一種用於基因序列差異測定的方法
2023-05-28 02:00:21 2
專利名稱：一種用於基因序列差異測定的方法
技術領域：
本發明屬於一種用於遺傳分析的檢測方法，涉及一種用於基因序列差異測定的方 法，具體來說是一種通過連接反應，將一對含有鹼基序列標籤的探針連接起來，然後通 過核酸擴增反應和測序反應來測定基因序列的差異。用於檢測基因組序列中的單鹼基多 態性，拷貝數差異，DNA片斷的重複與缺失。
背景技術：
隨著人類基因組序列的完成，人的遺傳基因序列差異與疾病的易感性和藥物的敏感 性的關係已經越來越清楚。基因序列的差異主要包括單核苷酸多態性(SNP)、序列重 復和序列缺失，其中單核苷酸多態性是指基因組DNA中某一特定核苷酸位置上發生轉 換、顛換、插入或缺失等變化。基因序列重複和缺失指一段基因的部分序列、 一種基因 的某個外顯子序列、某種基因的全部序列、甚至整個一組染色體序列的重複或缺失，例 如60%以上的杜氏肌營養不良(DMD)是由於DMD基因中一個或多個外顯子的缺失和 重複；又如PPARG基因中外顯子的重複與缺失與II型糖尿病高度相關；X-連鎖隱性遺 傳的腦白質營養不良病(Pelizaeus-Merzbacher病)是Xql3-q22染色體上蛋白脂蛋白基 因序列重複所致。
SNP具有數量多、分布廣和穩定遺傳等特點，是決定人類疾病易感性和藥物反應差 異的重要遺傳因素。通常認為SNP只有兩種類型，即雙等位基因(biallelic)。因此，在 對已知突變位點檢測時只需對SNP進行兩種不同類型鹼基的確認分析，而無需對DNA 片段進行全序列測定。目前用於基因序列差異分析的技術主要集中在SNP分析，發展 了許多SNP檢測技術，它們主要基於以下四種基本原理(l)等位基因特異性雜交；(2) 內切酶酶切技術；(3)引物延伸法；(4)寡核苷酸連接反應。其檢測系統也發展很快， 測定雷射誘導螢光是檢測SNP最為常用的方法，有許多檢測系統都採用了螢光檢測的 原理，如平板讀數儀、基因晶片和微球陣列技術等。為了實現特異性SNP檢測，螢光 共振能量轉移和螢光偏振是常用的兩種信號指示系統，被多種檢測平臺成功利用。除了 螢光檢測平臺以外，質譜儀也被廣泛用於SNP的檢測。但這些方法的價格昂貴，新發
展的焦測序(pyrosequencing)技術採用生物發光為檢測平臺，在進行DNA序列分析時不 需要電泳，不需要螢光標記，可以直接測定引物後面的鹼基序列，定量性能好，結果準 確，可實現自動化，是一種較好的SNP分析工具，但測定通量較低。
與SNP測定相比，基因序列的重複和缺失的測定方法較少，主要有螢光原位雜交法 (FISH)和比較基因組雜交法(CGH)等。但這些方法費時、費力；難於檢測單個基因 外顯子的重複和缺失；也難以實現多重檢測，測定樣本通量很低另外需要大量的樣本 量。雖然採用PCR擴增技術可以檢測基因序列的缺失，但難以檢測大片段序列的重複； 實時螢光PCR可以檢測序列的重複，但一次只能測定一個樣本。目前尚未有一種簡單、 方便、通量高、成本較低、且能同時測定多種鹼基序列變化的方法。
發明內容
本發明針對上述不足之處，提供一種基因序列差異測定的方法。該方法不採用螢光 標記的方法，而採用核酸標記連接探針的方法，可實現在單管中同時檢測多個(2-50個) 基因序列差異(含單鹼基多態性、序列重複和缺失)。
一種用於基因序列差異測定的方法，包括下列步驟a.將多對含有鹼基序列標籤的 探針與待測基因序列雜交；b.在連接酶的作用下，通過連接反應將步驟a中的每對相鄰 探針連接在一起；c.採用擴增反應擴增步驟b得到的連接反應產物；d.採用測序技術 測定步驟c中擴增產物中的序列標籤；e.以步驟d中測得的序列及各序列相應的信號強 度分析基因序列的差異。
所述的用於基因序列差異測定的方法，其中連接反應是指與待測模板互補的兩相鄰 探針的5'端和3'端連接起來的反應。
所述的用於基因序列差異測定的方法，其中探針是指含有兩部分序列， 一部分與待 測模板序列互補， 一部分與待測模板序列不互補。
所述的用於基因序列差異測定的方法，其中鹼基序列標籤是指一段含有待測模板位 置特異性的編碼序列或者指一段含有待測模板序列差異特異性的編碼序列。
所述的用於基因序列差異測定的方法，其中鹼基序列標籤是指一段含有DNA擴增 用引物特異性的序列。
所述的用於基因序列差異測定的方法，其中序列差異是指基因組序列中的單鹼基多 態性，或拷貝數差異，或DNA片斷的重複與缺失。
所述的用於基因序列差異測定的方法，其中擴增反應是指滾環擴增技術(RCA), 聚合酶鏈式反應(PCR)、鏈替代擴增(SDA)、連接酶鏈式反應(LCR)和依賴核酸序
列的擴增(NASBA)。
所述的用於基因序列差異測定的方法，其中測序技術是指基於生物發光反應的焦測 序技術。
所述的用於基因序列差異測定的方法，其中每對相鄰探針是指每兩條探針與待測模 板基因序列雜交後，其中一條探針的3'端與另一條探針的5'端緊密相鄰。 所述的用於基因序列差異測定的方法，其中多對是指2對至50對探針。
本發明的有益效果
本發明提供的方法可在一管中用多對探針同時測定多個目標基因序列的差異，並且 不要採用螢光染料標記，只需採用不同的序列來標記探針，類似於用不同顏色的螢光標
記，當樣本中含有某種待測DNA序列時，在連接酶的作用下，帶有序列標籤的兩條探 針就會發生連接反應，連接反應完成後採用一對引物擴增連接產物。可以添加多對探針 用於檢測多個位點的序列差異，如10-重SNP加上IO個外顯子的重複和缺失的檢測。 由於採用序列解碼測定信號，不採用電泳分離不同長度的序列，故測定用探針很短，可 以很容易合成。
圖1是基因序列差異測定的方法原理圖。 圖2是單鹼基多態性的測定結果。 圖3是基因拷貝數的測定線性關係。 圖4 Y染色體的AZF區域缺失的檢測結果。
具體實施例方式
以下通過實施例對本發明作進一步的闡述。
如圖l所示，本發明一種用於基因序列差異測定的方法分的測定步驟如下 (1)採用鹼基序列標記法，使得不同的靶標被標記上不同的序列
首先根據待測模板A和B的基因序列1和2，分別設計一對探針3， 4 (對應於模 板l)和一對探針5， 6 (對應於模板2)。每條探針由兩部分組成， 一部分與模板互補。 另一部分含有與模板不互補的序列。在每對探針中有一條探針的5'端與另一條的3'端緊 密相連，當有模板存在時，在連接酶7的作用下發生連接反應；探針3和4中的X為不 與模板互補序列，與後續PCR反應的引物相同；探針4和6中與模板不互補的序列由 三部分組成，序列Y(如圖所示)，及序列A和B，其中序列Y與後續PCR反應的引物 互補，序列A和B為序列標籤，不同的靶標含有不同的序列A和B，為了保持PCR擴
增反應的效率，將序列A和B分別設計成鹼基序列排列不同，但鹼基的種類和數目相 同。序列B與待測模板的性質相關，在SNP分析中，序列B與等位基因類型對應，對 雙等位基因型來說，分別用序列B1和B2表示。在測定基因拷貝數時，Bl為參考序列， Bl為待測序列。序列A與分析模板的位置對應，即多重SNP或多重基因拷貝數測定時， n重測定就要設計n種序列A。連接反應完成後，用一對通用引物8和9 (引物8的5' 端用biotin修飾，用於製備單鏈DNA模板)進行PCR擴增反應，不同靶標的PCR產物 長度相同，但標記有不同序列。PCR產物的序列長度也可以根據具體情況適當調整。 (2)基於焦磷酸鹽實時生物發光測序技術對擴增產物進行鹼基序列解碼 通過上述方法在單管中用一對引物同時擴增多個基因靶標，並且每種靶標都標記有 不同的鹼基序列A，如何將這些擴增產物進行解碼是個關鍵。本發明採用焦磷酸鹽實時 生物發光測定技術對擴增產物進行鹼基序列解碼，即先用鏈親和素修飾的微球製備單鏈 DNA 11和12，再加入測序引物13與之退火，弓l物13與序列A對應。最後分別依次加 入不同的dNTP進行焦測序反應。以下以基因序列差異的三種不同類型來說明本法的解 碼過程。
對單個SNP測定而言，序列A相同，序列B用於標記兩種等位基因，如用序列 "ATC"(序列B1)和"CTA"(序列B2)分別標記兩等位基因，當被測樣本的基因 型為純合子時，僅有序列B1或序列B2存在，在最後的焦測序結果中，僅出現單峰14 或峰15;當被測樣本的基因型為雜合子時，出現兩個高度相等的峰14和15。對n-重SNP 測定而言，可以用序列A標記不同位點的SNP，測序解碼時將單鏈PCR產物分成n份， 每份加入與序列A互補的測序引物13退火後測序，每種測序引物對應一管測序反應。 但當用ddNTP測序時，就可以通過連續加入不同的測序引物於同一管測序反應液中來 實現單管連續測序。
當測定某一基因拷貝數時，序列A相同，僅用序列B標記，Bl標記參考序列，B2 標記待測序列。當序列缺失時，僅出現一個峰14;通過比較測定結果中的峰15和14 的峰高來判斷基因拷貝數的多少。通過設計序列A，可有實現多重測定，對20個不同 的序列A來說就可以用序列A和序列B的組合標記60種不同的序列。
實施例l:與糖尿病相關的多重單鹼基多態性的測定 1.實驗材料
試劑基因組DNA,由病人血樣中提取；Ampligase (EPICENTRE); Taq DNA聚
合酶(TaKaRa Biotechnology Co.， Ltd); dNTPs(Promega， Madison， USA);引物LDR隱Pl: 5 ，-cat ctg ttc cct ccc tgt c-3'; LDR-P2: 5 ，-biotin-ccc cac ttc ttg ttc tct cat-3 ， (Invitrogen Inc.， Shanghai, PAGE級)；瓊脂糖(OXOID Ltd., Hampshire, England);凝膠電泳加樣液 和溴化乙錠(EB)均為Sangong生物公司產品。Dynabeads M-280-streptavidin (Dynal AS, Oslo,Norway)， lxB&W緩衝液(10mmol/LTris-HCl， l謹ol/LEDTA， 1.0mol/LNaCl， pH7.5 )， 0.1 tnol/L NaOH， lx退火緩衝液(10 mmol/L Tris-HCl, 1 mmol/L EDTA , pH8,0)， ImoI/LHCl.
儀器潔淨工作檯(VD-650-U型，蘇州安泰空際技術有限公司)；離心機(PMC-860 型，CAPSULEFUGE公司)；PCR擴增儀(PTC-225型，MJ Research公司)；高壓電源 電泳儀(Power PACIOOO， BIO-RAD，美國)；電泳槽(實驗室組裝)；凝膠電泳成像 儀(ChemilmagerTm型，AlpaHa Innoteach公司，美圓)。焦測序儀(實驗室組裝)。
2. 實驗步驟
連接反應lO)al反應體系中含有genome (100~500ng ),探針混合物(50 fmol of each ), Ampligase 1U， 20mM Tris-HCl (pH8.3) ， 25 mM KCl, 10mM MgC12, 0.5mM NAD， 0.01%Triton X-IOO。反應條件為98°C預變性5min;然後95'C變性lmin， 60°C退火、 連接4min ，進行10個循環。
聚合酶鏈反應25pl反應體系中含有引物(200nM)， Tris-HCl (pH8,3) UOmM)' KCl (50mM)， MgC12 U.5mM)， dNTPs (0.2mM)， rTaq酶C0.75U)。反應條件為 95°C預變性5min;然後以95。C30s、 60°C lmin，進行35個循環。
焦測序首先製備單鏈，第一步，取1/10 PCR體積的磁性微球，用磁鐵吸棄上清， 用B&W緩衝液洗滌2次，懸浮於適量B&W緩衝液中；將PCR產物與磁性微球混合， 置37。C中振搖lh;吸棄上清，水洗滌2次，加入20pL的0.1moI/L的NaOH混勻，放置 5min;吸棄上清,再用0.1 mol/LNaOH洗滌一次後用B&W緩衝液洗滌2次；加入10pL 的lx退火緩衝液和lOpmol的退火引物，95'C預退火30s，然後55。C退火3min。在測 序模板中加入測序反應液，依次加入dGTP、 dCTP禾n dTTP進行測序反應。
3. 實驗結果
在一管中同時測定了四種與糖尿病相關的SNP位點，分別是PPAR基因的C1431T 位點，PPAR基因的C2821T位點，PPARG基因的Pro 12Ala位點，SUR1基因的Arg 1273Arg 位點。圖2是測定三個典型基因組DNA樣本的部分結果，即PPAR基因的C1431T位 點的測定結果。當測定圖譜中只有代表野生型的峰16時，表明待測樣本PPAR基因的
C1431T為野生型；當測定圖譜中除有代表野生型的峰16外，還有峰n，表明待測樣本 PPAR基因的C1431T位點為雜合子；當測定圖譜中只有代表突變型的峰17時，表明待 測樣本PPAR基因的C1431T為突變型。
實施例2:基因拷貝數的測定
為了證明本發明方法的定量特性，進行了拷貝數的測定。測定步驟與實施例1相同。 即以p-actin基因的exon 1為參考序列，測定BRACA1基因exon 1的拷貝數。為了證明 方法的定量特性，首先用PCR擴增法製備不同濃度的P-actin基因的exon 1片段和 BRACA1基因的exon 1片段，然後將兩者按照不同濃度混合。如圖3所示，當BRACA1 基因的exonl模板濃度與P-actin基因的exonl模板的濃度比分別為O， 1， 2， 3， 4， 5， 6時，測定信號強度與濃度比成較好的線性關係，直線18的相關係數為0.9995。即可以 測定拷貝數為5的樣本。
實施例3 : Y染色體的AZF區域缺失的檢測
Y染色體的AZF缺失是造成男性無精、少精的重要因素，從基因水平對Y染色體 in-terval6的多個序列標籤位點(STS)進行缺失篩査對於胞漿內體外受精治療男性不育 具有重要意義。採用本發明的方法測定了8個STS標籤SYR， SY86， SY127, SY134, SY132, SY152, SY254, SY255。測定時仍以P-actin基因的exon l為參考序列，分別設 計8對探針與上述8個STS位點的序列互補，測定步驟與實施例l相同。測定結果如圖4所 示，對樣本1來說，無缺失；對樣本2來說，SY152， SY254和SY255缺失。
〈110〉周國華
<120〉 一種用於基因序列差異測定的方法 <160〉 2
<210〉 1 〈211〉 19 〈212〉 DNA 人工序列 <220〉
〈223>探針 〈400〉 1
catctgttcc ctccctgtc 19
〈210〉 2 21 〈212〉 DNA 人工序列 〈220〉
<223〉探針 〈400〉 2
ccccacttct tgttctctca t 2權利要求
1、一種用於基因序列差異測定的方法，其特徵在於包括下列步驟a.將多對含有鹼基序列標籤的探針與待測基因序列雜交；b.在連接酶的作用下，通過連接反應將步驟a中的每對相鄰探針連接在一起；c.採用擴增反應擴增步驟b得到的連接反應產物；d.採用測序技術測定步驟c中擴增產物中的序列標籤；e.以步驟d中測得的序列及各序列相應的信號強度分析基因序列的差異。
2、 如權利要求1所述的用於基因序列差異測定的方法，其特徵在於連接反應是指 與待測模板互補的兩相鄰探針的5'端和3'端連接起來的反應。
3、 如權利要求1所述的用於基因序列差異測定的方法，其特徵在於探針是指含有 兩部分序列， 一部分與待測模板序列互補， 一部分與待測模板序列不互補。
4、 如權利要求1所述的用於基因序列差異測定的方法，其特徵在於鹼基序列標籤 是指一段含有待測模板位置特異性的編碼序列或者指一段含有待測模板序列差異特異 性的編碼序列。
5、 如權利要求4所述的用於基因序列差異測定的方法，其特徵在於鹼基序列標籤 是指一段含有DNA擴增用引物特異性的序列。
6、 如權利要求1所述的用於基因序列差異測定的方法，其特徵在於序列差異是指 基因組序列中的單鹼基多態性，或拷貝數差異，或DNA片斷的重複與缺失。
7、 如權利要求1所述的用於基因序列差異測定的方法，其特徵在於擴增反應是指 滾環擴增技術，聚合酶鏈式反應、鏈替代擴增、連接酶鏈式反應和依賴核酸序列的擴增。
8、 如權利要求1所述的基因序列差異測定方法，其特徵在於測序技術是指基於生 物發光反應的焦測序技術。
9、 如權利要求1所述的用於基因序列差異測定的方法，其特徵在於每對相鄰探針 是指每兩條探針與待測模板基因序列雜交後，其中一條探針的3'端與另一條探針的5' 端緊密相鄰。
10、 如權利要求l所述的用於基因序列差異測定的方法，其特徵在於多對是指2對 至50對探針。
全文摘要
本發明提供了一種用於基因序列差異測定的方法。該方法包括下列步驟a.將多對含有鹼基序列標籤的探針與待測基因序列雜交；b.在連接酶的作用下，通過連接反應將步驟a中的每對相鄰探針連接在一起；c.採用擴增反應擴增步驟b得到的連接反應產物；d.採用測序技術測定步驟c中擴增產物中的序列標籤；e.以步驟d中測得的序列及各序列相應的信號強度分析基因序列的差異。該方法簡單、方便、通量高、成本較低、且能同時測定多種鹼基序列變化的方法。
文檔編號C12Q1/68GK101386883SQ20071013145
公開日2009年3月18日 申請日期2007年9月10日 優先權日2007年9月10日
發明者周國華 申請人:周國華