分離腸膽固醇結合蛋白的方法
2023-05-27 21:50:16 3
專利名稱：分離腸膽固醇結合蛋白的方法
技術領域：
本發明涉及分離腸蛋白的方法，所述蛋白與腸膽固醇吸收有關並且可以與膽固醇吸收抑制劑結合。
在人體內，平均約50％的膽固醇存在於腸腔內。腸腔內的膽固醇主要來源於飲食和膽汁。每天從膽汁分泌出約2g膽固醇。腸膽固醇的吸收主要依賴於膽汁鹽的存在。因此，給予膽汁鹽重吸收抑制劑或者膽汁鹽多價螯合劑能夠抑制腸膽固醇的吸收。
抑制腸膽固醇吸收的主要目的是治療脂質紊亂、動脈硬化和心血管疾病。大部分專家認為腸膽固醇吸收是通過物理化學擴散進行的。
許多關於膽固醇運輸的研究報告表明膽固醇的運輸與蛋白有關。腸膽固醇的吸收有很大的個體差異性。體外實驗的生化數據顯示小腸單層小泡和刷狀緣小泡之間的膽固醇交換與蛋白有關。如僅是甲基基團(β-谷甾醇)和乙基基團(菜油甾醇)不同的植物固醇(β-谷甾醇和菜油甾醇)在腸吸收上也許表現很大的不同。在人體內，β-谷甾醇還表現膽固醇吸收抑制。在腸腔內給藥抑制腸膽固醇吸收的化合物中有兩類最具活性的化合物。這些化合物中一些是源自皂角苷的如替奎安和帕馬苷的化合物，另一些是2-氮雜環丁烷酮衍生物。Clader等在J.Med.Chem.39，3684-3693，1996中將2-氮雜環丁烷酮衍生物描述為膽固醇吸收抑制劑。在本發明中，吸收是指物質附著蛋白並通過蛋白的幫助運輸該物質。
腸吸收膽固醇主要是有助於血漿膽固醇的動態平衡。在臨床試驗中已經證明了腸膽固醇吸收抑制劑(如依折麥布(Ezetimlbe)或帕馬苷)作為新穎的降低膽固醇藥物的療效。儘管經過大量的科學研究，但是人們仍不清楚它們作用的分子模式和腸膽固醇吸收的機制且這方面具有很大的爭議性。通常來講，人們認為腸膽固醇吸收是通過跨越血漿膜和腸刷狀緣細胞膜的被動擴散，但是越來越多的證據表明蛋白介導腸膽固醇吸收過程膽固醇的吸收具有極大的種屬差異，具有相似物理化學性質的結構密切相關的植物固醇(β-谷甾醇和菜油甾醇)與吸收差的膽固醇很不相同，這使得簡單擴散不大可能。具有顯著的構效關係的特異性膽固醇轉運抑制劑(2-氮雜環丁烷酮和甾類糖苷)的存在強烈表明腸膽固醇吸收過程是蛋白介導的過程。
微量的膽固醇是維持人體功能必不可少的多功能化合物。只有動物能夠產生膽固醇，植物體內不含有膽固醇，除非將動物基的產物(如豬油)在處理過程中加入。在人體內，膽固醇具有三種主要功能。它被某些腺體用於生產類固醇或可的松類激素(包括性激素)。它有助於肝臟產生膽汁酸(為脂肪消化所必需)。最後但並非不重要的功能是作為細胞膜和結構(是一種機體組織的組成材料)的主要成分。
當機體有太多的膽固醇或者膽固醇沉積在不適當的位置就引起了膽固醇的問題。當膽固醇沉積在心臟的冠狀動脈壁(為心臟本身心肌組織的主要供氧血管)內就引起了冠心病。它有助於脂肪形成，成為斑的韌性栓塞。這種斑的堆積具有各種不同的名稱動脈硬化、動脈變硬和動脈粥樣硬化。膽固醇也能沉積在身體其它地方的動脈內而引起中風(在腦部阻塞動脈)和外周血管病(在腿部阻塞動脈)的發生。
為了流經全身，膽固醇必須由特定的分子(脂蛋白)包裹。脂質或脂膽固醇成分包裹在水溶性的蛋白包衣內。各種不同類型的脂蛋白包括來自體內循環系統的各種脂蛋白、運輸膽固醇至組織以及從其他組織去除膽固醇。在體內主要的運載膽固醇的化合物是低密度脂蛋白或LDL-膽固醇。通常稱LDL為「不好膽固醇」，因為它在膽固醇在動脈內的沉積中具有重要作用。因為它僅有少許蛋白(分子中最重的部分)，大部分是脂肪，所以稱為低密度。LDL的水平高則患有冠心病的風險增加。通常稱高密度脂蛋白或HDL為「好膽固醇」，因為它有助於將膽固醇從動脈壁內去除並且將它轉運到肝臟排洩。與LDL膽固醇相反，HDL水平低則患有冠心病的風險增加，而HDL的水平高則能免於患有這種疾病。
其它亞型的膽固醇顆粒包括脂肪消化時由腸細胞產生的乳糜顆粒，以及由肝臟產生的作為LDL膽固醇的重要前體的極低密度脂蛋白(VLDL)。VLDL是運輸肝臟產生的甘油三脂的重要脂蛋白。
引起心臟疾病的風險因素，關鍵是LDL和HDL。
所有的證據表明高脂肪、高膽固醇飲食可增加血內膽固醇的水平，血膽固醇水平的增加是心臟疾病風險的確切因素，人們自然會想到通過飲食或其他方法降低血的膽固醇就可減少患病的風險。
本發明的目的是提供一種分離蛋白的方法，這種蛋白與腸膽固醇吸收有關且為膽固醇吸收抑制劑的蛋白靶分子。這種方法被認為大大有助於控制膽固醇水平增加的治療。
本發明涉及分離蛋白的方法，該方法包括a]提供生物材料，b]將來自a]的生物材料與光敏的化合物2-氮雜環丁烷酮共同孵育，所述2-氮雜環丁烷酮被放射標記並且能夠與所述蛋白特異性結合，c]將生物材料溶解並去除細胞碎片，d]將上清液加至含有小麥胚芽凝集素瓊脂糖的裝置上，e]將來自d]的小麥胚芽凝集素瓊脂糖的洗脫液上樣於羥基磷灰石柱上，f]將來自e]的放射標記部分上樣於製備性SDS-PAGE上，g]收集放射標記部分且可能沉澱。
優選的生物材料取自腸組織或腸細胞培養液中的細胞或者取自人、大鼠、小鼠或兔的迴腸的刷狀緣細胞。
所述光敏的2-氮雜環丁烷酮光反應化合物優選具有如下式I的結構(Kramer，W.等，(2000)FEBS Letters 487，293-297)式I 其中R選自如下a)-e)基團中任一個
a)-CH2NH-CO-CH3 式I中a、b和c的化合物的合成已經公開在2002年3月28公開的DE 10042447 A1中。式I中d和e的化合物的合成在下文的實施例中公開。
分子內的對光不穩定的基團可以用於產生與直接相鄰的分子(優選蛋白)之間的共價鍵。為此，首先將光不穩定的基團的化合物與待產生共價鍵連接的分子直接接觸。例如，這可以通過所述化合物(為蛋白特異性抑制劑，優選膽固醇吸收抑制劑)的另一部分產生。使所述化合物與所述分子接觸，然後用紫外線照射。用紫外線照射可以使對光不穩定的基團活化並產生分子(尤其蛋白)間的共價鍵。適當的對光不穩定的基團為如二氮雜環丙烯、疊氮基或羰基官能團。
可用普通的紫外線燈照射，例如內置溴化乙錠的用於肉眼觀察多聚核苷酸的UV燈，或者用於消毒實驗室的UV燈或者從「The SouthernUltraviolet Company，Hamden，CT」得到的其它光化學反應器。紫外光照射後，採用常用的方法使細胞破裂。其示例包括重複冷凍和融解、用超聲處理細胞、採用French壓擠或者加入洗滌劑和酶。通過例如硫酸銨沉澱、差速離心或柱層析技術進行細胞溶解產物中蛋白的分級。為此，適用的柱層析包括變性或未變性的聚丙烯醯胺一維或二維凝膠電泳、高液壓柱層析、離子交換柱層析或者親和柱層析。本領域技術人員對這些技術是非常熟悉的，詳見例如「Current Protocols in Protein Science」；John E.Caligan；Ben M.Dunn；Hidde L.Ploegh；David W.Speicher；Paul T.Wingfield；Wiley和Sons；ISBNO-471-11184-8。
分級後優選通過放射標記化合物(含有腸膽固醇吸收抑制劑和對光不穩定的基團)來檢測蛋白。為此，可使用放射性同位素，如3H或14C。適當的測定方法為例如通過聚丙烯醯胺凝膠電泳將蛋白導入聚丙烯醯胺上後再通過X線攝影底片測定含有共價鍵化合物的蛋白。其它適當的測定方法為液體快速計數或平板掃描。
生物材料優選由腸細胞組成。例如，可將動物的腸解剖隨後經純化、酶解結締組織並且在等張緩衝液中將單個細胞懸浮而取得腸細胞。適合製備腸細胞的腸組織為宰殺後動物屍骸的相應部位。在手術中得到的部分人腸組織也可製備成腸細胞。腸細胞也可由腸細胞培養物(對於本發明，採用細胞培養技術製備)組成。腸細胞碎片可為腸細胞的細胞器。優選的細胞器為腸細胞膜。可將腸細胞破壞後通過差速離心得到腸細胞膜。優選的腸細胞碎片也可為蛋白片段。製備腸細胞或腸細胞碎片的細胞優選來自哺乳動物腸組織刷狀緣的腸細胞。
取得腸細胞的哺乳動物優選包括但不限於人、猴子、牛、豬、大鼠、小鼠、兔、倉鼠或其他脊椎動物。可通過製備這些生物體腸刷狀緣組織細胞懸浮液而得到這些細胞。例如可通過外科手術獲得適當的腸組織。另一些可從宰殺後的動物屍骸處取材。源自一個腸細胞系的細胞同樣是適用的。為了製備適當的細胞製備物，用酶處理腸組織從而得到單個細胞，然後經差速離心。然後將得到的細胞或細胞器置於適當的液體介質中。這些液體介質可包括緩衝物質、鹽、蛋白以及另外的賦形劑。
本發明也涉及分離腸吸收抑制劑結合蛋白(與腸膽固醇吸收有關)的方法，該方法包括a]製備生物材料，b]將來自a]的生物材料與光敏的膽固醇吸收抑制劑共同孵育，所述膽固醇吸收抑制劑被放射標記或生物素標記，c]將來自b]的生物材料溶解並去除細胞碎片，d]將上清液進行柱層析或者置於鏈黴抗生物素-瓊脂糖上，e]將洗脫液置於SDS-PAGE上，f]分離、洗脫並且可能再摺疊的大小為140-150kDa的蛋白。
生物材料優選取自腸組織或腸細胞培養液中的細胞或者取自人、大鼠、小鼠或兔的迴腸的刷狀緣細胞。
優選生物素標記的膽固醇吸收抑制劑具有如下結構 本發明還涉及能夠與膽固醇吸收抑制劑特異性結合的蛋白，如上所述，該蛋白可通過本發明的方法分離。優選的蛋白大小為140-150kDa，更優選大小為145kDa的蛋白。蛋白可為糖基化的蛋白。
根據所用的SDS聚丙烯醯胺凝膠電泳的方法以及已知的其他相關方法的不同，所述的蛋白的分子量的範圍不確定。分子量的變化範圍為+/-10％區間。所述的分子量表示多次實驗的平均值。當稱蛋白的分子量為145kDa時，那麼由SDS聚丙烯醯胺凝膠電泳分別進行10次實驗來測定分子量，10次的平均值為145.3kDa，其標準誤差為+/-7.55kDa本領域技術人員可在「Carbohydrate Biotechnology Protocols，Methods in Biotechnology，10(1999)Humana Press，ISBN 0-89603-563-8，Editor C.Bucke」中有關於糖基化的適當方法的詳細資料。
本發明還涉及由本發明蛋白和如下結構的化合物組成的複合物 本發明還涉及含有本發明蛋白和配製藥物的藥學上可接受的化合物和/或賦形劑的藥物組合物。這些物質通常已知且在由Mack PublishingCompany出版的第15版Remingtons Pharmaceutical Sciences中有描述。
本發明還涉及含有本發明蛋白和上述化合物的複合物以及配製藥物的藥學上可接受的化合物的藥物組合物。
本發明也包括本發明蛋白在生產治療高膽固醇相關疾病的藥物組合物中的用途。這些疾病為如肥胖、動脈硬化、高血壓、心力衰竭等。膽固醇水平為199mg/dL則認為是膽固醇升高。
本發明也包括本發明蛋白和上述化合物的複合物在生產治療高膽固醇相關疾病的藥物組合物中的用途。
本發明也涉及本發明蛋白在鑑定抑制膽固醇吸收的化合物中的用途，其中a]提供含有本發明的蛋白的生物材料，b]提供化合物，c]使來自a]的生物材料與來自b]的化合物接觸，d]測定由來自c]的生物材料所吸收的膽固醇的量，e]將d]的結果與對照實驗組結果進行比較，其中對照實驗組的膽固醇吸收量通過使與來自a]的生物材料具有相同種類和/或組織特異性、但是不與b)的化合物接觸的生物材料進行測定，f]當細胞與b]的化合物接觸後測定的膽固醇吸收量減少時，e]的結果表明化合物抑制膽固醇重吸收。
本發明也涉及含有上述方法可鑑定的化合物和藥學上可接受的賦形劑的藥物，該藥物用於治療高膽固醇相關性疾病。
這種化合物的分子量優選100-50000Da且更優選100-5000Da。這種化合物可以為膽固醇類似物、含有蛋白、肽或者脂肪酸的化合物。
例如，可通過化學合成方法製備所述化合物。所述化合物可為合成化合物中的一部分，如那些來自完全合成程序(「化合物庫」)中存儲和分類的化合物。化合物也可由微生物(尤其指細菌、真菌或者動物或植物種類(天然物質))產生。若取自天然物質，也可通過分離適當的有機體製備。在大部分情況下，蛋白與化合物的接觸是在含有一定比例的溶劑(如二甲亞碸或乙醇)的水溶液中進行的。水溶液內也可含有緩衝物質、離子或穩定劑(如蛋白、甘油等)。具體恆定的條件(如溫度、pH值、離子條件、蛋白或化合物濃度、容積)可能有利於接觸。因此，在接觸期間優選溫度恆定為37℃。接觸後測定化合物與蛋白的結合，例如根據它與膽固醇或放射標記的膽固醇吸收抑制劑的相互作用，採用膽固醇或膽固醇吸收抑制劑置換的方法測定化合物對蛋白的親和力。
實施例5-(2-氧代-六氫-噻吩並[3，4-d]咪唑-6-基)-戊酸[2-(4-疊氮基-苯基)-1-(4-{4-[3-(3-羥基-3-苯基-丙基)-2-(4-甲氧基-苯基)-4-氧代-氮雜環丁烷-1-基]-苯基氨基甲醯基}-丁基氨基甲醯基)-乙基]醯胺的合成下述段落中的數字1-14指附
圖1的整個反應流程。
生物素標記的光敏的膽固醇抑制劑5-(2-氧代-六氫-噻吩並[3，4-d]咪唑-6-基)-戊酸[2-(4-疊氮基-苯基)-1-(4-{4-[3-(3-羥基-3-苯基-丙基)-2-(4-甲氧基-苯基)-4-氧代-氮雜環丁烷-1-基]-苯基氨基甲醯基}-丁基氨基甲醯基)-乙基]醯胺的合成下述段落中的數字1-14指合成上述生物素標記光反應膽固醇抑制劑的附圖1和圖2的反應流程。
3-[5-(叔丁基-二甲基-矽烷氧基)-5-苯基-戊醯基]-4-苯基-噁唑烷-2-酮(1) 將30g 3-(5-羥基-5-苯基-戊醯基)-4-苯基-噁唑烷-2-酮溶解於50mlDMF中。25ml DMF中加入14.3g咪唑和19g叔丁基-二甲基甲矽烷基氯後，在室溫下攪拌反應直到所有成分溶解(2-4h)。蒸發反應溶液，加入水後用乙酸乙酯萃取。經硫酸鎂乾燥有機相併蒸發後得到化合物1C26H35NO4Si(453.6)MS(ESI+)476(M+Na+)。
(4-甲氧基-亞苄基)-(4-硝基-苯基)-胺(2)向溶解於160ml異丙醇的50g(370mmol)茴香醛中加入51g(370mmol)對硝基苯胺。在80℃下2小時後，產物沉澱。將反應混合物冷卻到室溫並過濾。用異丙醇洗滌殘餘物。乾燥後得到62.9g黃色晶體的產物2(收率66％)C14H13N2O3(257.27)。
3-{5-(叔丁基-二甲基-甲矽烷氧基)-2-[(4-甲氧基-苯基)-(4-硝基-苯基氨基)-甲基]-5-苯基-戊醯基}-4-苯基-噁唑烷-2-酮(3) 在10℃下將溶有5.4g(12.0mmol)產物1和6.2g(24mmol)產物2的135ml二氯甲烷中加入8ml二異丙基乙基胺且逐滴加入4.8ml的三甲基甲矽烷基氯。1小時後在-10℃下逐滴加入二氯甲烷中的14ml 1M的四氯化鈦。在-10℃下攪拌3小時並且在-30℃下再存放12小時(未攪拌)。然後加入8ml乙酸和140ml 7％的酒石酸水溶液，再在室溫下攪拌2小時。加入50ml 20％亞硫酸氫鈉水溶液後，再攪拌1小時並用二氯甲烷萃取。有機相經硫酸鎂乾燥、蒸發以及矽膠(乙酸乙酯/庚烷(＝1/3-1/1))柱層析純化。得到6.3g(74％)淡黃色固體產物3C40H47N3O7Si(709.92)MS(ESI+)710(M+H+)。
3-[3-(叔丁基-二甲基-甲矽烷氧基)-3-苯基-丙基]-4-(3-甲氧基-苯基)-1-(4-硝基-苯基)-氮雜環丁烷-2-酮(4) 在室溫、氬氣下將含有6.1g(8.6mmol)的產物3、7.3ml雙三甲基甲矽烷基乙醯胺、0.5g四丁基氟化銨和100ml叔丁基甲基醚的混合物攪拌10小時。反應完成後由冰冷卻緩慢加入5ml的乙酸並蒸發。經矽膠柱層析(乙酸乙酯/庚烷＝1/2)分離殘餘物。得到3.3g(70％)淡黃色固體的產物4C31H38N2O5Si(546.74)MS(ESI+)547.3(M+H+)。
1-(4-氨基-苯基)-3-[3-(叔丁基-二甲基-甲矽烷氧基)-3-苯基-丙基]-4-(3-甲氧基-苯基)-氮雜環丁烷-2-酮(5) 在5巴的氫氣壓下，在高壓釜內將50ml乙酸乙酯中的3.0g(5.5mmol)產物4與1.0g 10％披鈀炭反應2小時。將反應溶液過濾、蒸發並用矽膠柱層析(二氯甲烷/甲醇＝10/1)分離。得到2.4g(86％)無色固體的產物5C31H40N2O3Si(516.76)MS(ESI+)517.4(M+H+)。
1-(4-氨基-苯基)-3-(3-羥基-3-苯基-丙基)-4-(3-甲氧基-苯基)-氮雜環丁烷-2-酮(6)
將15ml 2N鹽酸水溶液加入到溶有2.3g產物5的20ml四氫呋喃中並攪拌2小時。向反應物內加入碳酸氫鈉水溶液並用乙酸乙酯萃取。有機相經硫酸鎂乾燥、蒸發並經矽膠(乙酸乙酯/庚烷＝1/1-1/0)柱層析純化。得到1.1g無色固體的產物6C25H26N2O3(402.50)MS(ESI+)403.2(M+H+)。
(4-{4-[3-(3-羥基-3-苯基-丙基)-2-(4-甲氧基-苯基)-4-氧代-氮雜環丁烷-1-基]-苯基氨基甲醯基}-丁基)-氨基甲酸-9H-芴-9-基甲基乙酯(8) 將0.8g(2.0mmol)產物6和1.35g(4.0mmol)的5-(Fmoc-氨基)-戊酸7(Fluka)溶解於15ml DMF(二甲基甲醯胺)中。逐步加入如下成分4.8g TOTU(Fluka)、1.6g的肟(羥亞氨基-cyanouceti acid-乙酸乙酯；Fluka)和5.5ml的NEM(4-乙基-嗎啉)。置於室溫下1小時後加入100ml乙酸乙酯稀釋反應物並用水洗滌3次。有機相經硫酸鎂乾燥、過濾和蒸發。殘餘物經快速柱層析(乙酸乙酯/正庚烷2∶1)純化。得到0.58g(41％)非晶體固體的產物8C45H45N3O6(723.8)MS(ESI+)724.4(M+H+)。
5-氨基-戊酸-{4-[3-(3-羥基-3-苯基-丙基)-2-(4-甲氧基-苯基)-4-氧代-氮雜環丁烷-1-基]-苯基}-醯胺(9)
將570mg(0.78mmol)產物8和0.8ml二乙胺溶解於5ml DMF(二甲基甲醯胺)中。置於室溫下1小時後蒸發。殘餘物經快速柱層析(二氯甲烷/甲醇/濃氨水30∶10∶3)純化。得到220mg(56％)非晶體固體的產物9C30H35N3O4(501.63)MS(ESI+)502.3(M+H+)。-苯基氨基甲醯基}-丁基氨基甲醯基]-乙基]-氨基甲酸-9H-芴-9-基甲基酯(11) 將200mg(0.40mmol)產物9和340mg(0.79mmol)的Fmoc-對疊氮基-Phe-OH 10(Bachem)溶解於4ml DMF(二甲基甲醯胺)並根據生成產物8的流程反應。得到300mg(82％)非晶體固體的產物11C54H53N7O7(912.07)MS(ESI+)912.5(M+H+)。
5-[2-氨基-3-(4-疊氮基-苯基)-丙醯氨基]-戊酸{4-[3-(3-羥基-3-苯基-丙基)-2-(4-甲氧基-苯基)-4-氧代-氮雜環丁烷-1-基]-苯基}-醯胺(12)
將300mg(0.33mmol)產物11和0.8ml二乙胺溶解於4ml DMF(二甲基甲醯胺)中並根據生成化合物9的流程反應。得到42mg(19％)非晶體固體的化合物12C39H43N7O5(689.82)MS(ESI+)690.3(M+H+)5-(2-氧代-六氫-噻吩並[3，4-d]咪唑-6-基)-戊酸-[2-(4-疊氮基-苯基)-1-(4-{4-[3-(3-羥基-3-苯基-丙基)-2-(4-甲氧基-苯基)-4-氧代-氮雜環丁烷-1-基]-苯基氨基甲醯基}-丁基氨基甲醯基)-乙基]-醯胺(14) 將40mg(0.058mmol)的化合物12和60mg的D-生物素基-N-羥基琥珀醯亞胺13(Bachem)溶解於0.5ml DMF(二甲基甲醯胺)中。置於室溫下1小時後蒸發。殘餘物經快速柱層析(二氯甲烷/甲醇/濃氨水30∶5∶1)純化。得到29mg(55％)非晶體固體的化合物14C49H57N9O7S(912.12)MS(ESI+)916.6(M+H+)。
光親和標記和結合研究通過技術人員已知的方法分離兔小腸刷狀緣組織的小泡(vesicle)(Kramer等J.Biol.Chem.268，18035-18046(1993))。在Rayonet RPR-100型光化學反應器(購自″The Southern Ultraviolet Company，Hamden，CT″)上，用放射標記的本發明的式Ia)、式Ib)、式Ic)、式Id)或式Ie)化合物進行光親和性標記實驗。在20℃下，在200μl容積的10mM Tris/Hepes緩衝液(pH7.4)、100mM NaCl、100mM甘露醇中避光孵育刷狀緣膜小泡(含有100-200μg蛋白)和化合物之一5分鐘。也可用細胞器(尤其細胞膜)代替刷狀緣小泡。在下文的說明中同樣如此。避光孵育後用254nm紫外光照射20或60秒。然後用上述緩衝液將刷狀緣小泡洗滌兩次。可通過常用技術(如加入乙醇、鹽或洗滌劑、加熱、重複冷凍和融化或其他技術人員已知的適當方法)使蛋白沉澱並通過SDS聚丙烯醯胺凝膠電泳將蛋白分級。通過LSC或螢光X線照像術測定放射標記蛋白。刷狀緣組織的標記蛋白對化合物的親和力為1-100nM之間。
動物和細胞膜的製備任意給予體重4-5kg(Harlem Winkelmann，Borchem，Germany)的雄性紐西蘭白兔Altronin標準飼料C 2023(Altronin，Lage，Germany)。經Mg2+沉澱法製備胃、十二指腸、空腸、迴腸、盲腸、結腸、直腸和腎的刷狀緣膜小泡。根據標準技術製備大鼠肝臟微粒體和脂肪細胞膜。
膽固醇吸收抑制作用通過改良的Zilversmit/Hughes方法測定腸膽固醇的吸收。將規律餵養食物(Altronin，Lage，Germany)的雄性NMRI小鼠(Charles RiverDeutschland GmbH，Salzfeld，Germany)禁食12小時。通過管飼法每種動物給予0.5ml 0.5％甲基纖維素或5％Solutol(BASF，Ludwigshafen，Germany)作為載體的分別有或無3mg膽固醇吸收抑制劑的溶液，再給予0.25ml含有0.24μCi[14C]膽固醇和0.25μCi[3H]谷甾醇的Intralipid溶液(Pharmacia Upjohn，Erlangen，Germany)。收集這些依舊新陳代謝的動物(每組5隻小鼠)的排洩物。24小時後宰殺這些動物並通過燃燒分析來測定排洩物和肝臟的放射活性。
溶解145kDa的結合蛋白作為膽固醇吸收抑制劑光親和標記後，將兔小腸刷狀緣膜小泡用10mM Tris/Hepes緩衝液(pH7.4)或300mM甘露醇洗滌幾次。在4℃下將所得的沉澱物在60分鐘內溶解於10mM Tris/Hepes緩衝液(pH7.4)/75mM KCl/5mM MgCl2/1mMEGTA/1mM DTT/1％(w/v)正辛基葡萄糖苷/1％TritonX-100/1％(w/v)(「增溶緩衝液」)中，所得的蛋白濃度為1mg/ml。或者，在4℃下將膜蛋白在10分鐘內溶解於10mM Tris/Hepes緩衝液(pH7.4)中，所得的蛋白濃度為10mg/ml，含有1％SDS，然後用10mM Tris/Hepes緩衝液(pH7.4)/1％正辛基葡萄糖苷1∶10稀釋。離心後含有溶解膜蛋白的上清液與適當的含有1％正辛基葡萄糖苷作為洗滌劑的緩衝液混合、稀釋用於柱層析。
將放射標記的145kDa結合蛋白用光敏2-氮雜環丁烷酮C-1光親和標記後純化作為膽固醇吸收抑制劑光親和標記在20℃下，將取自兔迴腸刷狀緣膜小泡(250μg蛋白)的8份樣品與66nM(0.3μCi)[3H]C-1的10mM Tris/Hepes緩衝液(pH7.4)/100mMNaCl/100mM甘露醇溶液避光孵育30分鐘。在配有4RPR 2537燈的Rayonet RPR 100光化學反應器(The Southern Ultraviolet Company，Hamden，CT，USA)上於254nm波長處照射30秒，此後收集樣品並在離心後將膜小泡再懸浮於2ml 10mM Tris/Hepes緩衝液(pH7.4)/300mM甘露醇中，在20℃下，在20分鐘後離心。重複該步驟3次。用2ml「增溶緩衝液」溶解所得的沉澱物。離心後，取出40μl的上清液並用SDS PAGE分析，然後凝膠切片用於測定結合到膜蛋白中的放射性。
小麥胚芽凝集素親和柱層析向含有溶解膜蛋白的上清液中加入0.5ml小麥胚芽凝集素瓊脂糖凝膠。在20℃下30分鐘後，通過離心收集珠狀物並用2ml 10mM Tris/Hepes緩衝液(pH7.4)/100mM NaCl/100mM甘露醇/1％(w/v)正辛基葡萄糖苷洗滌3次。用4份2ml 10mM Tris/Hepes緩衝液(pH7.4)/100mM NaCl/100mM甘露醇/300mM N-乙醯基-D-葡萄糖胺洗脫吸收的蛋白；測定所有洗脫液中氨基肽酶N和蔗糖酶的活性，沉澱100μl等份中的蛋白並用SDS-PAGE分析。
羥基磷灰石柱層析用10mM磷酸鈉緩衝液(pH7.4)/1％(w/v)正辛基葡萄糖苷將小麥胚芽凝集素柱層析的N-乙醯基葡萄糖胺洗脫液稀釋10倍，並將它上樣於羥基磷灰石柱層析(高10cm，直徑1cm)，以0.25ml/min的恆定速度經10mM磷酸鈉緩衝液(pH7.4)/1％(w/v)正辛基葡萄糖苷平衡該柱，以每份1ml收集。然後按如下方式洗脫蛋白10ml 10mM磷酸鈉緩衝液(pH7.4)/1％(w/v)正辛基葡萄糖苷，隨後進行如下梯度磷酸鹽洗脫10-250mM的磷酸鹽15ml、250-700mM的磷酸鹽15ml以及700-1000mM的磷酸鹽10ml。測定每一部分中的氨基肽酶N和蔗糖酶的活性以及放射性。每份取出100μl，沉澱蛋白並用SDS-PAGE分析，隨後通過將凝膠切成2mm的切片測定放射標記的蛋白的分布。
製備性SDS凝膠電泳收集含有放射標記的145kDa蛋白的級分並用氯仿/甲醇沉澱蛋白。在SDS樣品緩衝液(62.5mM Tris/HCI(pH6.8)2％SDS/5％/2-巰基乙醇/10％甘油/0.001％溴酚藍)中溶解後，離心樣品並將上清液置於製備性的7.5％SDS凝膠(直徑28mm；分離凝膠的長度5cm)的分離凝膠上。在500V(40mM，6W)下進行電泳，將其分離為1.5ml級分。用SDS-PAGE分析每級分150μl的等份樣品中的蛋白組成。
通過鏈黴抗生物素-生物素親和柱層析純化作為膽固醇吸收抑制劑的145kDa結合蛋白在20℃下，將取自兔迴腸刷狀緣膜小泡(200μg蛋白)的10份樣品與200nM生物素標記的膽固醇抑制劑C-4的10mM Tris/Hepes緩衝液(pH7.4)/100mM NaCl/100mM甘露醇一起避光孵育30分鐘，然後用配有4RPR 2537燈的Rayonet RPR 100光化學反應器於254nm波長處光照射30秒。收集小泡後，用2ml Tris/Hepes緩衝液(pH7.4)/300mM甘露醇洗滌3次。在4℃下，將所得的沉澱物懸浮於2ml「增溶緩衝液」中1小時。離心後，將上清液與0.5ml鏈黴抗生物素瓊脂糖珠混合併在4℃下持續攪拌2小時。離心後，在4℃下將珠與2ml 10mM Tris/Hepes緩衝液(pH7.4)/300mM甘露醇/1％正辛基葡萄糖苷/4mM PMSF/4mM碘代乙醯胺/4mM EDTA孵育10分鐘，然後離心。重複該步驟2次後，用3份各2ml含有5mM生物素的上述緩衝液洗脫鏈黴抗生物素瓊脂糖珠上的蛋白。取出各等份洗脫液，測定氨基肽酶N和蔗糖酶的活性並用SDS PAGE分析。如上所述，經製備性SDS凝膠電泳純化得到含有145kDa共價鍵結合的結合蛋白(膽固醇吸收抑制劑)的生物素洗脫液。
酶裂解用氯仿/甲醇沉澱通過兩種方法分離的145kDa蛋白並再溶解於3μlTris/HCl緩衝液(pH6.8)/6.2％SDS/0.5％2-巰基乙醇/0.0005％溴酚藍中。在上述緩衝液中加入5μl剛剛製備的糜蛋白酶(35ng/ml)溶液並在30℃下孵育1小時進行酶裂解。通過加入含有4mM EDTA/4mM PMSF/4mM碘代乙醯胺的SDS樣品緩衝液並在95℃下加熱5分鐘來終止反應，然後在Tris/Tricine凝膠上進行SDS-PAGE。
SDS凝膠電泳在垂直穿刺凝膠(vertical stab gel)(20×17×0.15cm)中進行SDS-PAGE，採用LE 2/4凝膠電泳裝置(Amersham Pharmacia Biotech，Freiburg，Germany)，含有97.2％丙烯醯胺和2.8％N，N-亞甲基雙丙烯醯胺，凝膠的濃度為7-10.5％，或者為了用於分析時，採用獲自Novex的電泳裝置Xcell II在pre-casted的NOVEX凝膠上進行(4-12％、12％或15％，Invitrogen(Groningen，The Netherlands))。根據Schggre Jagow在Tris/Tricine凝膠(16.5％)中進行肽片段的電泳分離。電泳後，將凝膠用12.5％三氯乙酸固定，然後用Serva Blue R 250染色。為了便於測定放射性分布，將每個凝膠條切成2mm大小，用250μl的組織加溶劑Biolute S水解蛋白並用4ml Quickszint 501閃爍物進行液體閃爍計數。
用作膽固醇吸收抑制劑的145kDa結合蛋白的溶解作為膽固醇吸收抑制劑的145kDa結合蛋白純化的先決條件是在非變性狀態下使完整的膜蛋白充分溶解。採用各種洗滌劑進行的溶解試驗表明約80-90％的光標記蛋白用SDS和約60％的光標記蛋白用Zwittergent 9-13可以溶解，用CHAPS、NP-40、毛地黃皂甙和Triton-X-114，無顯著的溶解跡象。在10mM Tris/Hepes緩衝液(pH7.4)/300mM甘露醇中，1％的如Triton-X-100、正辛基葡萄糖苷、癸基麥芽糖苷、十二烷基麥芽糖苷或者膽固醇半琥珀酸酯/十二烷基麥芽糖苷的非離子洗滌劑僅可以使145kDa蛋白部分溶解，因此這些物質妨礙它的純化。申請人發現了兩種使145kDa蛋白溶解60-80％的方法，該種方法使得可以進行純化步驟a)用1％的SDS增溶，隨後用1％正辛基葡萄糖苷稀釋到初始濃度為0.1％SDS/1％正辛基葡萄糖苷。b)用10mM Tris/Hepes緩衝液(pH7.4)/75mM KCl/5mMMgCl2/1mM EGTA/1mM DTT/1％TritonX-100/1％正辛基葡萄糖苷(「增溶緩衝液」)增溶。該增溶方法使得可以通過柱層析將刷狀緣膜蛋白成功分離。
生物素標記的2-氮雜環丁烷酮光親和探針的設計為了進行膽固醇吸收抑制劑標記蛋白的一步驟純化，申請人將含有光不穩定基團生物素N-(生物素基)-4-疊氮基苯基丙氨酸經間隔基與膽固醇吸收抑制劑的2-氮雜環丁烷酮的N-苯基或苄氨基環的對位偶連。構效關係表明，該位置可以進行多種化學該性而在體內仍然保持抑制腸膽固醇吸收的能力。將生物素標記的光親和標記C-4應用於NMRI鼠，腸膽固醇吸收呈劑量依賴性抑制，這表明了生物素標記的光不穩定的膽固醇吸收抑制劑的生物學作用，這是用該探針確定蛋白與腸膽固醇吸收有關的首要條件。用疊氮基苯甲醯基衍生物[3H]C-1光親和標記的兔小腸BBMV，隨著存在的生物素標記的膽固醇抑制劑C-4的濃度的增加導致標記的145kDa蛋白呈濃度依賴性降低，這表明C-4與在小腸細胞的刷狀緣膜中作為膽固醇吸收抑制劑的145kDa結合蛋白具有特異性的相互作用。
用氚標記的2-氮雜環丁烷酮膽固醇吸收抑制劑C-1光標記的145kDa結合蛋白的純化光標記的145kDa結合蛋白位於這樣一種分子量區，即在進行SDS凝膠時，大量的刷狀緣膜的膜蛋白(如蔗糖酶/異麥芽糖酶複合物或氨基肽酶N)發生遷移，從而使得可以分離這些蛋白並用於序列測定。生物化學研究表明，為糖基化的整合膜蛋白的145kD蛋白在用N-葡聚糖酶去糖基化後分子量從145kDa變為110kDa。因此，申請人研究了各種凝集素作為親和柱層析假設的配體。用小麥胚芽凝集素瓊脂糖可使光標145kDa蛋白得到充分的延後，但是洗脫後蔗糖酶和氨基肽酶N的酶活性僅為70-80％。用N-乙醯基葡糖胺可使放射標記的145kDa蛋白全部洗脫，而氨基肽酶N和蔗糖酶的活性僅為30-50％。大體上說來，可使作為膽固醇吸收抑制劑的145kDa結合蛋白濃集4-5倍。為了進一步純化，可考慮一些不同的方法。在Mono Q或Mono S柱上進行離子交換柱層析，可使它從蔗糖酶/異麥芽糖酶中完全分離，但是僅從氨基肽酶N中部分分離，而用金屬螯合的親和柱層析無明顯的分離。用羥基磷灰石柱層析，可使145kDa蛋白更濃集，並且能夠從蔗糖酶和氨基肽酶中分離。選取最佳梯度的磷酸鹽柱層析可使145kDa蛋白與其他膜蛋白幾乎完全分離；高濃度磷酸鹽洗脫145kDa蛋白，無明顯的蔗糖酶或氨基肽酶N酶的活性。將羥基磷灰石柱層析取得的洗脫液經製備性SDS-PAGE進行最後的純化。純化145kDa蛋白的預計量為上樣到羥基磷灰石柱的物質的1-3％，這表明就刷狀緣膜而言濃集因子為＞150至＜500倍，而就腸細胞總蛋白而言濃集因子為2500-10000倍。
將生物素標記的光不穩定的膽固醇吸收抑制劑進行光親和標記後，通過鏈黴抗生物素-生物素親和層析純化膽固醇吸收抑制劑的145kDa結合蛋白將兔小腸BBMV與200μM C-4共同孵育，通過254nm波長處的紫外線照射使其交聯。溶解後，用鏈黴抗生物素珠萃取共價變性的蛋白(含有生物素標記的2-氮雜環丁烷酮膽固醇吸收抑制劑)。充分洗滌後，將結合蛋白用10mM生物素溶液洗脫並用SDS-PAGE分析。鏈黴抗生物素珠中主要保留了Mr 145kDa的蛋白，但是如果不進行紫外線照射的話則不能觀察到蛋白，這表明對於生物素標記的光不穩定的膽固醇吸收抑制劑C-4來說，145kDa蛋白是主要的結合蛋白。從鏈黴抗生物素珠得到的生物素萃取物不含有可測得的蔗糖酶/異麥芽糖酶或者氨基肽酶N的活性，這表明洗脫的145kDa蛋白可能只存在一種蛋白，它是由生物素標記的膽固醇吸收抑制劑的共價結合而改性的。在用C-4光標記期間，在200μM的其他膽固醇吸收抑制劑(如依折麥布)的存在下，減少了由鏈黴抗生物素珠萃取的145kDa蛋白的量，這表明膽固醇吸收抑制劑與C-4直接競爭同樣的結合位點；相反，其他腸營養物質膽汁酸、脂肪酸、葡萄糖、寡肽或胺基酸的轉運蛋白底物不影響萃取的145kDa蛋白的量。用來自各種器官的細胞膜所作的標記實驗表明，只有標記兔小腸-十二指腸、空腸和迴腸的BBMV才可以萃取145kDa蛋白，而標記胃、盲腸、結腸、直腸、腎、肝的BBMV或脂肪細胞，則鏈黴抗生物素珠沒有阻滯145kDa蛋白。因此，只能將來自吸收膽固醇的解剖位點(十二指腸、空腸和迴腸)的145kDa結合蛋白純化。在SDS凝膠上通過小麥胚芽凝集素和羥基磷灰石柱層析以及通過鏈黴抗生物素-生物素親和柱層析純化的145kDa蛋白之間沒有區別。用糜蛋白酶進行酶裂解後，得到許多分子量為4-35kDa的肽類型幾乎相同的肽，這表明，由兩種方法純化的145kDa蛋白相同，並且如果不除外還可能存在其他成分的話，則該蛋白為主要成分。
圖1合成5-(2-氧代-六氫-噻吩並[3，4-d]咪唑-6-基)-戊酸-[2-(4-疊氮基-苯基)-1-(4-{4-[3-(3-羥基-3-苯基-丙基)-2-(4-甲氧基-苯基)-4-氧代-氮雜環丁烷-1-基]-苯基氨基甲醯基}-丁基氨基甲醯基)-乙基]-醯胺(14)反應流程的第一部分圖2合成5-(2-氧代-六氫-噻吩並[3，4-d]咪唑-6-基)-戊酸-[2-(4-疊氮基-苯基)-1-(4-{4-[3-(3-羥基-3-苯基-丙基)-2-(4-甲氧基-苯基)-4-氧代-氮雜環丁烷-1-基]-苯基氨基甲醯基}-丁基氨基甲醯基)-乙基]-醯胺(14)反應流程的第二部分。
權利要求
1.分離蛋白的方法，該方法包括a]提供生物材料，b]將來自a]的生物材料與光敏的化合物2-氮雜環丁烷酮共同孵育，所述2-氮雜環丁烷酮被放射標記並且能夠與所述蛋白特異性結合，c]將生物材料溶解並去除細胞碎片，d]將上清液加至含有小麥胚芽凝集素瓊脂糖的裝置上，e]將來自d]的小麥胚芽凝集素瓊脂糖的洗脫液上樣於羥基磷灰石柱上，f]將來自e]的放射標記部分上樣於製備性SDS-PAGE上，g]收集放射標記部分且可能沉澱。
2.根據權利要求1的方法，其中所述生物材料為腸組織或腸細胞培養液中的細胞或者取自人、大鼠、小鼠或兔的迴腸的刷狀緣細胞。
3.根據權利要求1的方法，其中所述光敏的2-氮雜環丁烷酮光化合物具有如下通式I的結構式I 其中R選自如下a)-e)基團中任一個a)-CH2NH-CO-CH3
4.分離膽固醇結合蛋白的方法，該方法包括a]製備生物材料，b]將來自a]的生物材料與光敏的膽固醇吸收抑制劑共同孵育，所述膽固醇吸收抑制劑被放射標記或生物素標記，c]將來自b]的生物材料溶解並去除細胞碎片，d]將上清液進行柱層析或者置於鏈黴抗生物素-瓊脂糖上，e]將洗脫液置於SDS-PAGE上，f]分離、洗脫並且可能再摺疊的大小為140-150kDa的蛋白。
5.根據權利要求4的方法，其中所述生物材料為取自腸組織或腸細胞培養液中的細胞或者取自人、大鼠、小鼠或兔的迴腸的刷狀緣細胞。
6.根據權利要求5的方法，其中所述生物素標記的光敏的膽固醇吸收抑制劑的結構如下
7.根據權利要求1-6的方法分離的能夠與膽固醇吸收抑制劑特異性結合的蛋白。
8.根據權利要求7的蛋白，其中所述蛋白的大小為140-150kDa。
9.根據權利要求8的蛋白，其中所述蛋白的大小為145kDa。
10.根據權利要求8的蛋白，其中所述蛋白為糖基化蛋白。
11.權利要求7-10的蛋白和式I化合物形成的複合物式I 其中R選自如下a)-e)基團中任一個a)-CH2NH-CO-CH3
12.權利要求7-10的蛋白和下式結構的化合物組成的複合物
13.藥物組合物，該組合物包括權利要求7-10的蛋白和用於配製藥物的藥學上可接受的化合物。
14.藥物組合物，該組合物包括權利要求11或12的複合物和用於配製藥物的藥學上可接受的化合物。
15.權利要求7-10的蛋白在生產用於治療高膽固醇相關疾病的權利要求13的藥物組合物中的用途。
16.權利要求11和12的複合物在生產用於治療高膽固醇相關疾病的權利要求14的藥物組合物中的用途。
17.權利要求7-10的蛋白在鑑定抑制膽固醇吸收的化合物中的用途，其中a]提供含有權利要求7-10的蛋白的生物材料，b]提供化合物，c]使來自a]的生物材料與來自b]的化合物接觸，d]測定由來自c]的生物材料所吸收的膽固醇的量，e]將d]的結果與對照實驗組結果進行比較，其中對照實驗組的膽固醇吸收量通過使與來自a]的生物材料具有相同種類和/或組織特異性、但是不與b)的化合物接觸的生物材料進行測定，f]當細胞與b]的化合物接觸後測定的膽固醇吸收量減少時，e]的結果表明化合物抑制膽固醇重吸收。
18.治療高膽固醇相關疾病的藥物，該藥物含有權利要求17的方法鑑定的化合物以及藥學上可接受的賦形劑。
19.權利要求18的藥物，其中所述化合物的分子量在100-50 000Da之間。
20.權利要求19的藥物，其中所述分子量在100-5000Da之間。
21.權利要求18的藥物，其中所述化合物為膽固醇類似物或含有蛋白或肽或脂肪酸的化合物。
全文摘要
本發明描述了分離能夠結合膽固醇和/或膽固醇吸收抑制劑的腸蛋白的方法。
文檔編號A61K38/00GK1668642SQ03817332
公開日2005年9月14日 申請日期2003年7月28日 優先權日2002年8月6日
發明者W·克拉默, W·弗裡克 申請人:安萬特醫藥德國有限公司