一種用於評價運輸應激模型的基因晶片及其應用的製作方法
2023-05-27 19:09:06
專利名稱：一種用於評價運輸應激模型的基因晶片及其應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及生物檢測領域，具體地，涉及一種用於評價運輸應激模型的基因晶片及其應用。
背景技術：
運輸應激(transport stress)是指在運輸途中的禁食/限飼、環境變化(混群、密度、溫度、溼度)、顛簸、心理壓力等應激原的綜合作用下，動物機體產生本能的適應性和防禦性反映，是影響動物生產的重要因素之一。運輸應激條件下，動物往往表現為呼吸、心跳加速，恐懼不安、性情急躁，體內的營養、水分大量消耗，並最終影響動物的生產性能、免疫水平及畜廣品品質。運輸應激的機理為動物受到應激原的作用後，下丘腦興奮，分泌促腎上腺皮質釋放激素，通過垂體門脈系統進入垂體前葉，使垂體前葉分泌腎上腺皮質激素(ACTH)增多，ACTH通過血液循環到達腎上腺，促使糖皮質激素的釋放。應激初期分泌的腎上腺，也可刺激垂體前葉釋放ACTH，ACTH分泌的增多，阻礙某些營養物質的吸收，加強分解代謝，抑制炎症和免疫反應，致使機體抵抗力下降。應激原的強度大，作用持久時，腎上腺皮質分泌功能衰竭，可造成動物發病和死亡。目前對於運輸應激模型的評價並沒有一個確定的標準，大多時候用皮質醇、兒茶酚胺等激素水平的變化來衡量應激的發生，但導致激素變化的影響因素太多，且其自身的代謝速度快，不能穩定和確切的指示機體實際的應激狀態，所以我們引入基因晶片這一新技術。基因晶片技術作為基因診斷、相關基因確定、疾病分子機理分析、藥物篩選等重要工具，具有高通量、並行性及樣品消耗量少的優勢，在中藥研究尤其是新藥的設計篩選開發獨具魅力，能夠進行大規模篩選，在藥物與基因間架起一座橋梁，通過基因表達譜晶片實驗可以同時觀察成千上萬個基因在不同個體、不同組織、不同發育階段的表達狀況，從疾病及藥物兩個角度對生物體的多個參數同時進行研究，發掘藥物靶點並同時獲取作用機制的相關信息，改變了傳統的一次實驗僅對單個或幾個基因表達差異進行觀察，為多環節藥物作用機制的研究提供了有力工具。因此，我們希望通過基因表達譜分析找到能夠評價動物運輸應激模型的基因晶片。
發明內容
本發明的目的在於提供一種用於評價運輸應激模型的基因晶片。本發明另一目的是提供一種包括上述基因晶片的試劑盒。本發明又一目的是提供一種利用上述基因晶片或試劑盒評價運輸應激模型的方法。本發明提供的評價運輸應激模型的基因晶片，其主要針對以下基因產生的RNA、CRNA或⑶NA進行檢測
1、細胞死亡相關基因:Gdnf、Lifr、Ppp3rl、SphkK B4galtl、PhldaK 1124、Adm、Gsdmal、Acvr1、Naip2、Aqp2、Ptprc、Bcl211、Rela、Ctnnb1、Pdcd6ip、Tgfbr1、Hmoxl、Sort1、Tptl、Aldhlal、Actcl、Rhot2、Bax02、免疫相關基因RTl-CE5、RTl-CE16、Tlr9、RTl-CE3、Ptms、B4galtl、Gpx2、Ptprc、CtnnbK Apobλ S100a9、Itga6、TgfbrK Hmoxl03、氧化應激相關基因Scdl、Gpx2、Akrlc21、Hmoxl、Ndufc2、Noxl、Cox7c、Cyplal、Aldhlal、Fmo1、Cyp2jl0o4、應激應答相關基因Fgb、B4galtl、SphkU 1124、NrepΛ Adm、Fga、AcvrU A<qp2、Ptprc、Gpx2、Bcl211、Rela、Tnrc6a、Pdcd6ip、Ppp Ir 15b、Tgfbr1、Hmoxl、Gdnf、Casc3、Noxl、Cyplal、Aldhlal、Hspa8、Tfrc、Tlr9、Bax。一種優選的組合應當具有針對下述基因產生的RNA、cRNA或cDNA進行檢測的探針Gdnf、Lifr、Ppp3rl、Sphkl、B4galtl、Phldal、1124、Adm、Gsdmal、Acvrl、Naip2、Aqp2、Ptprc、Bcl211、Rela、Ctnnb1、Pdcd6ip、Tgfbr1、Hmoxl、Sort1、Tpt1、Aldhlal、Actc1、Rhot2、Bax、RTl-CE5、RTl-CE16、Tlr9、RTl-CE3、Ptms、Apob、S100a9、Itga6、Scdl、Gpx2、Akrlc21、Ndufc2、NoxK Cox7c、CyplaK FmoK Cyp2jl0、Fgb、NrepΛ Fga、Tnrc6a、Ppplrl5b、Casc3、Hspa8、Tfrc0利用上述基因晶片對目的基因進行檢測後，通過以下運輸應激綜合症評價標準進行檢驗1、細胞死亡相關基因上調 Ppp3rl、Sphkl、B4galtl、Phldal、1124、Adm、Gsdmal、Acvrl、Naip2、Aqp2、Ptprc、Bcl211、Rela、Ctnnb1、Pdcd6ip、Tgfbr1、Hmoxl、Sort1、Gdnf、Lifr ;下調 Tpt1、Aldhlal、Actcl、Rhot2、Bax0 T 檢驗 Ρ〈0· 01。2、免疫相關基因上調 Ptms、B4galtl、Gpx2、Ptprc、Ctnnbl、Apob、S100a9、Itga6、TgfbrUHmoxl ;下調 RT1-CE5、RT1-CE16、Tlr9、RT1-CE3。T 檢驗 Ρ〈0.01。3、氧化應激相關基因上調 Scdl、Gpx2、Akrlc21、Hmoxl ；下調 Ndufc2、NoxKCox7c、Cyplal、Aldhlal、Fmol、Cyp2jlO。T 檢驗 P〈0.01。4、應激應答相關基因上調 Fgbλ B4galtl、SphkU 1124、NrepΛ Adm、Fga、AcvrUAqp2、Ptprc、Gpx2、Bcl211、Rela、Tnrc6a、Pdcd6ip、PppIr 15b、Tgfbr1、Hmoxl、Gdnf、Casc3 ；下調 NoxK CyplaK AldhlaK Hspa8、Tfrc、Tlr9、Bax0 T 檢驗 Ρ〈0.01。本發明中所述的探針可以是上述相應基因的核酸序列、其互補序列，或者它們的片段，它們被固定在適於檢測反應的固相載體上，製成基因晶片。本發明中所述固相載體可選用本領域中眾所周知的載體，只要所述載體與所述反應物相容，不會影響檢測結果。優選的，本發明所述固相載體為玻璃片、硝酸纖維素膜或矽片等。本發明所述基因晶片可包含在一個試劑盒中，其中還可以包括用於評價反應的相應試劑、緩衝液以及說明書等。其包括對上述基因產生的RNA或表達產物測定的全部或部分試劑，典型地，測定RNA的試劑包括螢光定量PCR檢測試劑盒，原位雜交及其原位RT-PCR，Northern檢測試劑盒等，測定蛋白表達產物的試劑盒，包括ELISA試劑盒、抗體晶片等。在本發明的實施方案中，所述固相載體為玻璃片，玻璃片用多聚賴氨酸進行處理，向其上固定具有本發明所選的基因特徵性片段，利用機械手點印晶片，並將晶片重新水合化及快速乾燥、UV-交聯、封閉及變性，得到評價用基因晶片。同時以螢光素標記待測樣品，和晶片進行雜交。在本發明中，待測樣品核酸的抽提可採用異硫氰酸胍穩定法，用分光光度計對RNA定量。本發明所述評價用基因晶片採用了下述嚴格交反應條件。依據本發明所選擇的條件，可實現使大量雜交反應中的大多數反應物處於最佳狀況中，從而使儘可能多的配對物都不遺漏，即減少假陽性的可能，將錯配降到最低。(I)預雜交晶片1.取出晶片，平衡至室溫；I1.加入 IX 雜交 Buffer ；II1. 45°C, 60rpm,預雜交 lOmin。(2)雜交液的配製表I雜交液的配製
權利要求
1.一種用於評價運輸應激模型的基因晶片，其具有針對下述基因產生的RNA、cRNA或cDNA 進行檢測的探針中的一種或多種Gdnf、Lifr、Ppp3r1、Sphkl、B4galt1、Phldal、1124、A dm λ Gsdmal、Acvrl、Naip2、Aqp2、Ptprc、Bcl211、Re la、Ctnnb1、Pdcd6ip、Tgfbr1、Hmoxl、Sort1、Tptl、Aldhlal、Actcl、Rhot2、Bax。
2.根據權利要求1所述的基因晶片，其特徵在於，還包括針對下述基因產生的RNA、cRNA 或 cDNA 進行檢測的探針中的一種或多種RT1_CE5、RT1-CE16、Tlr9、RT1-CE3、Ptms、Apob、S100a9、Itga6、Scdl、Gpx2、Akrlc21、Ndufc2、Noxl、Cox7c、Cyplal、Fmo1、Cyp2jl0、Fgbλ Nrepλ Fga、Tnrc6a、Ppplrl5b、Casc3、Hspa8、Tfrc0
3.根據權利要求1或2所述的基因晶片，其特徵在於，所述探針為來自下述基因的核酸序列或其互補序列:Gdnf、Lifr、Ppp3rl、SphkK B4galtl、PhldaK 1124、Adm、GsdmaKAcvrl、Naip2、Aqp2、Ptprc、Bcl211、Re la、Ctnnb1、Pdcd6ip、Tgfbr1、Hmoxl、Sort1、Tpt1、AldhlaU ActcU Rhot2、Bax、RT1-CE5、RT1-CE16、Tlr9、RT1-CE3、Ptms、Apob、S 100a9、Itga6、Scdl、Gpx2、Akrlc21、Ndufc2、Noxl、Cox7c、Cyplal、Fmo1、Cyp2jlO、Fgb、Nrep、Fga、Tnrc6a、Ppplrl5b、Casc3、Hspa8、Tfrc0
4.一種用於評價運輸應激模型的試劑盒，其包括針對下述基因產生的RNA、cRNA、cDNA或其表達產物進行測定的試劑Gdnf、Lifr、Ppp3rl、SphkU B4galtl、PhldaU 1124、Adm、Gsdmal、Acvr1、Naip2、Aqp2、Ptprc、Bcl211、Rela、Ctnnb1、Pdcd6ip、Tgfbr1、Hmoxl、Sort1、Tptl、Aldhlal、Actcl、Rhot2、Bax0
5.根據權利要求4所述的試劑盒，其還包括針對下述基因產生的RNA、cRNA、cDNA或其表達產物進行測定的試劑RT1-CE5、RTl-CE16、Tlr9、RTl-CE3、Ptms、Apob、S100a9、Itga6、Scdl、Gpx2、Akrlc21、Ndufc2、Noxl、Cox7c、Cyplal、Fmol、Cyp2jl0、Fgb、Nrep、Fga、Tnrc6a、Ppp lrl5b、Casc3、Hspa8、Tfrc0
6.根據權利要求4或5所述試劑盒，其特徵在於，所述試劑盒為a)檢測RNA、cRNA、cDNA的試劑盒螢光定量PCR檢測試劑盒，原位雜交及原位RT-PCR，Nouthern檢測試劑盒中的一種或幾種； 或b)檢測表達產物的試劑盒ELISA試劑盒或抗體晶片試劑盒中的一種或幾種。
7.權利要求1-3任一項所述基因晶片、權利要求4-6任一項所述試劑盒在用於評價運輸應激模型中的應用。
8.一種用於評價運輸應激模型的方法，其特徵在於，利用權利要求1-3任一項所述基因晶片或權利要求4-6任一項所述試劑盒對所述運輸應激模型基因進行檢測，通過基因的差異性表達進行聚類分析，從而評價運輸應激模型。
全文摘要
本發明涉及一種用於評價運輸應激模型的基因晶片及其應用。所述基因晶片包括針對下述基因產生的RNA、cRNA或cDNA進行檢測的探針中的一種或多種Gdnf、Lifr、Ppp3r1、Sphk1、B4galt1、Phlda1、Il24、Adm、Gsdma1、Acvr1、Naip2、Aqp2、Ptprc、Bcl2l1、Rela、Ctnnb1、Pdcd6ip、Tgfbr1、Hmox1、Sort1、Tpt1、Aldh1a1、Actc1、Rhot2、Bax。本發明晶片通過一次實時、同步、高通量檢測神經－免疫－內分泌指標的變化多層次、多靶點全面評價畜禽在運輸應激後上述指標的典型變化，對於評價運輸過程中畜禽的機體狀況及生產性能具有指導意義。本發明晶片不僅將在新藥研究中體現節省樣品、節省時間，同時節省資金，具有重大實際意義。
文檔編號C40B40/06GK103031374SQ20121043919
公開日2013年4月10日 申請日期2012年11月6日 優先權日2012年11月6日
發明者許劍琴, 劉鳳華, 萬長榮, 尹朋, 麻武仁, 徐霄龍 申請人:中國農業大學