agccaagaaa tcttcttttc cttttcttgc ttaatgttac 9180attggtgttt ttggcattgt tgagtgtata attcataaat cttggtagtt ctcttctggc 9240tcgattgttg gctgctggtg tgctttgcat gagcaattgt aattctgtta cagcattttt 9300atatttatct aattcttgtt ttatcaattt taccttagcg tctgttccat tacacttatt 9360ttccttgata gtacttaatt ctatagttat aacactagta taccaaccag ttcttagagc 9420gctaagatag cccttgctaa ctgcactgca tgttgattga tagaattctt cagtgatgtt 9480ttgactggaa gcgaaacaga gtgtgactgc agcaaggatt gtggtaatag catttgtttt 9540gaggattggc aactccattg ttatttgccc catagttgat tttgattctg tttgatttgg 9600tcatggcttt ttgcaataat acgcttttta atgactactg gtttgttgtg ttggatggag 9660atagagattg tgataggtac tcggatgttg tatagacttg tgaagggctt ggattgcctt 9720cggaggtggt tgagtggaga gtttcctttt gacttgtgtg ttctggattt cctgtggtgt 9780tggaggtgag cagtgtagtt ctgatgtttg ttttggtggt gttgatggtt ggcttttctg 9840tgggcctggt ggtaagtgct tcctttggtt ttgtggtttg aggtttgaga tcttttttgg 9900ttgtcttgat ggttggtttt cttgtgggct tggtggtggt tttctttcca ggttttttgt 9960ttggtattct tttgcagatg gcccagcaag ttggattgtt gctgcatatg ctgcagggta10020caaagttgaa cacttcaaag tgaaaatcat tatttggttt gttttgtggt ttgttttggc10080gttgttttgt ggtgggcttg ctgggttgta tttgggttgt tgttgtgttt ttggtcttga10140ctgttgtgga ttgtggggtt gacttagcac ttggtgttgt tgaagctagt gtggtggtgg10200gttgtgatgt agtttcggac agattggaga ggctgattcc aagctgggga ttctgggtga10260ggtatgttgg ggttgtgttc ttgatctggt ttgttgcatc ttgtatgatt gcagttgttg10320gtgtgacttt gtggtttgcc gaggctatga atatgatggc tgcaattata agtgaagttg10380agattatcat tgccaaaata gataatgtga tttgtgctat agatttaaga tttaacttgt10440ataagcacga tgatatgaat aatagatgat tgagagtgtc ccaagtcctt tctagtgtct10500tggcggcgcg ttggtccttg gttttggaca tgtttgcatt tgccccaatg ttgttgttgg10560tcttaatatt ttagttcatt gttatgacta ttttctaatt aactacttta tggtatagat10620gatggcttgc atggtgagac gttgatgtgg ttttgtgaag aggtgagggt agttcactta10680caaatgcaag gttactgttt tgagctatca gattggtgaa tgctatgtat tgactcgagc10740tcttggtagc tcaaaggttt tgttatggaa tatgttatat tcgcagagtt tgtttagtat10800tgcaatcatg atggagatta tgattagcaa agagattatt gttgttatca tgtgtattag10860tgtaaagtaa ggccagaatt tgcttgagaa ttctattgtt atggatgtat tttccattgg10920ttgattttgt ctaatgtgtt gactagtcta tgttgacaga tgttgtgatt agttggattc10980ctctcaatga ttatttgccc catgtggatt ttttattaac ttatttgagt actggatctg11040
atgaacaatg acttgggatg atctgagact cctgatgagt tttgtttgat tggttgaacc11100acaaagggtt ggtgattacg attgtgaagt gaagaatgta ggtagaaagt ttgtatgaat11160caactcactg atgtagagga aaaaggttaa tcttccatgg gtttgattgc aaatcgtgta11220gctgtgtgct tccaatttgt tgtaacataa tatatacttt ctttttctaa gtaagctcca11280agatctacta tgaattgact ttgtggcttt atgtatttga atgctccttt gttgtcagtc11340actgtgatga ctaacagtaa tcctgagtaa gggatgattt ttgcatttgt aatagcattt11400ttgaattcag tggttgttat attttcaagt gtgttcagat ctttatttct gacactgatg11460gatctcaggt atgttggtat tatgactttt tttgatgtta ctatattttc aaattcacat11520aaagcaatga tgtcatgtgt tgggttgagt gttttcatag tgagatcttt aactgtagtt11580aacatatttt ttgattttag gcatgttaga ctgcatgcct taatttcaca gggtgtggtt11640acatcatatg ccagcttgct tctttcatcc aaggacacat tggcacatat ggtaaatttg11700ctgggcattt gcgctagcac tgcacttctt gagtttatca tgactcttaa tgatggtccc11760ttgggtgtgg atatttgttt cactagtata ttgacattgg ctagttcttt tataagtaaa11820tctgctggca tggatgattg gaacatgggc acccatattg taagtgatgc aggatcatcg11880tctttttcta ggacattgta ttgaacagca gctgtgtatg tggagccctc gtgaagtttg11940ttcacgtatg tttccatatt tgccccatct ttttttgtaa ctatagtatc gattttttcc12000gggtggctag ttttggattg gctggttgtt tttttggctg gttggctaat cggcaaatgg12060atgtttggtt ggatgggtga attggtttgt ttgttagtct tctattgatg ttgtgttttg12120atgtgcagat aggtagctaa tcagaaatct tcaagtgata gatcattgtc actatcattc12180ccttccaaca ggttgttcaa tttttctgat gttggattga gagacacttc atctgatgtg12240tcttttgcca tcttttcact ttcctcattc ctgagtctcg ccatagcttc tagtctgtca12300ttggtcatta atgcttcagt tctgattttt tctatcattt cttctcttaa accaaccatg12360gcatctctta taccatcccg agcagatgta ggtcctgcac tcgctactac taatgtgtga12420agcattccta gtatttcact taatttctca tcaatcctat ctaatcttgc tgttatatta12480tcgtttgtct ggtcattaat ttcttcatat gaatagctag attcttcttc attgttatca12540aatgtttcta tggtttcttt gtatagtttt gaaaagggat tatcacttgg cgtagggtct12600tctttgaaac ttactagagg ttttctttga taattgggct tgttccctac agtatcatct12660gtctcattta ttgggtttat aatggttgaa tttgatgtta tagggctttc tttggttact12720tctatatcta ttgagttgac agatatgata ctatcttttt tcttgggatc tttgggtgat12780gtgaatttgc cctttattga ttctaggaat ttggtggctc tgttgtttgc atcttctcca12840tggaattcag gagcaaactt ttccatgatg ttttatttgc cccatttttt ttattaactc12900aaagctctac atcattatct tttggattaa gttgatgttt gatagcctct agttcttctg12960ctgtcaagtc taatacactg tagttaatca caccattttc tttgagttgt tcagcatatg13020
cttttgcagc atcatataga tcttgattcc ttggtgtacc tctgtattct cccattatgc13080ctaggccagc agcattgcct aatactacac tagagaagtg aggaaattga gtcaaagata13140ataatgatgc ttttgggttg ttcaatatat ggtagaatcc tgcttctcca cccaattttt13200gggcatattc atacacctcc acaacctgtt ccatttctgc ttgcacacta gcgtgtccta13260acataatatt tttaactgat tttgctaaga ccccccaccg taacatcact tgccctgcac13320cataggcatt cataaacaat cctgcaaaga tcccttcaac tctactgcca cctctggtag13380aagattgtgc tataccaaaa tgaacaaaaa catctataaa gtgaggatat ttttcaaaca13440cttcatagaa gctgtttgct atatccttgg gtagtaagcc tttataacgt ttcatttcat13500tttttaagac attattagct ctcctaatca cagctgtaag accagatcta tcccctgctg13560ctaatttggt tattactaat gccgctatac ataatattat catcccacaa tcaggagagt13620catgcctgta ttctggagcc acctctccca tttcttttag catttttttg taggattttc13680tagattctat ctcaatgttg atttgaattt cagttgttaa gcttgctaat gttaacactt13740caaatttcat ttctttccca ttaatgtctt gacgatgtgt tgttacatcc actccatttg13800ctttaacatg atatcccgca tctttgagta tttttatggt gtcttctctt cctaatctag13860acatagcata taacatacct attaacccag tgaatttatg attagcatct tctgtgatta13920atagcatgcc acatagcttg ttgatgtgtt tctgcacatc ataattagga gtgtcaatgc13980tatctcctgt gctccgttgg atagtgtatt tgctggatga cagaagttga tctttgttga14040gtgtatcatt caacttgact ttgctaagag ccatttttgt atttgcccca tctttcatct14100tatgtctctc cttaatttta aattactata attttcaggc tccatttgga ctatggagtg14160tgattgtgca tgaagttatt atttcagatt gtttgaatct tgttttgaaa ttcatggatt14220gagatcatac ttgtatatta tgggtgtgtg cttagtaggc ttaatgccaa tgcattctaa14280gaacccatca tgattgataa atattggcat agggaaagtg ccatattttg tgttgtattc14340agtatatttt ttatatttag tgcttcccac tttgtgcaat agtttcattt catagttgac14400caggaatgta aatgtggcct gtctttcatc aagttttctc actatgcatt catgatttat14460caagtatata aatctatgtg ttatgatgtc tctggttagt gatgttatta tagtctcaag14520tgacaatggt ctcatgtcag tgatcatcag tctttgtggt gtggtatcat tgtgtgttgt14580gtccatggtt gggtcagctt agttgattta tttgccccat ttttatcttc tgtcaagttt14640tatattaact aatggtgtta gtgacattga tttgctagtt gatatttatt ataatttatg14700gattaaggtc aaatccaagt aattcagata attgattcat ataattggtc attgttgaat14760cacttagttt tttggagaat ttaatttcac aattgtcatc tattaggcca ttaggttgag14820agcaatgcgt taattccatc atttcccata tataacctcc attttgtaat actggcattg14880ttgtgaagtt ggatttcact acaatattat tattagggca aatatcacta cttgtaataa14940
catgcacaaa tacaatgcca ttcaatttaa ttgtatgtat aactgcctta gccaaagcat15000tagttaactg tattaatttg tcagtatagc atgttatttt taacaatgct acttcatcat15060tgtcaaacaa attttgcaat ctaactttta tcatactcaa tgagttgctg cccatctcta15120accaaaggag taaaatttaa gtggtactta tcaaattctt atttgcccca tttttttggt15180ttacgcaagt ttgttgtacg cattttttcg cgt 15213210221147212DNA213Artificial220
221misc_feature223oligonucleotide4002aattggtacc taatacgact cactataggg acgagaaaaa aagtgtc 47210321127212DNA213Artificial220
221misc_feature223oligonucleotide4003ttaaacgcgt catcaaacta ttaactc 27210421129212DNA213Artificial220
221misc_feature223oligonucleotide4004aattacgcgt taagcattag gattgagtg 29210521133212DNA213Artificial220
221misc_feature223oligonucleotide4005ttaaggatcc gcgcgctatt attgcaaaaa gcc 33210621127
212DNA213Artificial220
221misc_feature223oligonucleotide4006aattgcgcgc tttttaatga ctactgg 27210721138212DNA213Artificial220
221misc_feature223oligonucleotide4007ttaaggatcc gtacgttggg gcaaatgcaa acatgtcc 38210821128212DNA213Artificial220
221misc_feature223oligonucleotide4008ttaacccggg gcaaataaaa catcatgg28210921146212DNA213Artificial220
221misc_feature223oligonucleotide4009aattcgtacg tattgttagt cttaatatct tagttcattg ttatga462101021132212DNA213Artificial220
221misc_feature223oligonucleotide40010aattcccggg atttttttta ttaactcaaa gc 322101121143
212DNA213Artificial220
221misc_feature223oligonucleotide40011ttaaacctgg taagatgaaa gatggggcaa atacaaaaat ggc 432101221138212DNA213Artificial220
221misc_feature223oligonucleotide40012aattggatcc accaggtctc tccttaattt taaattac 382101321165212DNA213Artificial220
221misc_feature223oligonucleotide40013aattcttaag ggaccgcgag gaggtggaga tgccatgccg acccacgcga aaaaatgcgt 60acaac 652101421128212DNA213Artificial220
221misc_feature223oligonucleotide40014gtccgacctg ggcatccgaa ggaggacg282101521126212DNA213Artificial220
221misc_feature223oligonucleotide40015acgtcctcct tcggatgccc aggtcg 26
2101621168212DNA213Artificial220
221misc_feature223oligonucleotide40016tcgtccactc ggatggctaa gggaataacc ccttggggcc tctaaacggg tcttgagggg 60ttttttgc 682101721171212DNA213Artificial220
221misc_feature223oligonucleotide40017ggccgcaaaa aacccctcaa gacccgttta gaggccccaa ggggttattc ccttagccat 60ccgagtggac g 712101821129212DNA213Artificial220
221misc_feature223oligonucleotide40018ttaactcgag ttattcatta tgaaagttg 292101921127212DNA213Artificial220
221misc_feature223oligonucleotide40019aattggtacc gggacaaaat ggatccc 272102021127212DNA213Artificial220
221misc_feature223oligonucleotide
40020ttaatctaga ttgtaactat attatag 272102121131212DNA213Artificial220
221misc_feature223oligonucleotide40021aattggatcc ggggcaaata aatcatcatg g312102221129212DNA213Artificial220
221misc_feature223oligonucleotide40022aattggatcc ggggcaaata caagatggc 292102321131212DNA213Artificial220
221misc_feature223oligonucleotide40023ttaactcgag attaactcaa agctctacat c312102421131212DNA213Artificial220
221misc_feature223oligonucleotide40024aattggatcc ggggcaaata tgtcacgaag g312102521134212DNA213Artificial220
221misc_feature223oligonucleotide
40025ttaatctaga tcaggtagta tcattatttt tggc 342102621126212DNA213Artificial220
221misc_feature223oligonucleotide40026ttaatctaga agtaactact ggcgtg 262102721144212DNA213Artificial40027aattggatcc ggggcaaata caaacatgtc caaaaacaag gacc 442102821132212DNA213Artificial220
221misc_feature223oligonucleotide40028aattccatgg ggtccaaaac caaggaccaa cg 322102921131212DNA213Artificial220
221misc_feature223oligonucleotide40029aaaagtatac ttaatgtgat ttgtgctata g312103021144212DNA213Artificial220
221misc_feature223oligonucleotide40030ttttgtatac tggcagctat aatctcaact tcacttataa ttgc 44
2103121127212DNA213Artificial220
221misc_feature223oligonucleotide40031aatttctaga tttttaatga ctactgg 272103221131212DNA213Artificial220
221misc_feature223oligonucleotide40032ttaatctaga cgttacgcga acgcgaagtc c312103321141212DNA213Artificial220
221misc_feature223oligonucleotide40033aattaagctt accatggaca cgattaacat cgctaagaac g 4權利要求
1.一種包含病毒基因組的肺病毒的病毒體，其中所述的病毒基因組在編碼肺病毒感染性所必需的蛋白質的基因中存在突變，其中該突變導致僅由該病毒基因組產生的病毒缺乏感染性，並且其中該病毒體包含病毒體感染性所需形式和量的所述蛋白質。
2.根據權利要求1中所述的病毒體，其中肺病毒是呼吸道合胞病毒。
3.根據權利要求1或2中所述的病毒體，其中該基因編碼G附著蛋白。
4.根據權利要求1-3中任一項所述的病毒體，其中突變導致僅由該病毒基因組產生的病毒缺乏所述蛋白質。
5.根據權利要求1中所述的病毒體，其中突變包括缺失編碼所述蛋白質的序列。
6.一種生產肺病毒的病毒體的方法，該病毒體包含在編碼肺病毒(體內)感染性所必需的蛋白質的基因中存在突變的病毒基因組，其中該突變導致僅由該病毒基因組產生的病毒缺乏感染性，並且其中該病毒體包含病毒體感染性所需形式和量的所述蛋白質，該方法包括步驟(a)用包含存在所述突變的病毒基因組的肺病毒感染第一宿主細胞培養物，其中宿主細胞包含可指導所述蛋白質以病毒體感染性所需的形式和量在宿主細胞中表達的表達載體；和(b)從感染的宿主細胞培養物中回收病毒體。
7.根據權利要求6中所述的方法，其中生產用於感染第一宿主細胞培養物的肺病毒的方法包括步驟(a)給第二宿主細胞提供可指導下列物質在宿主細胞中表達的一個或多個表達載體(i)在編碼肺病毒(體內)感染性所必需的蛋白質的基因中具有突變的病毒基因組RNA，其中該突變導致僅由該病毒基因組產生的病毒缺乏感染性；(ii)肺病毒聚合酶複合物和任選地一種或多種另外的病毒蛋白質；和(b)培養所述第二宿主細胞從而產生病毒體。
8.根據權利要求7中所述的方法，其還包括使用與第二宿主細胞相同或不同的宿主細胞，通過一或個種另外的細胞感染步驟，擴增由第二宿主細胞產生的病毒體。
9.根據權利要求7或8中所述的方法，其中從在噬菌體DNA依賴性RNA聚合酶啟動子的控制下的病毒DNA拷貝轉錄所述病毒基因組RNA，並給所述宿主細胞提供在宿主細胞中指導噬菌體DNA依賴性RNA聚合酶表達的表達載體。
10.根據權利要求9中所述的方法，其中噬菌體DNA依賴性RNA聚合酶是T7、T3或SP6聚合酶。
11.根據權利要求7-10中任一項所述的方法，其中肺病毒聚合酶複合物至少包含L、P、N蛋白。
12.根據權利要求7-11中任一項所述的方法，其中一種或多種另外的病毒蛋白質是肺病毒基質膜蛋白，優選是M2-1蛋白。
13.根據權利要求6-12中任一項所述的方法，其中肺病毒是呼吸道合胞病毒。
14.根據權利要求6-13中任一項所述的方法，其中編碼感染性所必需的蛋白質的基因是編碼G附著蛋白的基因。
15.一種組合物，其包含如權利要求1-5中任一項所述的病毒體或如權利要求6-14中任一項所述的方法中可得到的病毒體，以及藥學上可接受的載體。
16.根據權利要求1-5中任一項所述的病毒體在製備用於預防或治療肺病毒感染的藥物中的用途。
17.根據權利要求16中所述的用途，該藥物是適於鼻內施用的製劑。
18.一種用於預防或治療肺病毒感染的方法，包括步驟以預防或治療感染的有效量給對象施用包含如權利要求1-5中任一項所述的病毒體的組合物。
19.根據權利要求18中所述的方法，其中所述組合物通過鼻內施用。
全文摘要
本發明涉及包含病毒基因組的肺病毒的病毒體，其中所述病毒基因組在編碼肺病毒感染性所必需的蛋白質的基因中存在突變，其中該突變導致僅由該病毒基因組產生的病毒缺乏感染性，並且病毒體包含病毒體感染性所需形式和量的所述蛋白質。本發明涉及生產肺病毒的病毒體的方法，和涉及在預防或治療肺病毒感染和疾病中使用該病毒體的方法。優選的肺病毒病毒體是呼吸道合胞病毒的病毒體，優選其中G附著蛋白基因被失活並反式互補。
文檔編號A61K35/76GK1922309SQ200480042063
公開日2007年2月28日 申請日期2004年12月24日 優先權日2003年12月24日
發明者威廉·盧伊特傑斯, 邁拉·努爾利·維佐約阿特莫佐 申請人:由衛生福利和體育大臣代表的荷蘭王國