聚丙烯醯胺凝膠上一種安全環保的dna銀染方法
2023-05-28 11:13:36 2
專利名稱：聚丙烯醯胺凝膠上一種安全環保的dna銀染方法
技術領域：
本發明屬於生物檢測技術領域，具體而言，本發明涉及還原性糖在聚丙烯醯胺凝膠上對DNA染色顯影的方法，其安全環保、步驟簡單、操作時間短而且靈敏度高。另外，本發明還涉及檢測DNA的方法以及用於這些方法的試劑盒等
背景技術：
當前，在聚丙烯醯胺凝膠上電泳分離DNA並使DNA條帶顯色(可視化)，已經成為生物檢測中最常用的方法之一。其中，使在聚丙烯醯胺凝膠上的DNA條可視化可以採用螢光染料、可視有機染料和銀可視有機染料，如亞甲藍[1]、亮甲酚藍[2]、結晶紫[3]、和尼羅河藍 [4』5]等，其靈敏性低而且操作耗時。染等。螢光染料，如溴化乙錠(EB)、STOR green JPSTOR gold，該方法一方面呈現出操作簡便、靈敏度相當，另一方面有表現為它們都需要昂貴的專門螢光檢測儀器、一些螢光染料具有致突變作用會威脅操作者的健康、許多螢光檢測結果不穩定等這些難以克服的缺點，極大地限制了它們的使用[6_8]。而銀染技術已經在廣泛應用於對聚丙烯醯胺凝膠上電泳分離的蛋白質的檢測，它具有不可比擬的高靈敏度δ]，也有報導銀染[1°_12]能用於核酸[13]和脂多糖[14]的染色。銀染技術根據用含銀離子的溶液浸滲中所用的試劑而分成兩大類。一類被稱為銀氨染色法，其使用銀-氨溶液來浸滲凝膠，並用含甲醛的酸性溶液來顯色，但是其靈敏性低而且操作過程費時[15]；另一類用酸性銀離子溶液染色，其中凝膠浸滲在PH為弱酸性的硝酸銀中，然後在鹼性條件下用甲醛還原，然而其在進行核酸(DNA和RNA)檢測時，要麼染色靈敏度高但操作過程比較複雜[16]，要麼操作過程較簡單但靈敏度不高[17_19]，但都避免不了甲醛試劑本身對人體的健康傷害。為此，本發明人經過長期實踐研究，令人驚訝地在硝酸銀染色法的基礎上發明了一種以葡萄糖做為還原劑的DNA銀染法，應用還原性糖代替致癌、致過敏和強揮發性的甲醛試劑，並進行方法整體的的改進，在適當提高檢測靈敏性的基礎上，簡化步驟，僅僅在約 45分鐘的操作時間內就能檢測到皮克(picogram)級的DNA條帶(可達5pg)。另外，本發明人還發明了葡萄糖-DNA銀染法以及用於這些方法的試劑盒等。
發明內容
本發明的目的在於提供在聚丙烯醯胺凝膠上對核酸(以DNA為代表)染色的方法，其在檢測靈敏性和操作方便程度上帶來了綜合性能的改善。另外，本發明的目的還在於提供檢測DNA的方法以及用於這些方法的試劑盒等。具體而言，在第一方面，本發明的目的在於提供在聚丙烯醯胺凝膠上對DNA染色的方法，其為酸性銀離子染色法，其特徵在於，所述方法中的銀離子還原劑為還原性糖，替代甲醛作為顯影成分。本發明第一方面的方法通常在聚丙烯醯胺凝膠電泳分離DNA後使用，對聚丙烯醯胺凝膠上的DNA條帶進行染色，儘管不優選，但是該方法也可以在用其他方式使DNA包裹在聚丙烯醯胺凝膠中之後使用。在本文中，硝酸銀染色法本身為現有技術[15]， 其依次包括固定步驟、第一次洗滌步驟、浸滲步驟、第二次洗滌步驟、顯色步驟和終止顯色
3反應步驟。其中，顯色步驟是用甲醛溶液浸滲聚丙烯醯胺凝膠。由於本發明相對於現有技術一酸性銀離子溶液染色法的顯色步驟，使用還原性糖代替甲醛試劑，其中以葡萄糖效果最佳，避免了甲醛本身對操作者的健康傷害，並從整體上簡化縮短方法流程。優選在本發明的第一方面，所述方法依次包括固定步驟、第一次洗滌步驟、浸滲步驟、第二次洗滌步驟、顯色步驟和終止顯色反應步驟。這樣，該方法在達到上述優點後還保留了現有酸性銀離子溶液染色法的檢測靈敏度。在本文中，「依次」指的是所針對的步驟按其所出現的順序執行，不能與其他步驟交換執行的順序。優選在本發明的第一方面，所述方法依次由固定步驟、第一次洗滌步驟、 浸滲步驟、第二次洗滌步驟、顯色步驟和終止顯色反應步驟。在本文中，「第一次」與「第二次」用於區別洗滌步驟在操作流程上的次序，並不構成對洗滌步驟本身執行過程的限制。在本文中，「洗滌」指的是用溶劑清洗聚丙烯醯胺凝膠， 用以洗去上一步驟殘留在聚丙烯醯胺凝膠上的試劑。其中，優選溶劑是水、生理鹽水或緩衝液，如Tris-HCl緩衝液、PBS緩衝液等，最優選是去離子水。優選在本發明的第一方面，所述方法中第一次洗滌步驟是用水洗滌聚丙烯醯胺凝膠。本發明人研究發現，第一次洗滌對於最終染色效果有顯著的提升，是必須的，但是洗滌時間可以不必過長。因此優選其中，洗滌時間大於等於3分鐘，更優選為5-30分鐘，最優選為5分鐘，洗滌次數為三次。其中這樣最優選的方式在保證有效清洗的基礎上明顯地節約了操作時間。在本文中，「浸滲」指的是用硝酸銀溶液浸泡聚丙烯醯胺凝膠，用以使銀離子滲入聚丙烯醯胺凝膠中並結合到凝膠中的DNA上。優選在本發明的第一方面，本發明人研究發現，浸滲的時間以及溶液中硝酸銀含量對於最終染色效果有顯著的影響。因此為了進一步提高染色效果，提高檢測靈敏度並節約操作時間，優選浸滲時間為5-60分鐘，更優選為 8-30分鐘，最優選為5分鐘；優選硝酸銀的濃度為0. 05% -0. 4%，更優選為0. 1% -0. 3%, 最優選為0.2%。另外，在本文中如未特別指出，所述「溶液」均為水溶液，即溶劑為水，優選明示出其中所含的溶質為所述溶液中的全部溶質；也優選對於液體溶質來說，其百分比濃度指的是體積百分比濃度，而對於固體溶質來說，其百分比濃度指的是質量百分比濃度。優選在本發明的第一方面，所述方法中第二次洗滌步驟是用水洗滌聚丙烯醯胺凝膠。其中，優選洗滌時間為10秒-5分鐘，最優選洗滌時間為30秒；優選洗滌次數為兩次； 優選其中的水是去離子水。在本文中，「顯色」指的是用含還原劑的鹼性溶液浸泡聚丙烯醯胺凝膠，用以使滲入聚丙烯醯胺凝膠中DNA上的銀離子還原成銀，從而顯現出可觀察的顏色。其中，還原劑通常是甲醛，而鹼為弱鹼，優選是碳酸鈉。優選在本發明的第一方面，所述方法中顯色步驟是用含還原性糖(以葡萄糖為代表)、氫氧化鈉和硼酸的溶液浸聚丙烯醯胺凝膠，其中硼酸和氫氧化鈉組成鹼性緩衝體系，另外，硼酸通過與葡萄糖作用增強了其還原能力。本發明人研究發現，溶液中各組分的含量對於最終染色效果有顯著的影響，尤其是葡萄糖等還原劑的還原作用(還原反應的速度)受由鹼性緩衝體系決定的溶液PH影響。因此，優選氫氧化鈉的濃度分別為150-300mM，更優選為200_300mM，最優選為250mM ；硼酸的濃度分別為 0-200mM，更優選為75-150mM，最優選為100mM。另外，還原劑還原性糖的含量也能顯著影響顯色結果，以葡萄糖為代表，優選葡萄糖的濃度為2% -10%，更優選為6% -10%，最優選為 8%。顯色的時間由整個顯色效果(結合靈敏度和凝膠背景對比度因素)決定，優選為8-10分鐘。在本文中，「終止顯色反應」指的是使聚丙烯醯胺凝膠浸泡於顯色反應終止溶液中，用以終止前述的顯色。通常，顯色反應終止溶液為含乙酸的水溶液。優選在本發明的第一方面，所述方法中終止顯色反應步驟是用乙二胺四乙酸鈉溶液浸聚丙烯醯胺凝膠。其中， 優選1. 5%乙二胺四乙酸鈉溶液，優選時間為5分鐘。在第二方面，本發明的目的在於提供用於本發明第一方面所述方法的試劑盒，其包括分裝的浸滲溶液、顯色溶液和顯色反應終止溶液，其中浸滲溶液是硝酸銀溶液，顯色溶液是含還原劑的鹼性溶液，顯色反應終止溶液是含乙二胺四乙酸鈉的水溶液。優選所述試劑盒包括分裝的硝酸銀浸滲溶液、含硼酸和氫氧化鈉、葡萄糖的顯色溶液、和乙二胺四乙酸鈉溶液。更優選所述試劑盒中各溶液中溶質的含量如本發明第一方面所優選的那樣。儘管不優選，但是所述試劑盒還可以包括分裝的水，如去離子水。在本文中，試劑盒具有本領域技術人員所能理解的含義，在本文中，其包括分開的容器，分別包裝(即，分裝)不同的溶液。這樣，不同的溶液之間不會發生混合。其中，容器是任何能夠保存其所儲存的溶液的容器，如玻璃瓶、塑料罐等，優選是能夠長期保存其所儲存的溶液的容器。另外，優選本發明第二方面的試劑盒還包括記載有本發明第一方面所述方法的說明書。說明書可以是獨立的，如紙質說明書，其被放入試劑盒中；說明書也可以是直接印刷在試劑盒上的，如可以印刷在試劑盒中的一個或多個容器上。為了便於理解，以下將通過具體的附圖和實施例對本發明進行詳細地描述。需要特別指出的是，具體實例和附圖僅是為了說明，尤其是權利要求書和說明書中位於括號內的附圖標記僅僅是為了方便閱讀時的理解，並不構成對本發明範圍的限制。顯然本領域的普通技術人員可以根據本文說明，在本發明的範圍內對本發明做出各種各樣的修正和改變，這些修正和改變也納入本發明的範圍內。另外，本發明引用了公開文獻，這些文獻也是為了更清楚地描述本發明，它們的全文內容均納入本發明進行參考，就好像它們的全文已經在本發明說明書中重複敘述過一樣。
以下附圖中的凝膠照片中，c5X174DNA/HaeIII分子量標記每個條帶的上樣量均為泳道 1，2500 8;泳道2，1250 8 ；泳道 3，640pg ；泳道 4，320pg ；泳道 5，160pg ；泳道 6， 80pg ；泳道 7，40pg ；泳道 8，20pg ；泳道 9，IOpg ；泳道 10,5pg。圖1顯示了電泳後用不同還原性糖對染色效果影響圖，(A)本發明葡萄糖-銀染法，(B)木糖-銀染法，(C)核糖-銀染法。圖2顯示了本發明葡萄糖-銀染法與其他2種比較例的方法的染色照片，其中， (A)本發明葡萄糖-銀染法，(B)GE Healthcare的商品化的甲醛-銀染法，(C)SYBR^Gold
核酸凝膠染色。
具體實施例方式以下通過具體的實施例進行說明，其中未特別詳細說明的材料、步驟均為本領域技術人員所熟知的，如可參見《分子克隆實驗指南》(科學出版社，2002)等書籍或實驗手冊。
1、實驗材料丙烯醯胺、甲基雙丙烯醯胺(Bis)、四甲基乙二胺(TEMED)、過硫酸銨(APS)、 Tris、硼酸、葡萄糖、木糖、核糖、半乳糖、鼠李糖和乳糖購自Sigma-Aldrich Chemical Co. (St. Louis, MO,美國)。OX174DNA/HaeIII 分子量標記(Cat#G1761)購自 Promega Corporation (Madison, WI，美國)。DNA 銀染試劑盒(Cat#70-5006-88)購自GE Healthcare (Uppsala，瑞典)。STOR Gold核酸凝膠染色試劑盒購自Molecular
Probes (Eugene, 0R，美國)。其他化學試劑均為分析純，通過市售渠道購買。2、電泳和圖像分析根據常規的聚丙烯醯胺電泳法進行，簡要過程如下用TBE緩衝液(89mM TB, 2mM EDTA，pH 8.0)溶解丙烯醯胺並聚合成8%聚丙烯醯胺凝膠(80mmX IOOmmX0. 75mm)，其中， 丙烯醯胺與Bis的用量比為四1。OX174DNA/HaeIII分子量標記用Tris-EDTA(TE)緩衝液(IOmM EDTA, IOOmM Tris-Cl, pH 8.0)倍倍稀釋成各個濃度並上樣到凝膠的各個泳道上使得每個泳道的OX174DNA/HaeIII分子量標記的上樣量分別為2500，1250，620，310， 160，80，40，20，10 和 5pg。用 Miniprotean III dual slab cells(BioRad, Hercules, CA, 美國)和PAC 300 (BioRad)以20mA/凝膠的參數進行電泳，電泳液為上述TBE緩衝液。電泳直至溴酚藍到達凝膠底部邊緣，一般需要30分鐘。電泳完成後的凝膠分別用以下染色法進行染色並觀察顯色結果。用硝酸銀染色的凝膠利用掃描儀(Epson Perfection V700Photo，美國)以600dpi的解析度掃描成圖像； 用STOR Gold染色的凝膠在302nm波長的紫外燈照下用Molecular Imager Gel Doc XR
成像系統(BioRad)拍成照片(圖像)，曝光時間為2. 0到3. 0秒。3、本發明DNA硝酸銀染色法的實施例電泳後，使用多個凝膠進行以下實驗條件變化的一系列實驗凝膠在IOOmL去離子水中洗滌，洗滌時間分別為0分鐘(不洗滌)、10分鐘、30分鐘和洗滌過夜。然後，凝膠在 50mL含硝酸銀的溶液中分別浸滲5至60分鐘，其中硝酸銀的濃度分別為0. 05% -0. 4%. 然後取出凝膠，在IOOmL去離子水中洗滌兩次，每次20秒。然後取出凝膠，浸入50mL含葡萄糖、氫氧化鈉和硼酸的溶液顯色，其中葡萄糖的濃度分別為2% -10%，氫氧化鈉的濃度分別為150-300mM，硼酸的濃度分別為0-200mM。待顏色顯現並穩定後(需要8_10分鐘) 取出凝膠並浸入50mL1.5%乙二胺四乙酸鈉(EDTA-2Na)溶液終止顯色反應。這一系列實驗的結果比較如下(1)電泳後固定洗滌時間對染色的影響電泳中的物質，如Tris、EDTA、硼酸等，可能會干擾銀離子與DNA形成複合物，使得背景相對DNA條帶過濃。因此，不同的固定時間會對最終的顯色效果有著不同的影響。通過結果發現，凝膠在固定液中洗滌10分鐘，然後經過去離子水洗滌三次，每次5分鐘，已經足以能夠產生良好的顯色結果，長的洗滌時間不能顯著提升顯色效果，而不固定並進行水洗洗滌則使檢測的靈敏度大為降低。(2)浸滲溶液中組分含量及浸滲時間對染色的影響浸滲溶液中以0. 05% -0. 4%硝酸銀的濃度分別進行浸滲，綜合檢測靈敏度、圖像對比度以及背景的清晰程度，發現0.2%的硝酸銀濃度是最佳的。更高濃度的硝酸銀將導致背景更濃從而降低對比度，而更低濃度的硝酸銀將導致靈敏度降低。另外，浸滲時間分別為5至60分鐘，結果發現DNA條帶的顯色強度在浸滲5分鐘的情況下就能夠達到最大強度，再延長浸滲時間並沒有改變結果，而少於5分鐘則不足以達到最大的強度從而無法達到最大的靈敏度。(3)顯色溶液中各組分含量對染色的影響顯色溶液中分別以2% -10%葡萄糖濃度，150-300mM氫氧化鈉濃度和0_200mM硼酸濃度進行顯色，綜合考慮還原速度、背景深度和靈敏度，發現8 %葡萄糖濃度，250mM氫氧化鈉濃度和IOOmM硼酸濃度是最佳的，更低濃度的葡萄糖將造成顯色時間長，背景較髒；更高濃度的葡萄糖將造成背景顏色加深，對比度差。(4)顯色溶液中不同還原性糖對染色的影響顯色溶液中分別對木糖、半乳糖、核糖、鼠李糖、乳糖、葡萄糖進行顯色考察，結果顯示(表1)，半乳糖和乳糖的染色效果為低靈敏度，背景差；木糖和核糖的染色背景深，且靈敏度低；鼠李糖染色無現象；相比較而言，葡萄糖的染色結果較好，表現為背景清晰、靈敏度高(比木糖和核糖的靈敏度分別增加16-18倍)、在8-10分鐘內可得到滿意結果，作為最佳優選試劑。表1.不同還原性糖對染色的影響
權利要求
1.在聚丙烯醯胺凝膠上對DNA染色的方法，其為酸性銀離子溶液染色法，其特徵在於， 使用還原性糖，以葡萄糖為代表，代替甲醛作為銀離子還原劑。
2.權利要求1所述的方法，其依次包括固定步驟、第一次洗滌步驟、浸滲步驟、第二次洗滌步驟、顯色步驟和終止顯色反應步驟。
3.權利要求2所述的方法，其中第一次洗滌步驟是用水洗滌聚丙烯醯胺凝膠，優選洗滌時間大於等於3分鐘，更優選為5-30分鐘，最優選為5分鐘；洗滌次數為1-6次，更優選為2-4次，最優選為3次。
4.權利要求2所述的方法，其中浸滲步驟是用含硝酸銀溶液浸滲聚丙烯醯胺凝膠，優選浸滲時間為2-30分鐘，更優選為5-10分鐘，最優選為5分鐘。
5.權利要求2所述的方法，其中第二次洗滌步驟是用水洗滌聚丙烯醯胺凝膠。
6.權利要求2所述的方法，其中顯色步驟是用含還原性糖(以葡萄糖為代表)、氫氧化鈉和硼酸溶液浸滲聚丙烯醯胺凝膠，優選葡萄糖的濃度為2% -10%，更優選為6% -10%, 最優選為8%;優選氫氧化鈉的濃度為150-300mM，更優選為200-300mM，最優選為250mM ；硼酸的濃度為0-200mM，更優選為75-150mM，最優選為100mM。
7.權利要求2所述的方法，其中終止顯色反應步驟是用乙二胺四乙酸鈉溶液浸滲聚丙烯醯胺凝膠。
8.用於權利要求1-7之任一所述方法的試劑盒，其包括分裝的含硝酸銀溶液、氫氧化鈉溶液、硼酸溶液的顯色溶液和乙二胺四乙酸鈉溶液。
9.在聚丙烯醯胺凝膠上檢測DNA的方法，其包括在聚丙烯醯胺凝膠上進行電泳，然後進行權利要求1-7之任一所述方法。
10.用於權利要求9所述方法的試劑盒，其包括分裝的聚丙烯醯胺凝膠電泳試劑、含硝酸銀溶液、氫氧化鈉溶液、硼酸溶液的顯色溶液和乙二胺四乙酸鈉溶液。
全文摘要
本發明涉及在聚丙烯醯胺凝膠上對DNA染色的方法，其為安全環保型的酸性銀離子溶液染色法，依次包括固定步驟、第一次洗滌步驟、浸滲步驟、第二次洗滌步驟、顯色步驟和終止顯色反應步驟。另外，本發明還涉及在聚丙烯醯胺凝膠上檢測DNA的方法以及用於這些方法的試劑盒。
文檔編號C12Q1/68GK102586411SQ20111002075
公開日2012年7月18日 申請日期2011年1月18日 優先權日2011年1月18日
發明者叢維濤, 朱忠欣, 李校堃, 洪國贏, 金利泰 申請人:溫州安得森生物科技有限公司