Aβ靶向的重組脂蛋白納米藥物載體及其製備方法和應用的製作方法

2023-05-27 22:07:56 3

Aβ靶向的重組脂蛋白納米藥物載體及其製備方法和應用的製作方法
【專利摘要】本發明公開了Aβ靶向的重組脂蛋白納米藥物載體及其製備方法和應用。Aβ靶向的重組脂蛋白納米藥物載體由脂質、載脂蛋白和藥物組成，所述藥物是針對阿爾茨海默病的治療或診斷藥物，包括小分子化學治療藥物，大分子多肽、蛋白、基因治療藥物及診斷藥物中的一種或者多種。本發明藥物載體的構建解決了天然脂蛋白來源稀缺、製備繁瑣、質量可控性不強等缺點，其應用為阿爾茨海默病診療藥物遞送提供新的更為有效和安全的解決方案，具有重要的研究價值和臨床應用前景。
【專利說明】Αβ靶向的重組脂蛋白納米藥物載體及其製備方法和應用

【技術領域】
[0001] 本發明涉及化學製藥領域，尤其涉及Α β靶向的重組脂蛋白納米藥物載體及其制 備方法和應用。

【背景技術】
[0002] 阿爾茨海默病（Alzheimer's Disease，AD)是最常見神經退行性疾病，其發病率隨 年齡增高，65歲以上人群發病率為7?10%，85歲以上人群高達47%。AD已成為繼心腦血管 疾病、惡性腫瘤之後威脅老年人健康的第三大疾病。隨著人口老齡化進程的加劇，該類疾病 的發病率日益上升。據統計，目前全球有AD患者3560萬，我國600萬，隨著人口的老齡化， 預計到21世紀中葉全球AD患者將達1. 15億。AD已成為人類健康和生存質量的嚴重威脅， 是日益嚴重的公共衛生問題。
[0003] AD的主要病理特徵為細胞外β澱粉樣蛋白（β -Amyloid peptide, Α β ) 大量沉積形成的老年斑（Senile plaques, SP)及細胞內神經纖維纏結 (Neurofibrillarytangles，NFT)的形成。當前的研究明確Αβ是AD的核心致病物質，其 中Αβ寡聚體的神經毒性最強。Αβ在腦內過度產生和沉積，引起其周邊神經元突觸功能障 礙、Tau蛋白過度磷酸化、氧化應激和繼發炎性反應，導致神經元變性死亡，最終產生痴呆。 這就是目前最受公認的AD病因假說-Α β級聯假說（amyloid β cascade hypothesis)。 因此，Αβ已成為AD藥物幹預的重要分子靶點。
[0004] 目前AD藥物幹預仍面臨重大瓶頸：①血腦屏障（Blood brain barrier, BBB) 的存在使得98%以上具有潛在治療作用的化合物因難以進入中樞而遭到淘汰，因此如何 克服BBB的屏障作用，成功將藥物遞送入腦是實施AD治療的首要條件；②AD作為一種 進行性神經退行性疾病，有效幹預需長期重複給藥，而鑑於腦功能的複雜性和神經元對 損傷的敏感性，幹預藥物及其載體的安全性和靶向性至關重要。由於Αβ聚集體特別 是寡聚體介導的級聯反應是AD的核心病因，將藥物特異地遞送到腦內Αβ聚集部位是 提高療效、減少中樞副作用的關鍵。針對上述難點問題，一些研究者設計了具有Αβ靶 向特性的納米藥物載體，代表性載體有Α β i_42抗體修飾脂質體【The binding affinity of anti-Abetal-42MAb-decorated nanoliposomes to Abetal_42peptides in vitro and to amyloid deposits in post-mortem tissue[J] · Biomaterials，2011，32 (23 ):5489-5497.】、A β卜42修飾的超順磁氧化鐵顆粒【Detection of amyloid plaques targeted by USPI〇-Abetal_42in Alzheimer's disease transgenic mice using magnetic resonance microimaging[J] · Neuroimage，2011，55 (4):1600-1609.】和薑黃 素修飾的月旨質體【Curcumin-decorated nanoliposomes with very high affinity for amyloid-betal-42peptide[J].Biomaterials，2011，32(6):1635-1645.】等。然而，這些 載體都無法通過BBB，須腦室內注射或藉助頸動脈灌注甘露醇等侵入性手段入腦；而最具 代表性的可跨越BBB的納米藥物載體如轉鐵蛋白受體單克隆抗體0X26連接的空間穩定脂 質體【Brain drug delivery of small molecules using immunoliposomes. Proc Natl Acad Sci U S A. 1996, 93(24) :14164-14169.】、納米粒、囊泡【Preparation and brain delivery property of biodegradable polymersomes conjugated with 0X26. J Control Release. 2008,128(2):120-127.】等均不具備Aβ靶向特性。因此，發展能夠實現腦內Aβ 靶向的智能化納米藥物載體對AD的有效藥物幹預具有至關重要的作用。
[0005] 脂蛋白是一種天然納米載體(粒徑從5 - lOOOnrn)，其根據密度、結構和功能分為 乳糜微粒、極低密度脂蛋白、中間密度脂蛋白、低密度脂蛋白和高密度脂蛋白，在體內起轉 運脂類物質的作用。基於仿生學原理設計的重組脂蛋白納米載藥系統在克服天然脂蛋白 來源稀缺、製備繁瑣、質量可控性不強等缺點的同時，較其他納米載體具有明顯的優勢：模 擬內源性納米顆粒，可避免單核巨噬系統的識別和清除，具有較長的體內循環時間；生物相 容好，可完全被機體代謝利用且無免疫原性；含疏水內核、親水外殼，結構可調，可實現親 /疏水性和兩親性藥物多模式載帶；更為重要的是，通過調整脂質成分、載脂蛋白的種類、 比例和載帶藥物等因素，所構建載體的理化特性如粒徑、形狀、載藥量、釋藥行為，乃至體 內靶向遞藥特性可根據治療需要進行主觀調控，具有很強的靈活性。以ApoA I及其模擬 肽為載脂蛋白成分的重組脂蛋白已被用於肝臟【中國發明專利，申請號201210204166. 6】、 腫瘤【中國發明專利，申請號201210110187. 1】、動脈粥樣硬化【中國發明專利，申請號 201110102877. 8】等部位的靶向藥物遞送。但尚未見將重組脂蛋白納米藥物傳遞系統用於 革巴向腦內Αβ的藥物遞送研究。


【發明內容】

[0006] 本發明所要解決的第一個技術問題是，提供一種Αβ靶向的重組脂蛋白納米藥物 載體。
[0007] 本發明所要解決的第二個技術問題時，提供Α β靶向的重組脂蛋白納米藥物載體 的製備方法。
[0008] 本發明所要解決的第三個技術問題時，提供Αβ靶向的重組脂蛋白納米藥物載體 的應用。
[0009] 為了解決上述第一個技術問題，本發明提供了一種Αβ靶向的重組脂蛋白納米藥 物載體，其特徵在於，所述Αβ靶向的重組脂蛋白納米藥物載體由脂質、載脂蛋白和藥物組 成，所述藥物是針對阿爾茨海默病的治療或診斷藥物，包括小分子化學治療藥物，大分子多 肽、蛋白、基因治療藥物及診斷藥物中的一種或者多種。
[0010] 作為一個優選方案，所述載脂蛋白包括ApoE及其模擬肽、ΑροΑ-Ι及其模擬肽、 ΑροΑ-ΙΙ及其模擬肽、ApoC及其模擬肽中的一種或多種。所述載脂蛋白優選ApoE及其模擬 肽中的一種或多種。
[0011] 作為一個優選方案，所述Αβ靶向的重組脂蛋白納米藥物載體的粒徑範圍為 l-500nm，優選為 5-200nm。
[0012] 作為一個優選方案，所述Αβ靶向的重組脂蛋白納米藥物載體採用注射途徑給藥 或者鼻腔途徑給藥。
[0013] 作為一個優選方案，所述Α β靶向的重組脂蛋白納米藥物載體分散在藥劑學上可 以接受的緩衝溶液環境中，所述緩衝溶液包括HEPES緩衝液、生理鹽水、Tris緩衝液和磷酸 鹽緩衝液。
[0014] 為了解決本發明的第二個技術問題，本發明提供Αβ靶向的重組脂蛋白納米藥物 載體的製備方法，其特徵在於，當藥物是疏水性藥物和/或兩親性藥物時，脂質和疏水性藥 物和/或兩親性藥物通過常規方法製備脂質體，得到的脂質體與載脂蛋白共同孵育，通過 自組裝形成重組脂蛋白納米藥物載體；當藥物是親水性藥物時，脂質通過常規方法製備脂 質體，親水性藥物可以在自組裝前、中或後加入。
[0015] 作為一個優選方案，藥物質量佔處方含量0. 001-50%，脂質質量佔處方含量的 20-95%，載脂蛋白質量佔處方含量的5-80%。
[0016] 為了解決本發明的第三個技術問題，本發明提供了 Αβ靶向的重組脂蛋白納米藥 物載體在製備Αβ靶向藥物中的應用。
[0017] 本發明所述的脂質可以是天然磷脂(蛋磷脂、豆磷脂)、合成磷脂(磷脂醯膽鹼、磷 脂醯乙醇胺、磷脂醯絲氨酸、磷脂醯甘油、磷脂醯肌醇、磷脂酸、心磷脂、溶血磷脂)、鞘脂(鞘 氨醇、神經醯胺、鞘磷脂、腦苷脂、神經節苷脂)、膽固醇、膽固醇酯、甘油酯及其衍生物中的 一種或多種。
[0018] 所述的脂質體的製備方法採用薄膜水化法、注入法、復乳法、熔融法、冷凍乾燥法、 逆向蒸發法、高壓乳勻法或超聲法及Ca2+融合法。
[0019] 本發明的特點是模擬天然脂蛋白，構建重組脂蛋白納米藥物傳遞系統，藉助載脂 蛋白與腦毛細血管上的清道夫B I受體、低密度脂蛋白受體（LDLr)和低密度脂蛋白受體相 關蛋白-1 (LRP1)等結合，通過受體介導途徑轉運入腦，並通過載脂蛋白對Αβ的特異識別 和結合，實現腦內Αβ靶向藥物遞送。
[0020] 本發明的優點在於，①可通過受體介導的胞吞轉運途逕入腦；②可特異識別和結 合Αβ，將藥物靶向遞送至腦內Αβ聚集部位；③結構和粒徑的高度可調性，可載帶不同藥 物；④高度仿生，安全性好。本發明藥物載體的構建解決了天然脂蛋白來源稀缺、製備繁瑣、 質量可控性不強等缺點，其應用為AD診療藥物遞送提供新的更為有效和安全的解決方案， 具有重要的研究價值和臨床應用前景。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0021] 圖1為ApoE蛋白對腦毛細血管內皮細胞bEnd. 3細胞和前列腺內皮細胞ΥΡΕΝ細 胞攝取重組脂蛋白的影響，ApoE抑制組先加入ApoE抑制lh後，各組均加入等濃度重組脂 蛋白孵育3h，#*p〈0. 001表明與未加 ApoE的bEnd. 3細胞組存在顯著性差異。
[0022] 圖2為（A)125I-重組脂蛋白靜脈注射10, 30min，1，2, 4, 8, 12, 24h後不同腦區的放 射活性強度；(B) 1251_重組脂蛋白靜脈注射1，2, 4, 24h後腦實質、腦血管的放射活性強度百 分比。
[0023] 圖3為透射電鏡觀察重組脂蛋白與Αβ寡聚體的相互作用，（A)重組脂蛋白；(B) Αβ寡聚體；(〇Αβ寡聚體（0. 2μΜ)與重組脂蛋白（含磷脂醯膽鹼DMPC20yg/ml)室溫孵 育24h，2% (w/v)磷鎢酸負染，透射電鏡觀察。箭頭：Αβ寡聚體特異結合在重組脂蛋白兩 側，標尺：20nm
[0024] 圖4為表面等離子共振（SPR)檢測重組脂蛋白與（A) Α β單體、（Β) Α β寡聚體的相 互作用。
[0025] 圖5為載α-倒捻子素的重組脂蛋白⑷促進AD模型動物SAMP8小鼠的腦內Α β 清除，（B)減少小膠質細胞激活（CD-45陽性染色)。

【具體實施方式】
[0026] 下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。下述實施例中所使用的實驗方法如無 特殊說明，均為常規方法。下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業途 徑得到。應理解，這些實施例僅用於說明本發明而不用於限制本發明的範圍。下列實施例 中未註明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件，例如Sambrook等人，分子克隆：實驗室 手冊（New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的條件，或按照制 造廠商所建議的條件。
[0027] 實施例1重組脂蛋白的表徵和腦血管內皮細胞攝取
[0028] ⑴製備
[0029] 脂質(磷脂醯膽鹼DMPC/D0PC/DPPC+/-神經節苷脂GM1+/-膽固醇+/_膽固醇油酸 酯）（2-10mg)、藥物α-倒捻子素（(Xl-2mg)溶於一定比例氯仿-甲醇混合溶劑中，減壓旋 轉蒸發除去有機溶劑，脂膜加 lml Tris緩衝液(含10mMTris，0. 1M KCl，lmM EDTA，pH8.0脫 氣)水化，50° C水浴超聲1.5h。加不同pH和鹽組成的緩衝液稀釋至8ml，40° C水浴超聲。 ApoE3 (0. 5-5mg)保存於含6M鹽酸胍和5 μ 1/ (mg蛋白）β -巰基乙醇的100mM碳酸氫銨溶 液中（pH8. 0)。用前以合適的蛋白組裝緩衝液透析。10min內加入，繼續超聲50min。產品 冷卻至室溫，4° C過夜。0. 22μπι膜濾過，超濾濃縮(截留分子量lOKDa)。Superdex200凝 膠柱純化。4° C保存備用。
[0030] (2)表徵
[0031] 重組脂蛋白磷鎢酸負染，透射電鏡觀察形態。雷射粒度儀測定其粒徑和表面電位。 重組脂蛋白成分分析：螢光分光光度計測定包載螢光探針量；HPLC測定包載藥量；磷脂試 劑盒（Phospholipids C assay kit)測定磷脂含量；Bradford法測定蛋白含量，計算ApoE3 組裝效率。
[0032] (3)腦血管內皮細胞模型bEnd. 3細胞結合和攝取重組脂蛋白情況
[0033] 高內涵分析定量檢測重組脂蛋白的細胞結合：bEnd. 3細胞密度5000/孔接種於96 孔板，培養24h。吸棄原有培液，加入100μ 1載螢光探針的重組脂蛋白溶液，37° C孵育。吸 棄培液，加100 μ 1預熱至37° C的3. 7%甲醛溶液室溫固定10min。力口 100 μ 1 PBS洗3次， 5(^1!1〇6(*68七33432室溫避光孵育10111丨11染細胞核；20(^1?85洗3次。置燈116衍〇5。 &11 全自動高內涵藥物篩選分析系統下檢測。藍色螢光通道檢測細胞核，進行細胞計數；綠色或 紅色螢光通道檢測重組脂蛋白。每組3復孔，每孔檢測至少1000個細胞。
[0034] 結果如圖1所示，在低密度脂蛋白受體家族高表達的腦毛細血管內皮細胞系 bEnd. 3,重組脂蛋白的細胞攝取顯者商於不加載脂蛋白的對照脂質體LNC。在ApoE共同鮮 育情況下，重組脂蛋白的細胞攝取急劇下降，提示bEnd. 3通過ApoE介導的機制攝取重組脂 蛋白。而在低密度脂蛋白受體家族低表達的內皮細胞YPEN，重組脂蛋白的細胞攝取明顯降 低而不受ApoE影響，表明低密度脂蛋白受體家族參與介導重組脂蛋白的細胞攝取。
[0035] 實施例2重組脂蛋白的腦內遞送特性
[0036] ⑴製備
[0037] 稱取豆磷脂、蛋磷脂（2-10mg)、神經節苷脂GM1(0. l-5mg)放入500ml圓底燒 瓶中，加入2ml氯仿溶解，置於旋轉蒸發儀20°C，避光真空lh。在圓底燒瓶中加入2ml PBS溶液，37°C震搖至瓶內壁脂質膜全部水化脫落，放入40°C水浴超聲lh，加入ApoE或 ApoA-I(0. l-10mg)，37°C孵育 36h，4°C保存。
[0038] (2)放射標記定量測定重組脂蛋白靜注後在體內各組織和不同腦區的分布情況
[0039] 1251標記重組脂蛋白。昆明種小鼠24隻，隨機分8組，靜脈注射給予1251_重組脂 蛋白，分別於給藥後10, 30min，1，2, 4, 8, 12, 24h後處死動物，取全血、腦(左側半腦，分出皮 層、海馬、紋狀體等不同腦區)、心、肝、脾、肺、腎，組織稱重、放射性計數測定；加3倍量水 勻漿，加同體積10%三氯乙酸沉澱蛋白，取沉澱測定放射性計數，計算 1251_重組脂蛋白入 腦的％ID/g。取右側腦組織，加等滲HEPES緩衝液，置玻璃勻漿器勻漿10次，加右旋糖酐 溶液（26%，70kD)調節比重，勻漿3次，5400g，4 °C離心15min，分離腦血管和腦實質，分別 測定放射性計數，計算1251_重組脂蛋白進入腦實質的百分比。結果顯示，給藥lh後，各腦 區均有約0. 21%D〇se/g的ApoE-重組脂蛋白入腦（圖2)，該入腦量優於公認具有良好腦部 遞藥特性的轉鐵蛋白受體單克隆抗體0X26修飾的免疫脂質體（0. 03%D〇se/g)和乳鐵蛋白 (0. 016%D〇Se/g);另一側腦組織用於腦毛細血管扣除實驗，結果顯示80%以上1251_重組脂 蛋白放射性強度進入腦實質，而且隨著給藥時間延長，測得腦實質中 1251_重組脂蛋白放射 性強度百分比升高（圖2)，提示1251_重組脂蛋白被有效遞送入腦。
[0040] 實施例3重組脂蛋白與Α β _寡聚體的結合位點
[0041] (1)製備
[0042] 稱取磷脂醯膽鹼、磷脂酸（2-10mg)放入500ml圓底燒瓶中，加入2ml氯仿溶解，置 於旋轉蒸發儀20°C，避光真空lh。在圓底燒瓶中加入2ml PBS溶液，37°C震搖至瓶內壁脂 質膜全部水化脫落，放入40°C水浴超聲lh，加入ApoE或ApoA-I (0· l-10mg)，37°C孵育36h， 4°C保存。
[0043] (2)透射電鏡觀察重組脂蛋白與A β _寡聚體的結合位點
[0044] 20 μ g/ml重組脂蛋白與200ηΜ Αβ _寡聚體在37°C恆溫箱孵育24h，離心濃縮 至800 μ g/ml重組脂蛋白，同時分別以等濃度重組脂蛋白、Α β _寡聚體為對照，2%磷鎢酸 染色，透射電鏡觀察。如圖3結果所示，寡聚體與碟形重組脂蛋白共同孵育24h後， 寡聚體結合於重組脂蛋白側邊的載脂蛋白區域，表明重組脂蛋白上的載脂蛋白是 Α β 寡聚體特異結合的部位。
[0045] 實施例4重組脂蛋白的Αβ靶向結合親和力
[0046] (1)製備
[0047] 稱取2mg DMPC放入500ml圓底燒瓶中，加2ml乙醚揮幹，再加入2ml乙醚揮幹，以 除去磷脂中的水分，加入2ml氯仿，加入20μ llmg/ml Dil氯仿溶液，混勻，置於旋轉蒸發儀 20°C，避光真空lh。在圓底燒瓶中加入2ml PBS溶液，37°C震搖至瓶內壁脂質膜全部水化脫 落，放入40°C水浴超聲lh，探頭超聲減小粒徑。加入適量0. 2mg/ml ApoE/ApoA I蛋白PBS 溶液，37°C 50rpm孵育36h，4°C保存。
[0048] (2)表面等離子共振（Surface Plasmon Resonance, SPR)實驗驗證重組脂蛋白的 Αβ靶向結合特性
[0049] CM5晶片採用氨基偶聯的方式將Αβ單體或者寡聚體固定：在用0. 2MEDC和0. 05Μ NHS對晶片表面進行活化後，將Α β單體或者寡聚體稀釋於ρΗ4. 0醋酸鈉緩衝溶液中，使 Α β濃度為23 μ M，以30 μ 1/min的速度注入420s，再用pH8. 5的乙醇胺進行封閉。參比通道 活化後直接用乙醇胺封閉。親和力測試採用雙通道模式檢測：重組脂蛋白稀釋於PH7. 410mM PBS中，以30μ1/π?η的速度注入到參比通道以及固定了 Αβ的通道。接觸時間為100s 或300s，解離時間為400s。結果用Biacore T200Evaluation Softeware程序進行分析， 運用1:1結合模型計算親和力值。結果顯示，重組脂蛋白與Αβ單體（monomer)、寡聚體 (oligomer)均呈高親和力結合（圖4)，動態法計算其與Αβ單體、寡聚體的親和力常數KD 值，分別為3.65ηΜ和2.65ηΜ (與抗原、抗體親和力同一數量級)，與天然HDL與Αβ的親和 力（5. 7ηΜ)相似，表明重組脂蛋白可望具有良好的Αβ靶向特性。
[0050] 實施例5載小分子藥物重組脂蛋白對AD模型動物的疾病修飾作用
[0051] (1)製備
[0052] 脂質（DMPC/DMPE+/-GM1+/-膽固醇+/_膽固醇油酸酯)(2_10mg)、藥物α -倒捻子 素（α -Μ) (0. l-2mg) +/-薑黃素（0. l-2mg)溶於一定比例氯仿-甲醇混合溶劑中，減壓旋 轉蒸發除去有機溶劑，脂膜加lml Tris緩衝液(含10mM Tris，0. 1M KCl，lmM EDTA，pH8.0 脫氣）水化，50° C水浴超聲1. 5h。取lml ApoE3 (0· 5-5mg/ml) 10min內加入，繼續超聲 50min。產品冷卻至室溫，4° C過夜。
[0053] (2)載藥重組脂蛋白對AD模型動物的疾病修飾作用
[0054] 將10月齡AD模型小鼠 SAMP8小鼠分為生理鹽水組，空白重組脂蛋白組，載α-Μ 重組脂蛋白製劑組（〇· 5mg/kg ;2mg/kg)，α -Μ溶液組（0· 5mg/kg ;2mg/kg)，共六組。SAMR小 鼠作為正常對照，給予生理鹽水。尾靜脈注射給藥，連續給藥2周。給藥結束後，小鼠水合 氯醛麻醉，生理鹽水、4%多聚甲醛依次心臟灌流。斷頭，取出完整大腦，4%多聚甲醛溶液繼 續固定，浸蠟，包埋，切片，厚度4 μ m，避光保存。石蠟切片免疫組化染色，腦內Α β聚集體免 疫組化(一抗6Ε10)，小膠質細胞激活(一抗anti-⑶45)。DAB染色，蘇木素復染，中性樹膠封 片觀察並計數不同處理組動物大腦皮層、海馬的Αβ沉積和小膠質細胞激活情況。
[0055] 結果如圖5所示，10月齡SAMP8小鼠連續15天尾靜脈給予α-Μ-重組脂蛋白 (0. 5mg/ml和2mg/ml)，腦內Αβ沉積和小膠質細胞激活情況明顯少於生理鹽水組，也明顯 少於2mg/kg α -Μ溶液組，空白重組脂蛋白的腦內Α β沉積和小膠質細胞激活情況也有所改 善。結果表明，重組脂蛋白本身具有一定的AD疾病修飾作用，同時能有效提多酚類藥物對 AD的疾病修飾作用。
[0056] 實施例6載siRNA/MicroRNA的重組脂蛋白鼻腔給藥對AD模型動物的疾病修飾作 用
[0057] ⑴製備
[0058] 脂質（D0TAP/D0PE) (2-10mg)溶於一定比例氯仿溶液中，減壓旋轉蒸發除去有機 溶劑，脂膜加含siRNA/MicroRNA(1-500 μ g)的Tris緩衝液水化，均質減小粒徑。取lml ApoE3/ApoA I 模擬肽（0· 5-5mg/ml) 10min 內加入，超聲 50min，繼續孵育 24h，4° C 保存。
[0059] (2)載siRNA/MicroRNA的重組脂蛋白鼻腔給藥對AD模型動物的疾病修飾作用 [0060] 將7月齡AD模型小鼠 APP/PS1轉基因小鼠分為生理鹽水組，空白重組脂蛋白組， 載BACE-siRNA/MicroRNA製劑組，BACE-siRNA/MicroRNA溶液劑組。野生型B6小鼠作為正 常對照，給予生理鹽水。鼻腔給藥4周。給藥結束後，小鼠水合氯醛麻醉，生理鹽水、4%多聚 甲醛依次心臟灌流。斷頭，取出完整大腦，4%多聚甲醛溶液繼續固定，浸蠟，包埋，切片，厚度 4μπι，避光保存。石蠟切片免疫組化染色，腦內Αβ聚集體免疫組化(一抗6E10)，小膠質細 胞激活(一抗anti-CD45)。DAB染色，蘇木素復染，中性樹膠封片觀察並計數不同處理組動 物大腦皮層、海馬的Αβ沉積和小膠質細胞激活情況。結果顯示，7月齡APP/PS1轉基因小 鼠連續4周鼻腔給予載siRNA/MicroRNA的重組脂蛋白，腦內Α β沉積和小膠質細胞激活情 況明顯少於生理鹽水組，也明顯少於siRNA/MicroRNA溶液組。
[0061] 以上所述僅是本發明的優選實施方式，應當指出，對於本【技術領域】的普通技術人 員，在不脫離本發明原理的前提下，還可以做出若干改進和潤飾，這些改進和潤飾也應視為 本發明的保護範圍。
【權利要求】
1. 一種Αβ靶向的重組脂蛋白納米藥物載體，其特徵在於，所述Αβ靶向的重組脂蛋白 納米藥物載體由脂質、載脂蛋白和藥物組成，所述藥物是針對阿爾茨海默病的治療或診斷 藥物，包括小分子化學治療藥物，大分子多肽、蛋白、基因治療藥物及診斷藥物中的一種或 者多種。
2. 根據權利要求1所述的一種Αβ靶向的重組脂蛋白納米藥物載體，其特徵在於，所述 載脂蛋白包括ApoE及其模擬肽、ΑροΑ-Ι及其模擬肽、ΑροΑ-ΙΙ及其模擬肽、ApoC及其模擬 肽中的一種或多種。
3. 根據權利要求2所述的一種Αβ靶向的重組脂蛋白納米藥物載體，其特徵在於，所述 載脂蛋白是ApoE及其模擬肽中的一種或多種。
4. 根據權利要求1所述的一種Αβ靶向的重組脂蛋白納米藥物載體，其特徵在於，所述 Αβ靶向的重組脂蛋白納米藥物載體的粒徑範圍為l-500nm。
5. 根據權利要求4所述的一種Αβ靶向的重組脂蛋白納米藥物載體，其特徵在於，所述 Αβ靶向的重組脂蛋白納米藥物載體的粒徑範圍為5-200nm。
6. 根據權利要求1所述的一種Αβ靶向的重組脂蛋白納米藥物載體，其特徵在於，所述 Α β靶向的重組脂蛋白納米藥物載體採用注射途徑給藥或者鼻腔途徑給藥。
7. 根據權利要求1所述的一種Αβ靶向的重組脂蛋白納米藥物載體，其特徵在於，所 述Α β靶向的重組脂蛋白納米藥物載體分散在藥劑學上可以接受的緩衝溶液環境中，所述 緩衝溶液包括HEPES緩衝液、生理鹽水、Tris緩衝液和磷酸鹽緩衝液。
8. 權利要求1一7任一所述的Αβ靶向的重組脂蛋白納米藥物載體的製備方法，其特 徵在於，當藥物是疏水性藥物和/或兩親性藥物時，脂質和疏水性藥物和/或兩親性藥物通 過常規方法製備脂質體，得到的脂質體與載脂蛋白共同孵育，通過自組裝形成重組脂蛋白 納米藥物載體；當藥物是親水性藥物時，脂質通過常規方法製備脂質體，親水性藥物可以在 自組裝前、中或後加入。
9. 權利要求8所述的Αβ靶向的重組脂蛋白納米藥物載體的製備方法，其特徵在於，藥 物質量佔處方含量〇. 001-50%，脂質質量佔處方含量的20-95%，載脂蛋白質量佔處方含量 的 5-80%。
10. 權利要求1一7任一所述的Αβ靶向的重組脂蛋白納米藥物載體在製備Αβ靶向 藥物中的應用。
【文檔編號】A61K48/00GK104138600SQ201310164966
【公開日】2014年11月12日 申請日期:2013年5月7日 優先權日:2013年5月7日
【發明者】高小玲, 陳紅專, 宋清香, 黃萌, 姚磊 申請人:上海交通大學醫學院