肌肉抑制素(gdf8)抑制劑和皮質類固醇聯合用於治療神經肌肉紊亂的用途的製作方法

2023-05-28 11:29:36

專利名稱：肌肉抑制素(gdf8)抑制劑和皮質類固醇聯合用於治療神經肌肉紊亂的用途的製作方法
技術領域：
本發明涉及臨床病理生理學領域，更具體地涉及治療神經肌肉紊亂，如肌營養不良的方法。本發明還涉及含有皮質類固醇和生長和分化抑制劑的藥物製劑。
背景技術：
肌營養不良(MD)是進行性遺傳的神經肌肉紊亂，其特徵是肌肉消瘦和肌無力(Emery(2002)The Lancet，359687-695)。許多形式的肌營養不良是致命的並且當前不能治癒的。
杜興肌營養不良(DMD)是最常見的X-連鎖的神經肌肉疾病。該疾病由編碼肌營養不良蛋白的DMD基因的突變引起。該蛋白質的改變或者缺失導致異常肌纖維膜撕裂。近側肌肉中肌纖維直徑的異常改變(萎縮性和肥大纖維)和進行性肌肉損傷是該疾病的標誌。受損的肌肉釋放細胞內酶肌酸激酶(CK)。結果，DMD患者中血清CK水平特徵為很高(最高達正常水平的10倍)。組織炎症、肌纖維壞死和纖維脂肪組織對肌肉的更替的複合作用導致該病理生理級聯。
DMD基因的另一種等位基因變體導致MD的較輕的形式，其稱作貝克爾肌營養不良(BMD)。BMD在臨床上與DMD相似，但是症狀的發作在生命中較晚出現。
已經在MD中嘗試了許多藥理學試劑，但是沒有一種被證明可以有效抑制所述疾病的進程。當前的治療形式仍然處於理療和康復領域。
使用皮質類固醇(例如，強的松和/或其衍生物)的許多試驗已經表明患有MD個體的改善，尤其短期改善。儘管皮質類固醇減輕該疾病表型的確切機制還不清楚，但是認為皮質類固醇通過減輕炎症、抑制免疫系統、改善鈣體內穩態、上調代償性蛋白質的表達，和增加成肌細胞增殖來發揮作用(Khurana等人(2003)Nat.Rev.Drug Discovery2279-386)。然而，隨時間推移施用皮質類固醇可以誘導肌萎縮，其主要影響近側肌肉——在DMD和BMD中受影響的相同的肌肉。皮質類固醇誘導的肌肉和其他副作用限制了皮質類固醇治療的長期有效性。
GDF-8是TGF-β超家族的成員並且作為肌肉生長的負調節劑起作用。類似於該超家族的其他成員，GDF-8以前體分子合成，但是在分泌前，該前體分子被切割成N-末端抑制性前肽和C末端活性成熟的GDF-8。前肽可以保持結合GDF-8，從而抑制成熟GDF-8的生物學活性。前肽必須從複合體解離以便GDF-8結合激活蛋白II型受體(ActRIIB)。結合後，ActRIIB啟動信號傳導級聯，最終導致成肌細胞發展的抑制。已經表明在體內GDF-8的抗體介導的抑制顯著增加正常成年小鼠中骨骼肌大小(Whittemore等人(2003)BBRC，300965-971)和減輕DMD的mdx小鼠模型中的營養不良表型(Bogdanovich等人(2002)Nature，420(28)418-421)。
發明概述本發明的一個目的是提供治療特徵是或者與肌肉功能減弱的危險相關的紊亂的方法和組合物。本發明的其他目的將在下面說明書中部分給出，並且部分從該說明書可以理解，或者可以通過實施本發明而知道。
本發明部分基於如下發現和闡明在DMD的小鼠模型中，通過施用中和性抗-GDF-8抗體和強的松的治療相對於僅用強的松的治療更有效地增加肌肉量和強度。本發明還部分基於如下發現和闡明，即施用抗-GDF-8抗體和強的松減小了強的松誘導的肌萎縮。
因此，本發明提供了治療哺乳動物中神經肌肉紊亂的方法。所公開的方法包括對易遭受或者患有神經肌肉紊亂的受試者施用治療有效量的至少一種GDF-8抑制劑和至少一種皮質類固醇，以便保持肌肉完整性或者功能的所希望的水平，所述肌肉完整性或者功能的所希望的水平可以通過例如，肌酸激酶(CK)的血清濃度、肌肉組織學、組織成像、日常生活的活動、肌肉強度和/或量來評估。通過本發明的方法治療的群體包括，但不限於，患有或者有危險患有肌肉營養不良(例如DMD或BMD)的患者和由於這些或者其他疾病正經歷皮質類固醇治療的受試者。
本發明還提供了治療肌無力的方法和治療皮質類固醇誘導的肌萎縮的方法。本發明包括治療心肌病的方法。
提供了用於本發明方法的施用方法和組合物。在所公開的方法中，GDF-8抑制劑和皮質類固醇同時或者在交替重疊或者非重疊的間隔內施用。
用於本發明方法的GDF-8抑制劑包括，但不限於，針對GDF-8的抗體；針對GDF-8受體的抗體；可溶性GDF-8受體和其片段(例如，如美國專利申請號10/689,677中描述的ActRIIB融合多肽，包括其中ActRIIB連接免疫球蛋白的Fc部分的可溶性ActRIIB受體)；GDF-8前肽和其修飾形式(例如，WO 02/068650或者美國專利申請號10/071,499中描述的，包括其中GDF-8前肽連接免疫球蛋白的Fc部分的形式和/或其中GDF-8在天冬氨酸(asp)殘基突變的形式，例如，鼠GDF-8前肽中的asp-99和GDF-8前肽中的asp-100)；GDF-8的小分子抑制劑；卵泡抑素(follistatin)(例如，美國專利號6,004,937中描述)或者含有卵泡抑素結構域的蛋白質(例如，美國專利申請號10/369,736和10/369,738中描述的GASP-1或者其他蛋白質)；和影響GDF-8活化的金屬蛋白酶活性的調節劑，如美國專利申請號10/662,438中描述的。
在一些實施方案中，GDF-8抑制劑是阻斷GDF-8結合其受體的單克隆抗體或者其片段。非限制的闡明性實施方案包括非人單克隆抗-GDF-8抗體，例如，鼠單克隆抗體JA-16(如美國專利申請號10/253,532中描述的；ATCC保藏號PTA-4236)；其衍生物，例如，人源化抗體；和完全人單克隆抗-GDF-8抗體(例如，如美國專利申請號10/688,925中描述的Myo29、Myo28和Myo22；ATCC保藏號分別為PTA-4741、PTA-4740和PTA-4739)或者其衍生物。
用於本發明方法的皮質類固醇包括，但不限於，倍氯美松雙丙酸酯、布地縮松、氫化可的松、地塞米松、丙酸氟地松、糠酸毛他松、強的松、曲安奈德和它們的衍生物。
可以理解前面的一般描述和下面的詳細描述都僅是示例性和解釋性的並且不限制要求保護的本發明。
附圖簡述

圖1A和1B描繪從用抗-GDF-8中和抗體JA-16(60mg/kg，每周一次)和強的松(2mg/kg，每周3次)、僅強的松或僅載體對照治療4周的mdx小鼠的隔肌的組織學分析結果。圖1A顯示了試驗結束時0-4等級的肌纖維萎縮的嚴重性。圖1B顯示了試驗結束時受影響的(萎縮的)肌纖維的百分數。每個條形代表一隻小鼠。
發明詳述I.定義為了更容易理解本發明，首先定義某些術語。在發明詳述全文中給出了額外的定義。
文中所用術語「抗體」指免疫球蛋白或者其部分，並且包括包含抗原結合部位的任意多肽，而不管來源、產生方法和其他特徵如何。作為非限制性實例，術語「抗體」包括人、猩猩、小鼠、大鼠、山羊、綿羊和雞抗體。所述術語包括但不限於多克隆抗體、單克隆抗體、單特異性抗體、多特異性抗體、非特異抗體、人源化抗體、單鏈抗體、嵌合抗體、合成抗體、重組抗體、雜合抗體、突變抗體和CDR-移植抗體。對於本發明的目的，除非另外說明，所述術語還包括抗體片段，如Fab、F(ab′)2、Fv、seFv、Fd、dAb和保留抗原結合功能的其他抗體片段。
可以例如，通過傳統的雜交瘤技術(Kohler和Milstein(1975)Nature，256495-499)、重組DNA方法(美國專利號4,816,567)或者使用抗體文庫的噬菌體展示技術(Clackson等人(1991)Nature，352624-628；Marks等人(1991)J.Mol.Biol.，222581-597)製備抗體。對於多種其他抗體產生技術，見AntibodiesA LaboratoryManual，編者Harlow等人，Cold Spring Harbor Laboratory，1988。
術語「抗原結合結構域」指抗體分子的部分，其包含特異結合抗原的部分或全部或者與抗原的部分或全部互補的區域。當抗原很大時，抗體可以僅結合抗原的特定部分。表位或者抗原決定簇是抗原分子的一部分，其負責與抗體的抗原結合結構域的特異相互作用。通過一個或多個抗體可變結構域可以提供抗原結合結構域(例如，由VH結構域組成的所稱作的Fd抗體片段)。抗原結合結構域包含抗體輕鏈可變區(VL)和抗體重鏈可變區(VH)。
術語「抗-GDF-8抗體」或者「針對GDF-8的抗體」指特異結合GDF-8的至少一個表位的任意抗體。術語「GDF-8受體抗體」和「針對GDF-8受體的抗體」指特異結合GDF-8受體，如ActRIIB的至少一個表位的任意抗體。術語「中和抗體」指抗體，其是GDF-8抑制劑。
術語「特異相互作用」或者「特異結合」等等指兩個分子形成複合體，其在生理條件下是相對穩定的。該術語還可應用於例如抗原結合結構域對特定表位特異時，所述表位可以存在於許多抗原上。特異結合的特徵是高親和性和低到中等能力。非特異結合通常具有低親和性，具有中等到高能力。通常，當親和性常數Ka高於106M-1，高於107M-1，或優選高於108M-1時，認為結合是特異的。如果必要，通過改變結合條件可以減小非特異結合而基本上不影響特異結合。此類條件是本領域已知的，並且技術人員使用常規技術可以選擇適宜的條件。通常根據抗體的濃度、溶液的離子強度、溫度、允許結合的時間、不相關分子(例如，血清清蛋白、乳酪蛋白)的濃度等限定條件。
術語「肌肉功能」指肌肉執行生理功能的能力，所述生理功能如收縮，其可以通過顫搐或者強直收縮期間產生的力的量來測量。用於評估肌肉功能的其他方法是本領域公知的，並且包括，但不限於，測量肌肉量、抓握力量、血清CK水平、日常生活的活動、運動或者強度試驗、組織組織學(例如，EA染色，或者膠原III染色)，或者組織成像。評估肌肉功能的非限制性闡明性方法在實施例中給出。
術語「GDF-8」指特異生長和分化因子-8，適宜時指結構上或者功能上與GDF-8相關的因子，例如BMP-11和屬於TGF-β超家族的其他因子。該術語指GDF-8的全長未加工的前體形式以及翻譯後切割導致的成熟的和前肽形式。該術語還指GDF-8的任意片段和變體，其保持與如本文討論的成熟GDF-8相關的至少某些生物學活性，包括已經修飾的序列。本發明涉及來自所有脊椎動物物種的GDF-8，包括，但不限於人、牛、雞、小鼠、大鼠、豬、綿羊、火雞、狒狒和魚(序列信息見例如，McPherron等人(1997)Proc.Nat.Acad.Sci.U.S.A.，9412457-12461)。
術語「成熟GDF-8」指從GDF-8前體蛋白質的羧基末端結構域切割的蛋白質。成熟GDF-8可以作為單體、同型二聚體或者以GDF-8潛在複合體存在。取決於條件，成熟GDF-8可以在任意或者所有這些不同形式之間建立平衡。在其生物學活性形式中，成熟GDF-8也稱作「活性GDF-8」。
術語「GDF-8前肽」指從GDF-8前體蛋白質的氨基末端結構域切割的多肽。GDF-8前肽能夠結合成熟GDF-8上的前肽結合結構域。
術語「GDF-8潛在複合體」指成熟GDF-8同型二聚體和GDF-8前肽之間形成的蛋白質複合體。認為兩個GDF-8前肽結合同型二聚體中兩分子成熟GDF-8形成無活性的四聚體複合體。潛在複合體可以包括代替或者除了一個或多個GDF-8前肽以外的其他GDF抑制劑。
術語「GDF-8活性」指與活性GDF-8蛋白質相關的一種或多種生理學生長調節或者形態發生活性。例如，活性GDF-8是骨骼肌量的負調節劑。活性GDF-8還可以調節肌肉特異酶(例如，肌酸激酶)的產生，刺激成肌細胞增殖，和調節前脂肪細胞(preadipocyte)分化成脂肪細胞。測量體內和體外GDF-8活性的示例性方法見例如，美國專利申請號10/688,925。
文中所用的「GDF-8抑制劑」通常指下調GDF-8活性的任意化合物，並且包括能夠抑制GDF-8的活性、表達、加工或分泌的任意試劑。GDF-8抑制劑可以例如，影響前體分子的穩定性或者向活性成熟形式的轉化；幹擾GDF-8與一種或多種受體的結合；或者幹擾GDF-8受體ActRIIB的胞內信號傳導。此類抑制劑包括特異抑制GDF-8的蛋白質、抗體、肽、肽模擬物(peptidomimetics)、核酶、反義寡核苷酸、雙鏈RNA和其他小分子。可以說這樣的抑制劑「抑制」、「中和」或者「減小」GDF-8的生物學活性。
術語「中和」、「中和性」、「抑制性」和它們的同源詞指相對於不存在GDF-8抑制劑時GDF-8的活性，GDF-8抑制劑導致GDF-8活性的減小。活性的減小優選為至少約10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更高。評估GDF-8抑制劑的中和或者抑制性生物學活性的方法是本領域已知的，並且可以例如，使用ActRIIB測定法(見，例如，Whittemore等人(2003)BBRC，300965-97；或美國專利申請號10/253,532中描述的)和RGA測定法(如Tbies(2001)Growth Factors，18251-259或美國專利申請號10/253,532中描述的)來進行。
術語「治療有效劑量」或者「治療有效量」指導致患者中症狀的預防、發生所述症狀的危險降低或者減輕所述症狀，或者導致所希望的生物學結果，例如，改善的肌肉功能、臨床症狀發作延遲等等的化合物的量。可以如隨後章節中描述的測定有效量。
術語「治療」、「治療方法」和它們的同源詞指治療或預防/預防性措施。需要治療的那些個體可以包括已經患有特定醫學紊亂的個體以及可能最終患該紊亂的那些個體。治療包括本申請中描述的紊亂的任意症狀的任意減輕。除了減少或者減輕症狀外，治療還包括當預期惡化時保持患者的當前狀態，或者預防個體中症狀的出現，在所述個體中預期症狀、紊亂或者疾病發作。治療可以包括從正常水平降低或者減少一種或多種生理功能。治療還可以包括與狀況、紊亂或者疾病的預計的症狀或者預計的進展相比的減小。
II.用於本發明方法的成分在本發明的方法中，一種或多種GDF-8抑制劑與一種或多種皮質類固醇聯合使用。
A.GDF-8抑制劑用於本發明方法的GDF-8抑制劑包括，但不限於，針對GDF-8的抗體；針對GDF-8受體的抗體；可溶性GDF-8受體和其片段(例如，如美國專利申請號10/689,677中描述的ActRIIB融合多肽，包括其中ActRIIB連接免疫球蛋白的Fc部分的可溶性ActRIIB受體)；GDF-8前肽和其修飾形式(例如，WO 02/068650或者美國專利申請號10/071,499中描述的，包括其中GDF-8前肽連接免疫球蛋白的Fc部分的形式和/或其中GDF-8在天冬氨酸(asp)殘基突變的形式，例如，鼠GDF-8前肽中的asp-99和GDF-8前肽中的asp-100)；卵泡抑素(例如，美國專利號6,004,937中描述)或者含有卵泡抑素結構域的蛋白質(例如，美國專利申請號10/369,736和10/369,738中描述的GASP-1或者其他蛋白質)；和影響GDF-8活化的金屬蛋白酶活性的調節劑，如美國專利申請號10/662,438中描述的。
在一些實施方案中，GDF-8抑制劑是阻斷GDF-8結合其受體的單克隆抗體或者其片段。非限制的闡明性實施方案包括非人單克隆抗-GDF-8抗體，例如，鼠單克隆抗體JA-16(如美國專利申請號10/253,532中描述的；ATCC保藏號PTA-4236)；其衍生物，例如，人源化抗體；和完全人單克隆抗-GDF-8抗體(例如，如美國專利申請號10/688,925中描述的Myo29、Myo28和Myo22；ATCC保藏號分別為PTA-4741、PTA-4740和PTA-4739)或者其衍生物。
在一些實施方案中，GDF-8抑制劑通過結合GDF-8或者GDF-8受體來阻斷GDF-8結合其受體。在多種實施方案中，GDF-8抑制劑是抗-GDF-8抗體，其具有對GDF-8的親和力，該親和力表達為親和性常數(Ka)，其中Ka為至少105M-1、106M-1、107M-1、108M-1、109M-1、1010M-1、1011M-1或1012M-1。還預計用於人中的是作為任意脊椎動物物種的非人抗體的人源化形式和衍生物的抑制劑，如在本文引用的專利申請或者Antibody Engineering，編者Borrebaeck，第二版，OxfordUniversity Press，1995；和AntibodiesA Laboratory Manual，編者Harlow等人，Cold Spring Harbor Laboratory，1988中描述的。
B.皮質類固醇用於本發明方法的皮質類固醇包括，但不限於倍氯美松雙丙酸酯、布地縮松、氫化可的松、地塞米松、丙酸氟地松、強的松、糠酸毛他松、曲安奈德和它們的衍生物。
還可以使用本文公開的化合物的藥學上可接受的鹽。
通過商業途徑可以以多種藥物製劑得到皮質類固醇(Physician′sDesk Reference(PDR)2003，第57版，Medical Economics Company，2002)。例如，可以通過商業途徑得到可的松、氫化可的松(Cortef)、強的松(Deltasone、Meticorten、Orasone)、強的松龍(Delta-Cortef、Pediapred、Prelone)、去炎松(Aristocort、Kenaeort)、甲基強的松龍(Medrol)、地塞米松(Decadron、Dexone、Hexadrol)、倍他米松(Celestone)和去氟可特(Calcort)的經口製劑。這些和其他皮質類固醇的其他製劑可以用於本發明的方法中。
C.治療和預防方法本發明提供了治療哺乳動物受試者的方法，包括治療肌肉功能喪失、肌無力和/或皮質類固醇誘導的肌萎縮的方法。
本發明的方法包括對哺乳動物施用治療有效量的至少一種GDF-8抑制劑和治療有效量的至少一種皮質類固醇，其用量和施用時間段足夠治療至少一種肌肉功能喪失、肌肉量、肌無力、肌萎縮或者心肌病。所述方法可以用於治療神經肌肉紊亂，如肌營養不良。在一些實施方案中，相對於不存在GDF-8抑制劑或者皮質類固醇時的相同治療，肌肉功能得到改善。所治療的肌肉包括，但不限於，腓腸肌、脛骨肌、前肌、四頭肌、指伸肌、心肌或者隔肌。
神經肌肉疾病包括，但不限於，損害肌肉功能、導致肌肉損傷或者導致肌肉量和/或功能減小的任意急性或慢性疾病或紊亂。多種疾病或紊亂是已知的並且包括，例如，肌營養不良，如杜興肌營養不良、貝克爾肌營養不良、埃-德肌營養不良、肢帶肌營養不良、強直性脊柱症候群、Ullrich症候群、Fukuyama肌營養不良、Walker-Warburg症候群、肌-眼-腦病、面肩胛肱骨肌營養不良、先天性肌營養不良、強直性肌營養不良(Steinert氏病)、非營養不良性肌強直、周期性麻痺脊髓性肌萎縮、家族性肌萎縮性側索硬化症、遺傳性運動和感覺神經病、Charcot-Marie-Tooth病、慢性炎性神經病、遠端肌病、肌管性/中央核性肌病、線狀體肌病、小核病(mini core disease)、中央軸空病、desminopathy、包涵體肌炎、線粒體肌病、先天性肌無力症候群、脊髓灰質炎後肌肉功能障礙和Emery(2002)The Lancet，359687-695；和Khurana等人(2003)Nat.Rev.Drug Disc.，2379-386中描述的病症。患者可以表現出輕微、中等或者嚴重的肌無力、肌肉消瘦和對與這種紊亂相關的獨立走動的影響。患有或者有危險患有這些紊亂的患者將從GDF-8抑制劑和皮質類固醇受益。
通常，將從GDF-8抑制劑和皮質類固醇的共同施用受益的患者將是顯示出血清CK活性2-10倍或以上的增加、陽性家族史、肌纖維直徑的異常變異、肌營養不良蛋白缺陷或者肌營養不良蛋白基因的突變、肌肉量喪失、肌無力、心肌病和/或肌強度喪失的患者。在Diagnostic Criteria for Neuromuscular Disorders，編者Emery，第二版，Royal Society of Medicine Press，1997中描述了診斷方法，包括適宜的遺傳試驗。組合治療對於經歷不同於神經肌肉紊亂的紊亂的皮質類固醇治療的受試者和/或有太長的皮質類固醇使用史從而這些受試者表現出或者有危險減小肌肉功能，如特徵是肌無力、肌肉量喪失和/或肌萎縮等等的受試者也是有益的。通常使用皮質類固醇治療的紊亂的實例包括，但不限於，哮喘、變態反應、關節炎、皮膚紊亂(例如，炎性皮膚病、溼疹、牛皮癬等等)、紅斑狼瘡和其他慢性炎性狀況。
提供了用於本發明方法的施用方法和組合物。施用不限於任何具體遞送系統，並且可以包括但不限於，腸胃外(包括皮下、靜脈內、髓內、關節內、肌內或者腹膜內注射)、直腸、局部、經皮或者經口(例如，在膠囊、懸浮液或者片劑內)。可以以單劑或者以重複施用，和以多種生理上可接受的鹽形式的任一種，和/或使用可接受的藥物載體和/或添加劑作為藥物組合物的部分對個體施用。生理上可接受的鹽形式和標準藥物製劑技術和賦形劑是本領域技術人員熟知的(例如，Physician′s Desk Reference(PDR)2003，第57版，Medical EconomicsCompany，2002；和RemingtonThe Science and Practice ofPharmacy，編者Gennado等人，第20版，Lippincott，Williams Wilkins，2000中描述的)。
將GDF-8抑制劑和皮質類固醇同時或者連續地在重疊或非重疊間隔內施用。在順序施用中，可以以任意順序施用GDF-8抑制劑和皮質類固醇。在一些實施方案中，重疊或非重疊間隔的長度多於2、4、6、12、24或48周。
對於皮質類固醇，處方醫生常規地選擇劑量和方案。例如，強的松以約0.1-2mg/kg體重/天，最通常0.5-1mg/kg/天，例如，0.75mg/kg/天使用。皮質類固醇可以以平均每周一次劑量約1-14mg/kg體重施用，包括約1、2、5、7、10、12或15mg/kg體重/周，且處方醫生可以選擇適宜的施用頻率。可以選擇單劑、連續或者定期的皮質類固醇施用，包括每小時一次、每天一次、每周兩次、每周一次或者其他定期間隔。優選地，每天經口或者注射1-4次施用皮質類固醇。皮質類固醇劑量可以被最優化為聯合治療，並且可以降低劑量以減小施用的嚴重副作用。
GDF-8抑制劑可以單獨或者以與皮質類固醇或者另一種化合物的混合物施用。GDF-8抑制劑可以以約1μg/kg到25mg/kg的劑量施用，這取決於生理學、症狀的嚴重性和疾病的發展。可以選擇單劑、連續或者定期施用，所選的GDF-8抑制劑劑次之間的間隔可以為每小時一次、每天一次、每周兩次、每周一次、每月兩次、每月一次或者其他適宜的間隔。例如，可以通過靜脈內(IV)輸注、腹膜內或者皮下注射以每周施用一次在門診患者背景中以約0.1-10mg/kg劑量施用GDF-8抑制劑，如抗體。通常，由治療臨床醫生選擇GDF-8抑制劑的適宜的治療有效劑量，並且所述有效劑量可以為約1μg/kg到20mg/kg，1μg/kg到10mg/kg，1μg/kg到1mg/kg，10μg/kg到1mg/kg，10μg/kg到100μg/kg，100μg到1mg/kg，以及500μg/kg到5mg/kg。GDF-8抑制劑的示例性有效劑量包括約0.1、0.3、0.5、1、5、10或者20mg/kg/周。此外，可以使用實施例或者Physician′s Desk Reference(PDR)2003，第57版，Medical Economics Company，2002中指出的特定劑量。
D.測試化合物的治療功效的方法本發明還提供了在動物，例如齧齒動物或者靈長類動物中測試治療化合物當與至少一種GDF-8抑制劑和至少一種皮質類固醇聯合施用時是否有效的方法。在一些實施方案中，評估化合物的功效的方法包括對第一個動物聯合施用所述化合物與GDF-8抑制劑和皮質類固醇；對第二個動物施用GDF-8抑制劑和皮質類固醇；施用後測定第一和第二個動物中肌肉功能水平；和比較肌肉功能水平。如果第一個動物中水平低於第二個動物中水平，那麼表明所述化合物或者聯合是有效的。
在其他實施方案中，當化合物與GDF-8抑制劑和/或皮質類固醇聯合施用時，可以評估所述化合物治療肌營養不良的功效。
一些動物模型可以用於此類評估目的。例如，Torres等人(1987)Brain，110269-299，和Hoffman等人(1987)Science，238347-350已經描述的mdx模型。在由於肌纖維膜損傷導致的mdx小鼠和DMD人中總是注意到CK的極高水平和肌營養不良蛋白的缺陷(Bulfield等人(1984)Proc.Natl.Acad.Sci.USA，811189-1192；和Matsuda等人(1995)J.Biochem.(Tokyo)，118959-64)。作為另一實例，可以使用兩種其他動物模型utr-/-mdx小鼠(Gillis(2002)Neuromuscul.Disord.，12(1)90-84；和Deconick等人(1997)Cell，90729-738)和nu-/-mdx小鼠(Morrison等人(2000)Lab.Invest.，80881-891)。
實施例實施例1GDF-8中和抗體對營養不良肌肉的作用在DMD的mdx小鼠模型中試驗了GDF-8的體內抑制可以改善肌營養不良的能力。對5到7周齡雄性C57BL/10ScSn-mdx/j小鼠(Jackson Laboratory，Bar Harbor，ME)以每周一次腹膜內注射GDF-8中和性鼠抗體JA-16(60mg/kg，第一周兩倍給藥，n＝11)和僅載體(對照組，n＝10)治療12周。還將這些小鼠與沒有肌營養不良蛋白缺陷的相同背景品種(C57BL/10，n＝12)的小鼠進行比較。
在治療之前、期間和之後監控體重。治療組中的小鼠相對於載體對照組中的小鼠增重。結果在表1中顯示。
表1.總體重(g)平均值與SEM
給藥6和10周後還將小鼠進行抓握試驗。在4和10周時治療組中的小鼠分別比載體對照組中的小鼠具有高9％(p＝0.09)和19％(p＜0.05)的抓握力量。結果在表2中顯示。
表2.抓握力量(lb)平均值與SEM
為了定量治療和載體對照之間肌肉量的差異，將動物處死並解剖四頭肌和腓腸肌並稱重。治療組動物的四頭肌重量比對照大13％(0.371±0.009對0.317±0.008g；p＜0.05)。治療組動物的腓腸肌重量比對照大17％(0.223±0.008對0.197±0.005g；p＜0.0005)。
實施例2GDF-8中和性抗體和強的松對正常和營養不良肌肉的作用雄性C57BL/10ScSn-mdx/j和C57BL/10(Jackson Laboratory，Bar Harbor，ME)。在5-7周齡開始注射小鼠單克隆抗-GDF-8抗體JA-16、強的松(P-9901，Sigma)或者載體(花生油)4周。以60mg/kg/周的劑量用JA-16腹膜內(IP)注射小鼠(第一周雙倍給藥)或者用強的松以2mg/kg，每周3次皮下(SC)注射。
在治療之前、期間和之後監控體重和抓握力量。結果分別在表3和表4中顯示。
表3 總體重(平均值±SEM，g)
表4.抓握力量(平均值±SEM，lb)
在研究結束時，將小鼠處死並通過解剖和稱重腓腸肌和四頭肌來估計肌肉量。結果在表5中顯示。為了證實強的松的生物學活性，收集來自小鼠的單獨群組的血清並分析IL6和IL1β(Ani Lytics，Inc.，Gaithersburg，MD)。發現在用強的松治療的小鼠的血清中兩種細胞因子都減少。
表5.肌肉重量(平均值±SEM，g)
因此，結果表明在肌營養不良中，施用GDF-8的抑制劑，即抗-GDF-8抗體和強的松可以相對於僅用強的松或者載體的治療有效增加肌肉量和強度。
此外，在這些研究中，JA16加強的松治療(實施例2)的效果大於僅用JA16治療的效果(實施例1)。四周治療後與載體相比體重的增加對於JA16加上強的松的治療比僅JA16的治療更顯著。用JA16加強的松治療4周後抓握力量與載體對照相比的增加比僅用JA16治療6或10周後的增加更大。用JA16加強的松治療4周後相對於載體對照的肌肉量的增加比僅用JA16治療12周後的增加更大。
實施例3GDF-8中和性抗體對強的松誘導的肌萎縮的作用在如實施例2中所述治療的小鼠中，如實施例1中所述通過組織學檢查隔肌。通過獨立的病理學實驗室評估形態學改變，該實驗室不了解治療組分配。在0到4的等級上分配嚴重性等級(0＝無；1＝最小；2＝輕微；3＝中等；4＝顯著)。結果在圖1A(嚴重性得分)和圖1B(萎縮的肌纖維的百分數)。結果表明施用抗-GDF-8抗體和強的松減小強的松誘導的肌萎縮。
實施例4治療肌營養不良作為治療人類中MD的實例，聯合強的松或者強的松龍施用Myo29抗體。在表6中概述了非限制性示例性治療方案和結果。通過治療醫生可以確定其他治療方案，其中皮質類固醇和GDF-8抑制劑的劑量範圍和施用如上述。
表6
將引用的所有出版物和專利和通過保藏號或者資料庫參考號鑑定的序列完整引用作為參考。
權利要求
1.治療肌肉功能減弱的哺乳動物的方法，其包含對所述哺乳動物施用治療有效量的至少一種GDF-8抑制劑和治療有效量的至少一種皮質類固醇，其用量和施用時間段足以治療肌肉功能的減弱。
2.權利要求1的方法，其中通過選自肌肉量、肌肉收縮力、血清CK濃度或者肌肉形態學的至少一種參數評估至少一種肌肉的肌肉功能。
3.權利要求1的方法，其中治療其功能的肌肉選自腓腸肌、脛骨前肌、四頭肌、指長伸肌、心肌或者隔肌的至少一種。
4.權利要求1的方法，其中治療所述哺乳動物導致所述哺乳動物的體重增加。
5.權利要求1的方法，其中治療所述哺乳動物導致抓握力量增加。
6.治療肌無力的方法，其包括對哺乳動物施用治療有效量的至少一種GDF-8抑制劑和治療有效量的至少一種皮質類固醇，其用量和施用時間段足以治療肌肉強度的喪失。
7.治療皮質類固醇誘導的肌萎縮的方法，其包括對哺乳動物施用足以治療皮質類固醇誘導的肌萎縮的治療有效量的至少一種GDF-8抑制劑。
8.治療神經肌肉紊亂的方法，其包括對患有或者有危險患有神經肌肉紊亂的哺乳動物施用治療有效量的至少一種GDF-8抑制劑和治療有效量的至少一種皮質類固醇，其用量和施用時間段足以治療所述神經肌肉紊亂。
9.權利要求8的方法，其中所述神經肌肉紊亂是肌營養不良。
10.權利要求9的方法，其中所述肌營養不良是杜興肌營養不良。
11.權利要求9的方法，其中所述肌營養不良是貝克爾肌營養不良。
12.權利要求1-11任一項的方法，其中所述哺乳動物是人。
13.權利要求1-11任一項的方法，其中所述皮質類固醇選自(a)倍氯美松雙丙酸酯、布地縮松、氫化可的松、地塞米松、丙酸氟地松、糠酸毛他松、強的松或曲安奈德的至少一種；(b)倍氯美松雙丙酸酯、布地縮松、氫化可的松、地塞米松、丙酸氟地松、糠酸毛他松、強的松或曲安奈德的至少一種的衍生物；或(c)倍氯美松雙丙酸酯、布地縮松、氫化可的松、地塞米松、丙酸氟地松、糠酸毛他松、強的松或曲安奈德的至少一種的藥學上可接受的鹽的至少一種。
14.權利要求1-11任一項的方法，其中所述皮質類固醇是強的松或者強的松龍。
15.權利要求1-11任一項的方法，其中所述皮質類固醇以0.1到2.0mg/kg/天的劑量施用。
16.權利要求1-11任一項的方法，其中經口施用所述皮質類固醇。
17.權利要求1-11任一項的方法，其中所述GDF-8抑制劑選自針對GDF-8的抗體、針對GDF-8受體的抗體、可溶性GDF-8受體、GDF-8前肽、GDF-8的小分子抑制劑、卵泡抑素或者含有卵泡抑素結構域的蛋白質。
18.權利要求17的方法，其中所述針對GDF-8的抗體選自JA-16、Myo29、Myo28或Myo22。
19.權利要求17的方法，其中所述GDF-8前肽在天冬氨酸殘基處突變。
20.權利要求17的方法，其中所述GDF-8前肽連接免疫球蛋白的Fc部分。
21.權利要求17的方法，其中所述GDF-8受體是ActRIIB。
22.權利要求17的方法，其中所述GDF-8受體連接免疫球蛋白的Fc部分。
23.權利要求17的方法，其中所述GDF-8抑制劑是卵泡抑素。
24.權利要求17的方法，其中所述含有卵泡抑素結構域的蛋白質是GASP-1。
25.權利要求17的方法，其中所述GDF-8抑制劑是小分子抑制劑。
25.權利要求1的方法，其中所述方法導致所述哺乳動物的心肌病的治療。
26.權利要求1的方法，其中所述GDF-8抑制劑和皮質類固醇的施用是同時的。
27.權利要求1的方法，其中所述GDF-8抑制劑和皮質類固醇的施用是順序的。
28.權利要求8的方法，其中所述GDF-8抑制劑和皮質類固醇的施用是同時的。
29.權利要求8的方法，其中所述GDF-8抑制劑和皮質類固醇的施用是順序的。
全文摘要
本公開內容提供了治療哺乳動物中神經肌肉紊亂的方法。所公開的方法包括對易受或者患有神經肌肉紊亂的受試者施用治療有效量的GDF－8抑制劑和皮質類固醇，從而保持肌肉功能的所希望的水平。
文檔編號A61P21/00GK1829532SQ200480022134
公開日2006年9月6日 申請日期2004年6月1日 優先權日2003年6月2日
發明者L·－A·懷特穆爾, 李湘萍 申請人:惠氏公司