一種植物小分子核糖核蛋白RNA在害蟲防治中的應用的製作方法

2023-05-28 14:22:46 2

本發明涉及植物小分子核糖核蛋白RNA(srRNA-348-25)在害蟲防治中的應用，具體涉及植物來源srRNA-348-25影響昆蟲生長的這一功能，從而圍繞srRNA-348-25開展轉基因或抑制劑研發，達到害蟲防治的目的。

背景技術：

自從1993年發現小分子幹擾RNA以來，大量各類小分子RNA被發現，包括了miRNAs、siRNAs、piRNAs和snRNAs等。miRNA是一類長度約21～24核苷酸非編碼的小分子RNA，廣泛存在於動、植物體中。一系列實驗表明miRNA可能是一類在進化上保守的、在生物體中具有重要調控作用的分子。miRNA源自細胞核內編碼miRNA的基因轉錄成pri-microRNA，接著被Drosha酶剪切為長度約70bp呈髮夾狀的pre-miRNA，隨後被核質/細胞質轉運蛋白從細胞核內轉運到胞質中，之後被Dicer酶剪切成長為18-26bp的miRNA雙螺旋複合體。其中一條解螺旋，並與AGO蛋白結合，並形成非對稱的RISC複合物。這個複合物通過其中的miRNA與靶mRNA的3』UTR互補配對結合，從而降解靶目標mRNA或阻斷其翻譯，實現對靶標基因的負調控。已有大量文獻報導，miRNA在基因表達、信號轉導、植物發育、抵抗脅迫、預防疾病等方面起著至關重要的作用。近年來一類來源於核糖核蛋白DNA的小分子RNA(srRNAs)被發現具有類似miRNA的功能。例如從人類和老鼠的小分子RNA高通量測序結果分析，發現大量的srRNAs是可以和核糖核蛋白DNA配對的，同時免疫共沉澱實驗表明這些srRNA可以和AGO結合；實驗還表明一些srRNA可能參與了調控糖尿病的相關代謝途徑(Haibin Wei,Ben Zhou,Fang Zhang,Yanyang Tu,Yanan Hu,Baoguo Zhang,Qiwei Zhai.Profiling and Identification of Small rDNA-Derived RNAs and Their Potential Biological Functions.PLOS ONE.2013.8(2):e56842)。但是srRNA的研究報導極少，更沒有在昆蟲與植物關係方面的研究報導。

技術實現要素：

本發明在對害蟲斜紋夜蛾進食芥菜的差異小分子RNA進行測序分析時，發現了表達量顯著下調的srRNA-348-25：5』-GUCGGGAGGGAAGCGGAUGGGGGCC-3』(SEQ ID NO:1)並鑑定為植物中普遍存在的保守序列。注射srRNA-348-25片段進入蟲體，進食植物葉片的斜紋夜蛾死亡率顯著增加。由於srRNA-348-25為植物小分子核糖核蛋白RNA，較多的存在於富含蛋白的植物中，如大豆，特別在加熱的大豆中，因此，該片段對人是安全的。可用作為安全有效的防治植食性害蟲的新型殺蟲劑，可直接使用及轉基因植物。

本發明的目的在於提供植物srRNA-348-25在製備殺蟲劑中的應用。

本發明所採取的技術方案是：

一種植物小分子核糖核蛋白RNA在製備殺蟲劑中的應用，所述小分子核糖核蛋白RNA為srRNA-348-25，其鹼基序列如SEQ ID NO：1所示。

進一步的，所述殺蟲劑能夠殺滅植食性蟲體，或抑制植食性蟲體的生長。

進一步的，所述植食性蟲體為鱗翅目植食性昆蟲、同翅目植食性昆蟲。

進一步的，所述鱗翅目和同翅目昆蟲為斜紋夜蛾、蠶、稻飛蝨。

一種殺蟲劑，該殺蟲劑中含有srRNA-348-25，其鹼基序列如SEQ ID NO：1所示。

一種植物蟲害防治的方法，其特徵在於：使植物體過表達小分子核糖核蛋白RNA srRNA-348-25，srRNA-348-25鹼基序列如SEQ ID NO：1所示。

本發明的有益效果是：

本發明發現一種植物小分子核糖核蛋白RNA(srRNA-348-25)對植食性害蟲生長具有抑制作用，甚至能夠促進植食性害蟲的死亡，由於srRNA-348-25是人類食用植物中的成分，對人類安全，可用作安全有效的防治植食性害蟲的新型殺蟲劑，可直接使用及轉基因植物；因此srRNA-348-25轉基因植物(即植物體過表達srRNA-348-25)進行害蟲防治將有著實際的應用價值。

附圖說明

圖1為注射srRNA-348-25後斜紋夜蛾幼蟲進食芥菜後的死亡情況；圖中NC mimic即為NC(無義片斷)對照組，sr-348-25為srRNA-348-25的簡稱；

圖2為注射srRNA-348-25 72h後斜紋夜蛾幼蟲的生長情況；圖中sr-348-25為srRNA-348-25的簡稱；

圖3為srRNA-348-25在不同植物中的表達水平；圖中食物為斜紋夜蛾蟲體人工培養基，經加熱而成；圖中豆粉、麥麩為未加熱的材料；芥菜為其葉片；

圖4不同原料中srRNA-348-25的相對含量檢測；

圖5為斜紋夜蛾進食芥菜(B.juncea)和培養基(CK)後中腸srRNA-348-25含量的檢測；

圖6為注射srRNA-348-25進入斜紋夜蛾幼蟲後解毒酶SlGSTe1表達下調，圖中NC為注射無義序列的對照組；

圖7為分別餵食含srRNA-348-25的培養基和芥菜的斜紋夜蛾生長的比較；

圖8為多種植物基因組中srRNA-348-25序列的比較分析；

圖9為分別注射2μg srRNA-348-25和無義序列(NC)的家蠶表型；

圖10為srRNA-348-25增加稻飛蝨的死亡率。

具體實施方式

下面結合具體實施例對本發明作進一步的說明，但並不局限於此。

本發明的研究過程如下所述：

為了研究雜食性農業害蟲斜紋夜蛾適應植物的機制，我們分別對進食含大豆和麥麩的人工培養基以及芥菜葉片的斜紋夜蛾中腸，進行了高通量小分子RNA測序與分析，發現了斜紋夜蛾中腸差異表達最大的小分子RNA，進一步研究發現該小分子RNA不與斜紋夜蛾基因組序列配對，而是存在植物基因組中，是26S rRNA的一段序列，屬於小分子核糖核蛋白RNA，命名為srRNA-348-25。

srRNA-348-25在蛋白含量高的培養基中含量高，而在芥菜葉中含量很低；並且它在加熱培養基中的含量高於不加熱培養基，說明了它可能是蛋白複合體的降解產物。因此在進食芥菜後的斜紋夜蛾中腸中srRNA-348-25含量極低，但如果增加它在斜紋夜蛾體內的含量，斜紋夜蛾進食芥菜葉會導致死亡。

分析斜紋夜蛾進食培養基和芥菜後的中腸中的基因表達譜，發現斜紋夜蛾以蛋白水解酶應對大豆的高蛋白、以解毒酶應對毒性的植物次生物質。分析srRNA-348-25的靶基因，發現它可能抑制解毒酶基因，而不作用蛋白水解酶。因此，斜紋夜蛾進食高含量srRNA-348-25的培養基並不死亡，但體內含高劑量srRNA-348-25的斜紋夜蛾進食芥菜後死亡率大增。所以可利用srRNA-348-25防治斜紋夜蛾。

由於srRNA-348-25在植物葉中含量極低，那麼srRNA-348-25是否也可以用於防治進食其他植食性昆蟲？我們分別注射srRNA-348-25進入鱗翅目的家蠶和同翅目的稻飛蝨，它們進食植物後死亡率增加。由於srRNA-348-25是人類食用植物中的成分，對人類安全，因此srRNA-348-25轉基因植物進行害蟲防治將有著實際的應用價值。

實施例1srRNA-348-25抑制斜紋夜蛾進食芥菜後的生長和存活

實驗方法：

選取大小一致、健康狀況一致的五齡第一天斜紋夜蛾幼蟲，稱量每頭蟲子的重量，隨機分為srRNA-348-25處理組和NC對照組(無義片段)，每組40頭，重複實驗3次。順血液循環流動方向，用微量注射器從斜紋夜蛾幼蟲的側腹部第一和第二腹足之間，分別注射srRNA-348-25和NC(無義片段)，注射量為每頭蟲4μg，注射後餵食芥菜。注射後第1、2、3天觀察蟲子的形態變化並拍照取證，每天統計蟲子的死亡率。

上述srRNA-348-25序列為：5』-GUCGGGAGGGAAGCGGAUGGGGGCC-3』(SEQ ID NO：1)。

實驗結果：

實驗檢測結果如圖1和圖2所示，圖1為注射srRNA-348-25後斜紋夜蛾幼蟲進食芥菜後的死亡情況；從中可以看出注射srRNA-348-25的斜紋夜蛾幼蟲在進食芥菜24h、48h和72h後的死亡率分別達77.50％、92.45％和92.45％，遠遠高於對照組(NC)的6.91％、8.69％和8.69％。圖2為注射srRNA-348-25或無義片段(NC)的斜紋夜蛾幼蟲在進食芥菜72h後的生長情況，從中可以看出在srRNA-348-25處理組中存活的幼蟲瘦小，而NC對照組的幼蟲明顯肥大許多。

上述結果說明srRNA-348-25抑制斜紋夜蛾進食芥菜後的生長和存活。

實施例2srRNA-348-25的來源及其對斜紋夜蛾蟲體的影響

為了研究小分子RNA調控雜食性農業害蟲斜紋夜蛾適應植物的機制，分別對進食含大豆和麥麩的人工培養基以及芥菜葉片的斜紋夜蛾中腸，進行了高通量小分子RNA測序與分析，發現了斜紋夜蛾中腸差異表達最大的一個小分子RNA，進一步研究發現該小分子RNA不與斜紋夜蛾基因組序列配對，而是存在植物基因組中，是26S rRNA的一段序列，屬於小分子核糖核蛋白RNA，命名為srRNA-348-25。

一、srRNA-348-25在不同植物中的表達情況

實驗方法：

分別將斜紋夜蛾蟲體人工培養基(每升培養基中含黃豆粉100g、麥麩80g、酵母粉26g、乾酪素8g、維生素C 8g、氯化膽鹼1g、山梨酸2g、膽固醇0.2g、肌醇0.2g和瓊脂粉26g)、豆粉、麥麩、芥菜葉片按Trizol法抽提總RNA，測定濃度後取2μg總RNA進行反轉錄(參考TAKARA的One Step PrimeScript miRNA cDNA Synthesis Kit說明書進行)，得到的cDNA產物稀釋後用於qRT-PCR的模板，進一步qRT-PCR檢測srRNA-348-25在各個樣本中的表達水平。結果分析採用相對定量的方法來確定目標基因相對內標基因(GAPDH，HQ012003)的相對表達倍數。應用SPSS16.0統計分析軟體，採用ANOVA(多個處理間的兩兩比較)或獨立樣本T檢驗(兩個樣品間比較)來進行處理間的差異比較分析。

實驗結果：

檢測結果如圖3所示，從中可以看出，人工培養基(食物)中的srRNA-348-25含量最高，豆粉中的srRNA-348-25含量也明顯高於麥麩，表明培養基中的高含量srRNA-348-25可能主要是由豆粉所致；然而芥菜葉片中的srRNA-348-25含量非常低。

實驗方法：

為了進一步明確豆粉加熱後srRNA-348-25含量可能會增加，分別取0.1g豆粉、0.1g麥麩、0.1g按1:1混合的豆粉和麥麩的混合物(其中分別設置了未加熱的及按培養基加熱方式處理後的豆粉和麥麩混合物、0.1g水稻葉片、0.1g花生葉片、0.1g酵母，進行與上述完全相同的RNA提取、反轉錄和PCR等操作，分別各取1μg RNA進行反轉錄和相同體積的PCR。

實驗結果：

檢測結果如圖4所示，從中可以看出，豆粉中的srRNA-348-25的表達量遠高於在麥麩、花生和水稻葉片中的；加熱後的豆粉和麥麩混合物中srRNA-348-25表達量相對未加熱的明顯增加，表明豆粉中的蛋白加熱後，較多核糖核蛋白體RNA生成小分子RNA。

上述結果提示srRNA-348-25在植物葉片中含量很低；在蛋白含量高的培養基中的含量高，並且在加熱後的培養基中的含量高於不加熱培養基，進一步說明srRNA-348-25可能是蛋白複合體的降解產物。

二、斜紋夜蛾進食芥菜後srRNA-348-25的相對含量檢測

將五齡第二天的斜紋夜蛾分為2組，每組分別餵食芥菜葉片(B.juncea)和人工培養基(CK)，分別於餵食後12h和48h，檢測斜紋夜蛾中腸中srRNA-348-25的含量情況。

檢測結果如圖5所示，從中可以看出，無論是進食後12h或48h，斜紋夜蛾進食芥菜後其體內的srRNA-348-25的含量較進食培養基的少。由於培養基中srRNA-348-25含量遠高於芥菜葉中的含量(圖3)，因此本結果表明斜紋夜蛾進食後中腸中srRNA-348-25的含量與其在食物中srRNA-348-25的含量成正比。由於昆蟲在長期的進化中對不同的食物形成了不同的適應機制，斜紋夜蛾分別進食含有不同含量srRNA-348-25的培養基和或芥菜片時均不會死亡。然而我們的研究發現，當增加斜紋夜蛾體內srRNA-348-25含量(體外注射srRNA-348-25)後再進食芥菜時，斜紋夜蛾生長受抑制且死亡率增加(見圖1和圖2)。

實施例3srRNA-348-25抑制進食芥菜後斜紋夜蛾生長且促進其死亡的機制

一、srRNA-348-25的作用靶標

為了進一步研究srRNA-348-25抑制斜紋夜蛾生長且促進其死亡的可能機制，我們將斜紋夜蛾進食培養基後再轉進食芥菜，然後分別在轉進食芥菜後的0、6、48h採集樣品進行高通量測序，分析差異表達基因，如表1和表2所示。

結果發現轉進食芥菜後，斜紋夜蛾中腸的許多蛋白水解酶表達下調(表1)，而許多應對芥菜次生物質的解毒酶的表達量上調(表2)。進而將srRNA-348-25與表1和表2中具有表達差異的靶基因序列進行配對分析，檢測srRNA-348-25可能作用的靶標，結果發現srRNA-348-25與檢測到的具有表達差異的蛋白水解酶基因不具有結合有可能性(完全不配對)；但與表2中檢測到的一些解毒酶等基因具體有結合的可能性；進一步的研究發現，srRNA-348-25可能與解毒酶基因Slgste1(這是一個保障斜紋夜蛾應對芥菜次生物質的重要基因，它在斜紋夜蛾進食培養基時幾乎不表達，可參見Xiaopeng Zou,Zhibin Xu,Haiwang Zou,Jisheng Liu,Qili Feng,Sichun Zheng.Glutathione S-transferase SlGSTE1in Spodoptera litura may be involved in feeding preference of host plants.Insect Biochemistry and Molecular Biology,2016，70:32-43)的3』非編碼區具有結合作用。

表1.斜紋夜蛾從進食培養基轉進食芥菜後表達差異顯著的蛋白水解酶基因數統計

表2.斜紋夜蛾從進食培養基轉進食芥菜後表達差異顯著的解毒酶基因數統計

為了進一步研究srRNA-348-25是否作用於解毒酶基因Slgste1，我們將srRNA-348-25注射進入五齡的斜紋夜蛾幼蟲，檢測Slgste1基因的在轉錄水平的表達情況；檢測結果如圖6所示，從中可以看出，注射srRNA-348-25後，斜紋夜蛾幼蟲體內Slgste1基因的轉錄表達水平明顯降低，說明srRNA-348-25抑制Slgste1基因表達。

二、表型分析

實驗方法：

一共設置5組實驗，各組處理情況如下：

對照組(單純水)：給斜紋夜蛾單純餵食水，如圖7A；

實驗組(單純水srRNA)：給斜紋夜蛾單純餵食srRNA-348-25，與水比較，證明srRNA-348-25是否無毒性，如圖7A；

對照組(培養基)：使斜紋夜蛾進食人工培養基，如圖7B；

實驗組(2μg srRNA+培養基)：使斜紋夜蛾進食含2μg srRNA-348-25的人工培養基，如圖7B和圖7C；

實驗組(2μg srRNA+芥菜)：使斜紋夜蛾進食含2μg srRNA-348-25的芥菜，如圖7C；

按照上述處理，分別觀察各組斜紋夜蛾幼蟲的生長和死亡情況。

觀察結果如圖7所示，從圖7A中可以看出，單純的2μg srRNA-348-25不影響斜紋夜蛾的生長發育，說明srRNA-348-25可能不作用任何與生長相關的基因；從圖7B中可以看出，進食含2μg srRNA-348-25的培養基的斜紋夜蛾與進食單純培養基的斜紋夜蛾相比，生長並沒有受到抑制，表明srRNA-348-25也不調控與培養基成分相關的基因如蛋白水解酶的表達；從圖7C中可以看出，進食含2μg srRNA-348-25的培養基和芥菜的斜紋夜蛾，後者的生長明顯小於前者，說明當蟲體富集2μg srRNA-348-25時再食用芥菜會抑制斜紋夜蛾的生長，促進蟲體的死亡，其中的作用機制很可能是由於srRNA-348-25抑制了Slgste1等解毒酶基因(蟲體分解有毒的植物次生物質所必需的酶)的表達，使芥菜的毒性增加，最終導致蟲體的進食與生長受阻，從而促進蟲體的死亡。

實施例4不同植物基因組中srRNA-348-25序列的比較分析

由於srRNA-348-25序列無法在斜紋夜蛾基因組中找到配對的序列，因此我們分別選取了幾個植物基因組進行了比較分析，包括了大豆(基因庫序列號：dbj|LB172039.1)、上羊草(基因庫序列號：gb|AOCO010307372.1)；擬南芥(基因組編號：TAIRIO)。比對結果如圖8所示，srRNA-348-25在植物中非常保守，是26s rRNA的一段序列，這解釋了為什麼它在高蛋白的大豆中含量較高，而在各類植物的葉片中含量皆低。因此，理論上轉基因srRNA-348-25，增加各類植物的葉片它的含量，都有可能會到導致進食該類植物的害蟲產生不良的反應。

實施例5srRNA-348-25抑制家蠶的生長

由於srRNA-348-25在植物葉中含量極低，那麼srRNA-348-25是否也可以用於防治進食其他植食性昆蟲？本實施例對鱗翅目的家蠶進行了相應的研究。

分別取5齡3天的家蠶，注射2μg srRNA-348-25和無義對照序列，注射完後是否還要對家蠶進食桑葉，觀察家蠶的生長情況。

觀察結果如圖9所示，從中可以看出，注射srRNA-348-25後72天，家蠶的生長情況明顯受到抑制，生長抑制率為100％。

實施例6srRNA-348-25促進稻飛蝨的死亡

由於srRNA-348-25在植物葉中含量極低，那麼srRNA-348-25是否也可以用於防治進食其他植食性昆蟲？本實施例對水稻的主要害蟲同翅目的稻飛蝨分別注射0.2μg srRNA-348-25和無義序列(對照組)，注射體積為0.2μl，注射完後是否還要對稻飛蝨進食水稻葉(即注射完後將稻飛蝨放到水稻中)，觀察稻飛蝨的生長情況。

觀察結果如圖10所示，從中可以看出，注射srRNA-348-25後2天，srRNA-348-25的死亡率為86％，而對照組的死亡率僅為33％。

上述結果說明增加稻飛蝨體內srRNA-348-25的含量，也會促使稻飛蝨進食水稻葉後的死亡率，進一步證明srRNA-348-25能夠促進植食性的昆蟲的死亡率。

上述實施例為本發明較佳的實施方式，但本發明的實施方式並不受上述實施例的限制，其他的任何未背離本發明的精神實質與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡化，均應為等效的置換方式，都包含在本發明的保護範圍之內。

SEQUENCE LISTING

華南師範大學

一種植物小分子核糖核蛋白RNA在害蟲防治中的應用

1

PatentIn version 3.5

1

25

RNA

人工序列

1

gucgggaggg aagcggaugg gggcc 25