由木質素衍生的化合物生物生產芳香族化學品的製作方法

2023-05-28 02:25:26 3

由木質素衍生的化合物生物生產芳香族化學品的製作方法
【專利摘要】本文所提供的教導總體而言涉及使用酶的生物轉換工藝將木質素衍生的化合物轉換為有價值的芳香族化學品的方法。本文所述的教導提供了以下選擇：(i)對在木質素級份中存在的毒性化合物耐受的宿主細胞；(ii)可以在將木質素級份生物轉換為芳香族化學品產物中作為酶使用的多肽；(iii)可以用於轉化宿主細胞從而在木質素級份的生物轉換中表達作為酶的所選多肽的多核苷酸；以及(iv)表達酶的轉化子。
【專利說明】由木質素衍生的化合物生物生產芳香族化學品
[0001]R.查特吉
[0002]K.贊
[0003]K.米歇爾
[0004]G.劉
相關申請的交叉引用
本申請要求9/15/2010提交的美國臨時申請N0.61/403, 440和10/25/2010提交的美國臨時申請61/455，709的優先權，這些申請在此均以引用方式全文併入本文。
序列表
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【背景技術】【技術領域】
[0005]本文提供的教導總體而言涉及使用酶，通過生物轉變工藝將木質素衍生的化合物轉變為有價值的芳香族化學品的方法。
_6] 相關領域的描述`
[0007]當前，全世界整體性地依賴石油作為用於製造燃料和化學品的可能耗盡的原料。使用石油的問題是如此公知的，並記錄為它們對於世界人口而言幾乎已經成為陳詞濫調。簡言之，基於石油的工藝是髒且危險的。與石油應用相關的環境影響是已知的，例如包括空氣汙染、全球變暖、提取產生的損傷、油洩露、油球以及對人、家畜和野生生物的健康危害。
[0008]例如，油的精煉是主要生產汽油的基於石油的工藝。然而，它們還廣泛地用於生產在藥物、農用化學品、食品原料和塑料的製造中有價值的且鮮有人知的化學產物。該市場範圍的清潔綠色備選物受到全球範圍的重視。
[0009]生物加工可以將清潔綠色的備選物提供給基於石油的工藝，所述的生物加工為使用有機體、細胞、細胞器或酶來進行商業化工藝的加工方法。例如，生物精煉可以生產例如化學品，熱和動力，以及食品、飼料、燃料和工業化學產物。生物精煉的實例可以包括溼磨和幹磨玉米粉、製漿和造紙廠以及生物燃料工廠。在製革過程中，使用蛋白酶軟化毛皮並除去頭髮。在釀造中，在發芽大麥中使用澱粉酶。在乾酪製造中，使用凝乳酶來凝結蛋白質(以密爾計)。例如，近來，生物燃料工廠成為焦點，其自然而然地集中與燃料產物來替代基於石油的燃料，結果不再研發同樣依賴於基於石油工藝的其他有價值的化學產物。
[0010]由此，生物精煉使用酶來將天然產物轉換為有用的化學品。天然產物(例如在製漿和造紙廠中使用的木材)包含纖維素、半纖維素和木質素、硬木的典型組成範圍可以為大約40-44%纖維素、大約15-35%半纖維素、以及大約18-25%木質素。同樣，軟木的典型組成範圍可以為大約40-44%纖維素、大約20-32%半纖維素、以及大約25-35%木質素。由於所有的生物燃料均得自纖維素質的生物精煉，其中重要的原材料為葡萄糖，其衍生自纖維素，所以木質素保持未充分利用。在自然界中，木質素為芳香族化合物的單一的最豐富的來源，並且木質素的用途目前局限於低價值的應用，例如燃燒生成用於生物精煉設備的過程熱和能量。備選地，木質素作為動物飼料或肥料的天然成分被出售。然而，有趣的是木質素為基於芳香族核心結構的唯一的植物生物質成分，並且所述的核心結構在工業化學品的生產中是有價值的。技術人員理解的是:不幸地，此類木質素應用的主要問題仍保留:存在於生物精煉的木質素級份中的芳香族化合物包括抑制工業微生物生長和存活的毒性化合物。至少鑑於這些原因，使用工業微生物將木質素級份轉換為工業產物的工藝仍未成功。
[0011]基於上文所述，技術人員理解的是:(i)在生產有價值的化學產物(包括主要的市場，例如藥物、農用化學品、食品原料和塑料)中，清潔綠色替代基於石油的工藝；(ii)有益地利用在木質素中得到的大量且可再生的天然來源，其目前為工業廢物流，其作為工業原料是未經充分利用的；(iii)選擇對原料的木質素級份中存在的毒性化合物耐受的宿主細胞；(iv)選擇可以在木質素級份生物轉換為有價值的化學產物的過程中用作酶的多肽；
(v)選擇可以用於轉化宿主細胞從而在木質素級份轉換為有價值的化學產物的過程中表達所選擇的多肽的宿主細胞；(Vi)包含表達酶的轉化子的系統，其中所述的轉化子可以用於(a)表達酶，同時與木質素級份直接接觸；或者(b)表達由細胞進行提取的酶，其後將提取的酶與木質素級份直接接觸；以及(vii)在高於基於石油工藝的收益下生產有價值的化學產物的清潔綠色方法。
[0012]發明概述
[0013]本發明總體而言涉及生產用於將木質素衍生的化合物生物轉變為有價值的芳香族化學品的酶的重組方法。在一些實施方案中，所述的教導涉及分離的重組多肽，其包含與SEQ ID NO:101具有至少95%的一致性的胺基酸序列。該序列可以保留殘基T19，120，S21，P22, V24, W25, T27, K28, Y29, A30, H33, K34, G35, F36, D39, 140，V41, P42, G43, G44, F45,G47, 148，E50, R51, T52, G53, G54, K100, A101, N104, VIII，G112, M115, F116, P166, W107,Y184, Y187, R188, G191, G192 和 F195。
[0014]在一些實施方案中，所述的教導涉及分離的重組多肽，其包含SEQ ID NO:101;或者該序列的保守殘基以外的保守性取代。保守的殘基可以包括T19，120，S21，P22，V24，W25, T27, K28, Y29, A30, H33, K34, G35, F36, D39, 140，V41, P42, G43, G44, F45, G47, 148，E50，R51，T52，G53，G54 ；K100,A101,N104,Vlll,G112,M115,F116,P166, W107,Υ184,Υ187,R188, G191, G192 和 F195。
[0015]在一些實施方案中，所述的教導涉及分離的重組穀胱甘肽S轉移酶，其包含與SEQID NO:101具有至少95%的一致性的胺基酸序列。該序列可以保留殘基Τ19，120，S21，P22，V24, W25, T27, K28, Y29, A30, H33, K34, G35, F36, D39, 140，V41, P42, G43, G44, F45, G47,148，E50, R51, T52, G53, G54 ；K100, Α101, N104, Vlll, G112, M115, F116, P166, W107, Y184,Y187，R188，G191，G192和F195 ;其中所述的胺基酸序列起到切割β -芳基醚的作用。
[0016]在一些實施方案中，所述的教導涉及分離的重組穀胱甘肽S轉移酶，其包含與SEQID NO:101具有至少95%的一致性的胺基酸序列；其中所述的胺基酸序列起到切割β -芳基醚的作用。
[0017]在一些實施方案中，所述的教導涉及分離的重組多肽，其包含:(i)長度範圍為大約279至281的胺基酸；(ii)由以下部分構成的第一胺基酸區域:得自SEQ ID NO:101的殘基 19-54，或其除保守殘基 T19，120，S21, P22, V24, W25, T27, K28, Y29, A30, H33, K34,G35, F36, D39, 140，V41, P42, G43, G44, F45, G47, 148，E50, R51, T52, G53 和 G54 以外的保守性取代；其中所述的第一胺基酸區域可以定位於大約殘基14至大約殘基59的重組多肽中；以及(iii)由以下部分構成的第二胺基酸區域:得自SEQ ID NO=IOl的殘基98-221，或其除保守殘基 K100, A101, N104, VIII，G112, M115, F116, P166, W107, Y184, Y187, R188,G191，G192和F195以外的保守性取代；其中所述的第二胺基酸區域定位於大約殘基93至大約殘基226的重組多肽中。
[0018]在一些實施方案中，所述的教導涉及分離的重組穀胱甘肽S轉移酶，其包含:(i)長度範圍為大約279至281個胺基酸；(ii)第一胺基酸區域，其具有與得自SEQ ID NO:101殘基19-54具有至少95%的一致性，同時保留了殘基1'19，120，521，？22，￥24，[5，了27，1(28，Y29, A30, H33, K34, G35, F36, D39, 140，V41, P42, G43, G44, F45, G47, 148，E50, R51, T52,G53和G54 ;其中所述的第一胺基酸區域定位於大約殘基14至大約殘基59的重組多肽中；以及(iii)第二胺基酸區域，其具有與得自SEQ ID NO:101殘基98-221具有至少95%的一致性，同時保留了殘基 K100，A101, N104, VIII，G112, M115, F116, P166, W107, Y184, Y187,R188，G191，G192和F195 ;其中所述的第二胺基酸區域可以定位於大約殘基93至大約殘基226的重組多肽中；並且所述的重組穀胱甘肽S轉移酶可以起到切割β -芳基醚的作用。
[0019]在一些實施方案中，所述的教導涉及分離的重組穀胱甘肽S轉移酶，其包含與SEQID NO:541具有至少95%的一致性的胺基酸序列；其中所述的胺基酸序列起到切割β-芳基醚的作用。
[0020]在一些實施方案中，所述的教導涉及分離的重組多肽，其包含:(i)長度範圍為大約256至260個胺基酸；(ii)由以下部分`構成的第一胺基酸區域:得自SEQ ID NO:541的殘基47-57，或其除保守殘基A47，148，N49, P50, G52，V54，P55，V56，L57以外的保守性取代；其中所述的第一胺基酸區域定位於大約殘基45至大約殘基57的重組多肽中；以及(iii)由以下部分構成的第二胺基酸區域:得自SEQ IDNO:541的的殘基99-230，或其除保守殘基 R100, ΥΙΟΙ, K104, D107, Mill, N112, S115, M116, K176, L194, 1197，N198, S201, H202 和M206以外的保守性取代；其中所述的第二胺基酸區域定位於大約殘基94至大約殘基235的重組多肽中。
[0021]在一些實施方案中，所述的教導涉及分離的重組穀胱甘肽S轉移酶，其包含:(i)長度範圍為大約279至281的胺基酸；(ii)第一胺基酸區域，其具有與得自SEQ ID NO:541殘基47-57具有至少95 %的一致性，或其除保守殘基A47，148，N49，P50，G52，V54，P55，V56，L57以外的保守性取代；其中所述的第一胺基酸區域可以定位於大約殘基45至大約殘基57的重組多肽中；(iii)第二胺基酸區域，其由SEQ ID NO:541的63-76構成；以及(iv)第三胺基酸區域，其具有與得自SEQ ID NO:541殘基99-230具有至少95%的一致性，或其除保守殘基 R100, Y101，K104，D107, Mill，N112，S115, M116, K176, L194, 1197，N198, S201，H202和M206以外的保守性取代；其中所述的第二胺基酸區域可以定位於大約殘基94至大約殘基235的重組多肽中；其中所述的重組穀胱甘肽S轉移酶起到切割β -芳基醚的作用。
[0022]在一些實施方案中，除保守殘基以外的胺基酸取代可以為保守性取代。並且，在一些實施方案中，所述的胺基酸序列可以起到切割芳基醚的作用。
[0023]此外，所述的教導涉及切割β_芳基醚鍵的方法，其包括:將本文所教導的多肽與木質素衍生的化合物相接觸，其中所述的木質素衍生的化合物具有(i) β_芳基醚鍵；並且(ii)分子量範圍為大約180道爾頓至大約3000道爾頓；其中所述的接觸是在其中木質素衍生的化合物是可溶的溶劑環境中進行。
[0024]在一些實施方案中，所述的木質素衍生的化合物具有大約180道爾頓至大約1000道爾頓的分子量。在一些實施方案中，所述的溶劑環境包含水。並且在一些實施方案中，所述的溶劑環境包含極性有機溶劑。
[0025]此外，所述的教導還涉及用於生物加工木質素衍生的化合物的系統，該系統包含本文所教導的多肽；木質素衍生的化合物，其具有β_芳基醚鍵並且分子量範圍為大約180道爾頓至大約3000道爾頓；以及所述的木質素衍生的化合物可溶於其中的溶劑；其中所述的系統通過將所述的多肽與所述的木質素衍生的化合物在溶劑中相接觸來切割β-芳基醚鍵。
[0026]此外，所述的教導還涉及重組多核苷酸，其包含編碼本文所述的多肽的核苷酸序列。類似地，所述的教導還涉及包含所述的多核苷酸的載體或質粒、以及由能夠表達所述的多肽的載體或質粒轉化的宿主細胞。
[0027]此外，所述的教導還涉及切割β_芳基醚鍵的方法，該方法包括:(i)在適於生產本文所教導的多肽的條件下培養本文所教導的宿主細胞；(ii)由宿主細胞培養物回收所述的多肽；以及(iii)將權利要求1所述的多肽與木質素衍生的化合物相接觸，其中所述的木質素衍生的化合物具有β -芳基醚鍵，並且分子量範圍為大約180道爾頓至大約3000道爾頓；其中所述的接觸是在其中木質素衍生的化合物是可溶的溶劑環境中進行。
[0028]在一些實施方案中，所述的宿主細胞可以為大腸桿菌或固氮菌屬菌株，例如棕色固氮菌(Azotobacter vinelandii)。並且在一些實施方案中，所述的木質素衍生的化合物可以具有大約280道爾頓至大約1000道爾頓的分子量。
[0029]此外，所述的教導還涉及用於生物加工木質素衍生的化合物的系統，該系統包括:
(i)本文所教導的轉化的宿主細胞；(ii)木質素衍生的化合物，其具有β_芳基醚鍵，並且分子量範圍為大約180道爾頓至大約3000道爾頓；以及(iii)其中木質素衍生的化合物是可溶的溶劑；其中所述的系統通過將本文所教導的多肽與所述的木質素衍生的化合物在溶劑中相接觸來切割芳基醚鍵。
[0030]附圖簡述
[0031]圖1A和IB示出了根據一些實施方案、本文所討論的生物精煉工藝和發現工藝的總體概念。
[0032]圖2示出了根據一些實施方案、可以使用生物轉變而生產的一些構造塊化學品的結構。
[0033]圖3為根據一些實施 方案、醚酶催化來水解模式木質素二聚體α-0_(β-甲基傘形酮基)乙醯香蘭酮(MUAV)的實例。
[0034]圖4示出了根據一些實施方案、針對少動鞘氨醇單胞菌(S.paucimobilis)陽性對照多肽和新鞘氨醇桿菌(N.aromaticivorans)推斷的β-醚酶多肽的β_醚酶功能由生物化學活性測試得到的不可預期的結果。
[0035]圖5示出了根據一些實施方案、代表了天然木質素結構的作為待測試底物的β-芳基醚化合物。
[0036]圖6示出了根據一些實施方案、少動鞘氨醇單胞菌的愈創木酚基甘油-β-愈創木基醚(GGE)代謝途徑。
[0037]圖7示出了根據一些實施方案、由木質素寡聚體生產兒茶酚的生物化學工藝的實例。
[0038]圖8示出了根據一些實施方案、由木質素寡聚體生產香草醛的生物化學工藝的實例。
[0039]圖9示出了根據一些實施方案、由木質素寡聚體生產2，4- 二氨基甲苯的生物化學工藝的實例。
[0040]圖10示出了根據一些實施方案、由木質素寡聚體生產有價值的化學品的其他目的產物(包括鄰甲酚、水楊酸和氨基水楊酸)的工藝示意圖。
[0041]發明詳述
[0042]本發明總體而言涉及生產用於將木質素衍生的化合物生物轉變為有價值的芳香族化學品的酶的重組方法。目前，由於局限於能夠選擇性地將木質素轉變為所需的芳香族化合物的酶的知識，技 術人員局限在控制木質素的降解從而生產有用產物的能力。通常，技術人員了解兩個基本的事情:(I)木質素是複雜的；以及(2)因此，細菌木質素降解系統至少與木質素本身一樣複雜。因此，並且至少鑑於這些原因，本文所提供的教導提供了可用於生產工業用途的芳香族化合物物質的有價值的、不可預期且令人意想不到的一組系統、方法和組合物。
[0043]圖1A和IB示出了根據一些實施方案、本文所討論的生物精煉工藝和發現工藝的總體概念。圖1A示出了重組微生物菌株在用於由木質素衍生的化合物生產芳香族化學品的生物轉化中的用途的一般實例。生物精煉工藝100使用轉化的宿主細胞通過一系列生物轉化來轉變可溶的生物精煉木質素105。生物精煉木質素105為包含木質素衍生的化合物的原料，其可以為例如木質素衍生的單體和寡聚體的組合。「生物轉化1」107可以用於選擇性地切割單體上或單體間的鍵從而創造出其他的木質素單體110。「生物轉化2」 112可以用於選擇性地切割單體上或單體間的其他的鍵從而創造出單環芳香族商業化產物115。圖1B示出了發現工藝120，其包括選擇耐受木質素衍生的毒性化合物的宿主細胞菌株。該菌株的獲取125包括菌株的生長、樣品的製備和儲藏。獲得一組細菌菌株以用於測試菌株對可溶的生物精煉木質素樣品的耐受。
[0044]在一些實施方案中，可以針對(i)良好表徵的芳香族和異型生物質的代謝；
(ii)注釋的基因組序列；以及(iii)在試驗規模或較大規模的發酵工藝中的現有用途來選擇菌株。菌株的實例可以包括但不限於:棕色固氮菌(ATCC BAA-1303DJ),圓褐固氮菌(Azotobacter chroococcum) (ATCC4412 (EB Fred) X-50)，惡臭假單胞菌(Pseudomonas putida) (ATCC BAA_477Pf_5),突光假單胞菌(Pseudomonas f luorescens)(ATCC29837NCTC1100)。根據所附的ATCC文獻所述，可以將菌株在相關的豐富培養基平板上劃線以用於復活。可以挑選單個的菌落(5each)並在相關的液體培養基中培養直到飽和。在甘油的最終濃度為12.5%中製備的培養物樣品可以為速凍並儲藏在-80°C下。
[0045]可以通過優選法試驗研究組織(CRO)外購用於生物化學篩選選擇性活性的模式底物的合成150。酶的發現嘗試最初可以集中在識別通過生物信息學方法識別的潛在的醚酶候選物基因。具有醚酶活性的候選物的識別為由在可溶的木質素流中存在的木質素寡聚體生成木質素單體的第一步。在體外測試中，可以使用例如螢光底物α -O- ( β -甲基傘形酮基)乙醯香蘭酮(MUAV)來識別β_醚酶功能(Acme Biosciences,Mt.View, CA)。可以在例如λ ex = 365nm和λ em = 450nm(或460nm)下通過突光來監測在芳基醚鍵水解時4甲基傘形酮(4MU)的形成。
[0046]基因合成、克隆和轉化步驟145可以包括將生物信息學方法與顯示出所需的選擇性酶活性的相關酶的已知信息相結合。例如，生物信息學可以生產與少動鞘氨醇單胞菌IigE和IigFP -醚酶序列共有顯著的同源性的推定的β_醚酶序列。參見Masai, E., etal.Journal of Bacteriology (3):1768-1775 (2003) ( 「Masai 」)，其在此以引用方式全文併入本文。少動鞘氨醇單胞菌序列可以用作生物化學測試的陽性對照以便在酶發現策略中用於顯示相關活性。
[0047]基因合成、克隆和轉化步驟145可以使用本領域的技術人員已知的任何方法來實施。例如，所有的基因都可以使用基於標準的PCR方法的組裝方法並使用大腸桿菌的密碼子偏好以開放的閱讀框(ORF)由寡核苷酸直接合成。末端序列可以包含限制性消化並克隆到大腸桿菌表達載體pET24a(Novagen)中的適配體(BamHI和HindIII)。在寡核苷酸的消化過程中，內部BamHI和HindIII位點可以由ORF序列中排除。組裝的基因可以由純化的質粒DNA克隆到專用的克隆載體(pG0V4)中，轉化到大腸桿菌CH3化學感受態細胞中，以及確定的DNA序列(Tocore Inc.)中。在序列被證實之後，可以使用限制性消化來由克隆載體上切除各個ORF片段，並可以將該序列亞克隆到pET24a中。然後，將帶有質粒的完整的一組IigE和IigF轉化到大腸桿菌BL21(DE3)中，其中所述的大腸桿菌BL21可以作為β-醚酶表達和生物化學測試的宿主菌株。
[0048]進行酶的篩選155來識別新的醚酶160。可以使用螢光底物MUAV來篩選和識別重組大腸桿菌克隆物的醚酶活性。可以`在處於LB培養基(使用IPTG誘導)中的5ml或25ml的重組大腸桿菌菌株樣品中進行β_醚酶基因的表達。在誘導以及收穫細胞後，可以使用BPER(Invitrogen)細胞裂解系統來裂解細胞團。可以在體外生物化學測試中，在螢光底物MUAV上針對β -醚酶的活性來測試細胞提取物。可以在λ ex = 365nm和λ em =450nm(或460nm)下通過突光來監測在芳基醚鍵水解時4甲基傘形酮(4MU)的形成。使用少動鞘氨醇單胞菌IigE和IigF基因轉化的大腸桿菌細胞提取物可以為測試的陽性對照。測試樣品或未知樣品可以包括例如表達由N.aromaticovorans得到的推斷的β -醚酶基因的大腸桿菌菌株。
[0049]木質素流的獲取130包括用於測試的通過精煉得到的木質素廢物流。此類木質素的一個來源的初步特徵顯示芳香族單體的濃度低於lg/L，並且寡聚體的濃度為~10g/L。寡聚體顯示以10: I的比例與碳水化合物相關，例如糖:酚。一些信息存在於液體流中的化合物(包括苯甲酸、香草醛、紫丁香酸和ferulics)上，其中所述的化合物通常在可溶的樣品中定量。已經建立了單體的平均分子量~280，而寡聚體成分有待表徵。
[0050]菌株耐受測試135。在暴露於生物精煉的木質素時通過細胞的生長來確定菌株的耐受。在生物精煉木質素廢物流中的酚化合物的耐受對於微生物系統的生物加工的效率和高水平的生產芳香族化學品而言是非常重要的。細胞生長通過可溶的四唑鹽的還原情況而被定量為呼吸的函數。XTT (2，3-雙(2-甲氧基-4-硝基-5-磺苯基)-2H-四唑-5-甲醯苯胺內鹽，Sigma)被呼吸細胞還原為可溶的紫色甲臢化合物。通過450nm下的吸光率檢測並定量為甲臢產物。
[0051]例如，可以在48孔板中以液體形式對可溶的木質素進行菌株耐受的測試135。例如，各種菌株都可以測試8個重複，並且將大腸桿菌用作陰性對照菌株。首選，菌株可以在豐富培養基中生產以達到飽和，然後進行洗滌，並確定培養物的0D600nm。可以將等量的細菌接種到包含基本培養基(排除了碳源)的48孔生長板的孔中。除了 minus木質素陽性對照以外，可以將濃度增加的可溶的木質素級份加入到包含各個物種的孔中，直到最終體積為0.8ml。可以將木質素級份的苯甲酸含量分析作為不同起源的木植物廢料的酚含量的內部指示劑。在30°C下在搖動條件下溫育24-48小時後，可以使用XTT測試試劑盒針對在暴露於木質素級份時的生長情況來測試培養物。可以由48孔生長板中除去培養物樣品，並在96孔測試板中適當地稀釋至可以加入XTT試劑。通過在450nm下的吸光率來定量所生產的可溶的甲臢。表現為最高水平的生產、並由此耐受的細菌菌株可以為用於進一步研發用於木質素轉變的宿主菌株的候選物。
[0052]可以使用被識別為顯示出最高生物化學活性的β_醚酶基因轉化證明具有最佳耐受特徵的菌株。可以使用限制性消化來由克隆載體上切除ORF片段，並且可以將該序列亞克隆到穿梭載體ΡΜΜΒ206上。可以將在穿梭載體中克隆的構建體通過電穿孔或化學轉化而轉化到固氮菌屬或假單胞菌屬菌株中。可以使用適用於所用的特定的宿主菌株的本領域的技術人員已知的任何方法(例如本文所描述的那些)，針對β_醚酶的表達和活性來再次測試重組的木質素耐受宿主菌株。
[0053]得自精煉工藝的原料
[0054]起始材料的實例可以為預處理的木質纖維素生物質。在一些實施方案中，木質纖維素生物質可以包括草、穀物稷、稻殼、農業殘餘物、軟木和硬木。在一些實施方案中，木質素衍生的化合物可以衍生自硬木物種，例如得自the Upper Peninsula region ofMichigan的楊樹；或者硬木,例如楊樹、lolloby pine、以及得自Virginia和Georgia地區的桉樹；或者混合硬木，包括得自New York北部地區的楓樹和櫟樹物種。
[0055]在一些實施方案中，預處理方法可以涵蓋一定範圍的基於物理、化學和生物的工藝。用於生成Aligna工藝使用的原料的預處理方法的實例可以包括物理預處理、溶劑分級、化學預處理、生物預處理、離子液體預處理、超臨界流體預處理、或例如可以在多個階段中利用的它們的組合。
[0056]用於減小木質纖維素生物質粒徑減小的物理預處理方法可以使用幹法機械壓制方法、溼法振動以及基於壓制的球磨研磨過程。溶劑分級方法包括有機溶劑(organosolve)工藝、磷酸分級工藝以及使用離子液體對木質纖維素生物質進行預處理從而差異溶解和區分生物質的不同成分的方法。在一些實施方案中，有機溶劑方法可以通過以下方式實施:使用醇，包括乙醇；使用酸催化劑；在大約90°C至大約20°C、以及大約155°C至大約220°C ；停留時間為大約25分鐘至大約100分鐘。催化劑濃度可以為大約0.83%至大約1.67%,醇的濃度可以為大約25%至大約74% (ν/ν) .在一些實施方案中，木質纖維素生物質的磷酸分級可以使用一系列不同的提取液(使用磷酸、丙酮和水)在大約50°C的溫度下實施。在一些實施方案中，木質纖維素生物質的離子液體預處理可以包括使用包含陰離子(例如氯離子、甲酸根、乙酸根或烷基磷酸根)的離子液體，並且生物質:離子液體的比例為大約I: 10(w/w)o所述的預處理可以在大約100°C至大約150°C的溫度下實施。可以使用的其他離子液體化合物包括1- 丁基-3-甲基-氯化咪唑和1-乙基-3-甲基氯化咪唑。
[0057]木質纖維素生物質材料的化學預處理可以使用多種技術實施，包括酸性、鹼性和氧化處理。在一些實施方案中，可以使用木質纖維素生物質的酸預處理方法，例如下文所述的那些。稀釋的酸預處理使用了濃度為大約0.05%至大約5%的硫酸，溫度範圍為大約160°C至大約220°C。蒸汽噴發為在大約160°C至大約290°C的溫度下，在蒸汽噴發之前使用或未使用催化劑，例如硫酸、硝酸、碳酸、琥珀酸、富馬酸、馬來酸、檸檬酸、二氧化硫、氫氧化鈉、氨。液態熱水處理為在壓力> 5MPa、溫度範圍為大約160°C至大約230°C、並且pH範圍為大約4至大約7。並且，在一些實施方案中，可以使用鹼處理方法，其使用了催化劑，例如氧化鈣、氨和氫氧化鈉。可以使用氨纖維膨脹(AFEX)方法，其中在大約60°C至大約140°C下，在高壓反應器中使用大約0.3kg至大約2kg氨/kg乾重生物質的濃氨,並煮5-45分鐘，然後快速釋放壓力。可以在高溫和高壓下，通過滲透濃度為5-15%的氨溶液來以流通方式使用氨再循環滲透(ARP)。在高壓反應器中，在大約170°C至大約220°C的溫度下，氧化預處理方法(例如鹼性溼法氧化)可以與碳酸鈉一起使用，其中使用加壓空氣/氧氣的混合物或過氧化氫作為氧化劑。
[0058]可以使用生物預處理方法，其使用了白腐擔子菌和某些放線菌。得自此類預處理方法的一種類型的產物流可以為可溶的木質素，並且可以包含木聚糖，以及大約lg/L至大約10g/L的木質素衍生的單體和寡聚體。木質素衍生的單體可以包括諸如鞣酸、羥基安息香酸酯、阿魏酸、羥甲基糠醛、羥甲基糠醛醇、香草醛、高香草醛、紫丁香酸、紫丁香醛和糠醛醇之類的化合物。
[0059]超臨界流體預處理方法可以用於加工生物質。在加工生物質中使用的超臨界流體的實例包括在高於乙醇和二氧化碳的臨界的溫度和壓力下、但是低於水的臨界的溫度和/或壓力下的乙醇、丙酮、水和二氧化碳`。
[0060]可以使用蒸汽預處理和生物預處理方法的組合。例如，在195°C下，將生物質蒸汽在受控的pH下預處理10分鐘，然後使用計量為IOOmg蛋白質/總固體的商業化的纖維素酶和木聚糖酶進行酶處理，並在pH5.0、50°C下溫育，同時在500rpm下攪拌。
[0061]在一些實施方案中，可以使用水熱、有機溶劑和生物預處理方法的組合。此類組合的一個實例為3階段的工藝:
[0062]階段1.對於水熱工藝而言，在預定的pH、溫度和壓力下，在水性介質中加熱；
[0063]階段2.對於有機溶劑步驟而言，在水中，使用得自6_6c中所述的那些中的至少一種有機溶劑；
[0064]階段3.對於生物預處理步驟而言，使用天然或重組形式的酵母菌、白腐擔子菌、放線菌和纖維素酶和木聚糖酶。
[0065]使用有機溶劑方法衍生的可溶的木質素級份可以生產分子量範圍為188-1000的可溶於多種極性溶劑中的可溶的木質素。不想被任何理論或作用機制所限制，有機溶劑工藝通常被認為可以保持木質素β_芳基醚鍵。[0066]可以使用由蒸汽噴發的木質纖維素質生物質得到的木質素流。例如，可以使用在大約200psi至大約500psi範圍、溫度範圍為大約180°C至大約230°C的高壓蒸汽在分批或連續的反應器中進行大約I分鐘至大約20分鐘來實施蒸汽噴發。可以使用鹼性洗滌或使用有機溶劑進行提取來由蒸汽噴發的材料提取木質素。蒸汽噴發的木質素可以表現出與本文所述形式的有機溶劑木質素相似的性質，其保持了天然的鍵的結構，並且每個寡聚體單元都包含大約3至大約12個芳香族單元。
[0067]超臨界流體預處理可以生產可以根據本文所提供的教導使用的可溶的木質素級份。此類工藝通常產生分子量為大約< 1000道爾頓的單體和木質素寡聚體。
[0068]生物預處理可以生產可以根據本文所提供的教導使用的可溶的木質素級份。此類木質素流可以包含木聚糖，以及大約lg/L至大約10g/L的且分子量為大約< 1000道爾頓的木質素單體和木質素寡聚體。木質素衍生的單體可以包括諸如鞣酸、羥基安息香酸酯、阿魏酸、羥甲基糠醛、羥甲基糠醛醇、香草醛、高香草醛、紫丁香酸、紫丁香醛和糠醛醇之類的化合物。
[0069]由木漿工藝得到的原料
[0070]木漿工藝生產出多種類型的木質素，木質素的類型取決於所採用的工藝的類型。例如，化學製漿工藝包括Kraft製漿和亞硫酸鹽法製漿。
[0071]在一些實施方案中，木質素衍生的化合物可以衍生自Kraft製漿工藝的製漿廢液或「黑液」。Kraft木質素可以衍生自分批或連續的工藝，這些工藝採用了以下條件:例如，反應溫度為大約150°C至大約200°C，反應時間為大約2小時。可以得到分子量為任何範圍的木質素，並且在一些實施方案中，有用的級份可以為大約200道爾頓至大約400道爾頓的範圍。在生物轉換中可以 使用分子量範圍為大約1000道爾頓至大約3000道爾頓的Kraft木質素。
[0072]在一些實施方案中，可以使用得自亞硫酸鹽法製漿工藝的木質素。亞硫酸鹽法製漿工藝可以包括例如化學磺化作用，其在大約2至大約12的pH範圍下，使用了水性二氧化硫、重亞硫酸鹽和中性亞硫酸鹽。磺化的木質素可以使用過量的石灰通過沉澱以木素磺化鹽的形式回收。備選地，可以對木質素芳香族化合物進行基於甲醛的甲基化，然後進行磺化作用。可以得到分子量為任何範圍的木質素，並且在一些實施方案中，有用的級份可以為大約200道爾頓至大約4000道爾頓。在生物轉換中可以使用分子量範圍為大約1000道爾頓至大約3000道爾頓的亞硫酸鹽木質素。
[0073]在生物轉換中使用的木質素衍生的化合物的特徵
[0074]用於特定原料的系統的優化應該包括對特定原料的組成的了解。例如，技術人員應該理解，天然木質素的組成可以明顯不同於用於原料的給定木質素級份中的木質素衍生的化合物的組成。因此，對原料的組成的了解將有助於優化木質素衍生的化合物向有價值的芳香族化合物的轉換。技術人員已知的任何方法可以用於表徵原料的組成。例如，技術人員可以使用與氣相色譜(其傳統上已經使用)偶聯的溼法化學技術，例如硫代酸解和硝基苯氧化法；或者使用光譜技術，例如NMR和FTIR。例如，硫代酸解法會切割木質素中的β -0-4鍵，從而得到單體和二聚體，然後這些單體和二聚體用於計算S和G含量。可以使用硝基苯氧化法得到相似的信息，但是認為比例較不精確。在一些實施方案中，S、G和H的含量，以及它們的相對比例可以用於表徵原料的組成，以便確定生物轉換系統的設計。[0075]廣泛接受的是，木質素的生物合成源自三種類型的苯基丙烷單元的聚合，也稱為木質素單體。這些單元為松柏醇、芥子醇和對香豆醇。三種結構如下:
[0076]
【權利要求】
1.一種分離的重組多肽，其包含: 與SEQ ID NO:101具有至少95%的一致性的胺基酸序列，該胺基酸序列保留了 SEQ IDNO:101 的殘基 1，2，4-8，10-12，14，17，19-22，24，25，27-37，39，41-54，57，58，60，62-67，69-73,75,77-80,82-87,89,100，102，103，104，105，107，I10-114，I17，212，122，124-130，133，134，137-139，148，149，151—156，159，160，166—168，170，173，174，178—181，184，185，187-189，198-201，204，205，207，210-216，219，222，223，226-232，235-239，242-246，249，251，254，257，264，266，267，270,275 和 278 ； 其中除了所述的保守殘基以外的胺基酸取代為保守性取代；以及 所述的胺基酸序列起到切割β-芳基醚的作用。
2.一種分離的重組多肽，其包含: 與SEQ ID NO:101具有至少95%的一致性的胺基酸序列，該胺基酸序列保留了 SEQ IDNO:101 的殘基 19-22，24，25，27-30，33-36，39-45，47，48，50-54 ;100，101，104，111，112，115，116，166，107，184，187，188，191，192 和 195 ； 其中除了所述的保守殘基以外的胺基酸取代為保守性取代。
3.權利要求2所述的分離的重組多肽，其中所述的胺基酸序列起到切割β-芳基醚的作用。
4.一種分離的重組多肽，其包含: SEQ ID NO:101 ;或者除了 SEQ ID NO:101 的保守殘基 19-22，24，25，27-30，33-36，39-45，47，48，50-54 ;100，101，104，111，112，115，116，166，107，184，187，188，191，192 和195以外的保守性取代。
5.一種分離的重組穀胱甘肽S轉移酶，其包含: 與SEQ ID NO:101具有至少95%的一致性的胺基酸序列，該胺基酸序列保留了 SEQ IDNO:101 的殘基 19-22，24，25，27-30，33-36，39-45，47，48，50-54 ;100，101，104，111，112，115，116，166，107，184，187，188，191，192 和 195 ； 其中所述的胺基酸序列起到切割β-芳基醚的作用。
6.一種分離的重組穀胱甘肽S轉移酶，其包含: 與SEQ ID NO:101具有至少95%的一致性的胺基酸序列；其中，所述的胺基酸序列起到切割芳基醚的作用。
7.一種分離的重組多肽，其包含: 長度範圍為大約279至大約281個胺基酸； 由以下部分構成的第一胺基酸區域:得自SEQ ID NO:101的殘基19-54，或者除了 SEQID NO:101 的保守殘基 19-22，24，25，27-30，33-36，39-45，47，48 和 50-54 以外的保守性取代；以及 由以下部分構成的第二胺基酸區域:得自SEQ ID NO:101的殘基98-221，或SEQ IDNO:101 的除保守殘基 100，101，104，111，112，115，116，166，107，184，187，188，191，192 和195以外的保守性取代。
8.一種分離的重組穀胱甘肽S轉移酶，其包含: 長度範圍為大約279至大約281個胺基酸； 第一胺基酸區域，其具有與得自SEQ ID NO:101殘基19-54具有至少95%的一致性，同時保留了 SEQ ID NO:101 的殘基 19-22，24，25，27-30，33-36，39-45，47，48 和 50-54 ;其中所述的第一胺基酸區域定位於大約殘基14至大約殘基59的重組多肽中；以及 第二胺基酸區域，其具有與得自SEQ ID NO:101殘基98-221具有至少95%的一致性，同時保留了 SEQ ID NO:101 的殘基 100，101，104，111，112，115，116，166，107，184，187，.188，191，192和195 ;其中所述的第二胺基酸區域可以定位於大約殘基93至大約殘基226的重組多肽中；以及 其中所述的重組穀胱甘肽S轉移酶可以起到切割β-芳基醚的作用。
9.權利要求8所述的分離的重組多肽，其中除了所述的保守殘基以外的胺基酸取代為保守性取代。
10.一種切割芳基醚鍵的方法，其包括: 將包含胺基酸序列的多肽與木質素衍生的化合物相接觸，其中所述的胺基酸序列與SEQ ID NO:101具有至少95%的一致性，並且所述的胺基酸序列保留了 SEQ ID NO:101的殘基 19-22，24，25，27-30，33-36，39-45，47，48，50-54 ;100，101，104，111，112，115，116，166，107，184，187，188，191，192和195 ;所述的木質素衍生的化合物具有(i) β -芳基醚鍵，並且(ii)分子量範圍為大約180道爾頓至大約3000道爾頓； 其中所述的接觸是在其中所述的木質素衍生的化合物是可溶的溶劑環境中進行。
11.權利要求10所述的方法，其中所述的木質素衍生的化合物的分子量為大約180道爾頓至大約1000道爾頓。
12.權利要求10所述的方法，其中除了所述的保守殘基以外的胺基酸取代為保守性取代。
13.權利要求10所述的方法，其中所述的溶劑環境包含水。
14.權利要求10所述的方法，其中所述的溶劑環境包含極性有機溶劑。
15.一種切割芳基醚鍵的方法，其包括: 將包含胺基酸序列的多肽與木質素衍生的化合物相接觸，其中所述的胺基酸序列與SEQ ID NO:101具有至少95%的一致性，並且所述的胺基酸序列保留了 SEQ ID NO:101的殘基 19-22，24，25，27-30，33-36，39-45，47，48，50-54 ;100，101，104，111，112，115，116，166，107，184，187，188，191，192和195 ;所述的木質素衍生的化合物具有(i) β -芳基醚鍵，並且(ii)分子量範圍為大約180道爾頓至大約3000道爾頓； 其中所述的接觸是在其中所述的木質素衍生的化合物是可溶的溶劑環境中進行。
16.權利要求15所述的方法，其中所述的木質素衍生的化合物的分子量為大約180道爾頓至大約1000道爾頓。
17.權利要求15所述的方法，其中所述的溶劑環境包含水。
18.權利要求15所述的方法，其中所述的溶劑環境包含極性有機溶劑。
19.一種用於生物加工木質素衍生的化合物的系統，其包括: 具有胺基酸序列的多肽，其中所述的胺基酸序列與SEQ ID NO:101具有至少95%的一致性，並且所述的胺基酸序列保留了 SEQ ID NO:101的殘基19-22，24，25，27-30，33-36，39-45，47，48，50-54 ;100，101，104，111，112，115，116，166，107，184，187，188，191，192 和.195； 木質素衍生的化合物，其具有β -芳基醚鍵，並且分子量範圍為大約180道爾頓至大約3000道爾頓；以及 所述的木質素衍生的化合物可溶於其中的溶劑； 其中所述的系統通過將所述的多肽與所述的木質素衍生的化合物在所述的溶劑中相接觸來起到切割所述的β-芳基醚鍵的作用。
20.權利要求19所述的系統，其中除了所述的保守殘基以外的胺基酸取代為保守性取代。
21.一種包含核苷酸序列的重組多核苷酸，其中所述的核苷酸序列編碼了多肽，該多肽具有與SEQ ID NO:101至少95%的一致性的胺基酸序列，並且該胺基酸序列保留的SEQ IDNO:101 的殘基 19-22，24，25，27-30，33-36，39-45，47，48，50-54 ;100，101，104，111，112，115，116，166，107，184，187，188，191，192 和 195。
22.一種包含核苷酸序列的重組多核苷酸，其中所述的核苷酸序列編碼了多肽，該多肽包含 SEQ ID NO:101 ;或者除了 SEQ ID NO:101 的保守殘基 19-22，24，25，27-30，33-36，39-45，47，48，50-54 ;100，101，104，111，112，115，116，166，107，184，187，188，191，192 和195以外的保守性取代。
23.—種包含權利要求21所述的多核苷酸的載體。
24.—種包含權利要求22所述的多核苷酸的載體。
25.—種包含權利要求21所述的多核苷酸的質粒。
26.—種包含權利要求22所述的多核苷酸的質粒。
27.一種由權利要求23所述的載體所轉化的宿主細胞。
28.一種由權利要求24所述的載體所轉化的宿主細胞。
29.一種切割芳基醚鍵的方法，其包括: 在適於生產所述的多肽的條件下培養權利要求27所述的宿主細胞； 由所述的宿主細胞培養物回收所述的多肽；以及 將所述的多肽與木質素衍生的化合物相接觸，其中所述的木質素衍生的化合物具有(?) β -芳基醚鍵；並且(ii)分子量範圍為大約180道爾頓至大約3000道爾頓； 其中所述的接觸是在其中所述的木質素衍生的化合物是可溶的溶劑環境中進行。
30.權利要求29所述的方法，其中所述的宿主細胞為大腸桿菌。
31.權利要求29所述的方法，其中所述的宿主細胞為棕色固氮菌。
32.權利要求29所述的方法，其中所述的木質素衍生的化合物的分子量為大約180道爾頓至大約1000道爾頓。
33.權利要求29所述的方法，其中除了所述的保守殘基以外的胺基酸取代為保守性取代。
34.權利要求29所述的方法，其中所述的溶劑環境包含水。
35.權利要求29所述的方法，其中所述的溶劑環境包含極性有機溶劑。
36.一種切割芳基醚鍵的方法，其包括: 在適於生產所述的多肽的條件下培養權利要求28所述的宿主細胞； 由所述的宿主細胞培養物回收所述的多肽；以及 將所述的多肽與木質素衍生的化合物相接觸，其中所述的木質素衍生的化合物具有(?) β -芳基醚鍵；並且(ii)分子量範圍為大約180道爾頓至大約3000道爾頓；其中所述的接觸是在其中所述的木質素衍生的化合物是可溶的溶劑環境中進行。
37.權利要求36所述的方法，其中所述的宿主細胞為大腸桿菌。
38.權利要求36所述的方法，其中所述的宿主細胞為棕色固氮菌。
39.權利要求36所述的方法，其中所述的木質素衍生的化合物的分子量為大約180道爾頓至大約1000道爾頓。
40.權利要求36所述的方法，其中所述的溶劑環境包含水。
41.權利要求36所述的方法，其中所述的溶劑環境包含極性有機溶劑。
42.一種用於生物加工木質素衍生的化合物的系統，其包括: 權利要求27所述的轉化的宿主細胞； 木質素衍生的化合物，其具有β_芳基醚鍵；並且分子量範圍為大約180道爾頓至大約3000道爾頓；以及 所述的木質素衍生的化合物可溶於其中的溶劑； 其中所述的系統通過將所述的多肽與所述的木質素衍生的化合物在所述的溶劑中相接觸來起到切割所述的芳 基醚鍵的作用。
43.權利要求42所述的系統，其中所述的轉化的宿主細胞包括棕色固氮菌。
44.權利要求42所述的系統，其中所述的轉化的宿主細胞在其中所述的木質素衍生的化合物是可溶的溶劑中表達所述的多肽。
45.一種用於生物加工木質素衍生的化合物的系統，其包括: 轉化子，其包含使用權利要求23所述的載體轉化的宿主細胞，該轉化子表達所述的多肽； 木質素衍生的化合物，其具有β_芳基醚鍵；並且分子量範圍為大約180道爾頓至大約3000道爾頓；以及 所述的木質素衍生的化合物可溶於其中的溶劑； 其中所述的系統通過將所述的多肽與所述的木質素衍生的化合物在所述的溶劑中相接觸來起到切割所述的芳基醚鍵的作用。
46.權利要求45所述的系統，其中所述的轉化子包括大腸桿菌。
47.權利要求45所述的系統，其中所述的轉化子包括棕色固氮菌。
48.權利要求45所述的系統，其中除了所述的保守殘基以外的胺基酸取代為保守性取代。
49.權利要求45所述的系統，其中所述的轉化的宿主細胞在其中所述的木質素衍生的化合物是可溶的溶劑中表達所述的多肽。
50.權利要求45所述的系統，其中所述的木質素衍生的化合物的分子量為大約180道爾頓至大約1000道爾頓。
51.權利要求45所述的系統，其中所述的溶劑環境包含水。
52.權利要求45所述的方法，其中所述的溶劑環境包含極性有機溶劑。
53.一種用於生物加工木質素衍生的化合物的系統，其包括: 轉化子，其包含使用權利要求24所述的載體轉化的宿主細胞，該轉化子表達所述的多肽； 木質素衍生的化合物，其具有β_芳基醚鍵；並且分子量範圍為大約180道爾頓至大約3000道爾頓；以及 所述的木質素衍生的化合物可溶於其中的溶劑； 其中所述的系統通過將所述的多肽與所述的木質素衍生的化合物在所述的溶劑中相接觸來起到切割所述的β-芳基醚鍵的作用。
54.權利要求53所述的系統，其中所述的轉化子包括大腸桿菌。
55.權利要求53所述的系統，其中所述的轉化子包括棕色固氮菌。
56.權利要求53所述的系統，其中所述的轉化的宿主細胞在其中所述的木質素衍生的化合物是可溶的溶劑中表達所述的多肽。
57.權利要求53所述的系統，其中所述的木質素衍生的化合物的分子量為大約180道爾頓至大約1000道爾頓。
58.權利要求53所述的系統，其中所述的溶劑環境包含水。
59.權利要求53所述的方法，其中所述的溶劑環境包含極性有機溶劑。
60.一種用於生物加工木質素衍生的化合物的系統，其包括: 轉化子，其包含使用權利要求23所述的載體轉化的棕色固氮菌，該轉化子表達所述的多肽； 木質素衍生的化合物，其具有β -芳基醚鍵；並且分子量範圍為大約180道爾頓至大約3000道爾頓；以及 所述的木質素衍生的化合物可溶於其中的溶劑； 其中所述的系統通過將所述的多肽與所述的木質素衍生的化合物在所述的溶劑中相接觸來起到切割所述的β-芳基醚鍵的作用。
61.權利要求60所述的系統，其中所述的轉化的宿主細胞在其中所述的木質素衍生的化合物是可溶的溶劑中表達所述的多肽。
62.權利要求60所述的系統，其中所述的木質素衍生的化合物的分子量為大約180道爾頓至大約1000道爾頓。
63.權利要求60所述的系統，其中所述的溶劑環境包含水。
64.權利要求60所述的方法，其中所述的溶劑環境包含極性有機溶劑。
65.一種分離的重組多肽，其包含: 胺基酸序列，該胺基酸序列與SEQ ID NO:541具有至少95%的一致性，並且該胺基酸序列保留了殘基 47-57,63-76,100，101，104，107，111，112，115，116，176，194，197，198，201,202 和 206。
66.權利要求65所述的分離的重組多肽，其中除了所述的保守殘基以外的胺基酸取代為保守性取代。
67.權利要求65所述的分離的重組多肽，其中所述的胺基酸序列起到切割β-芳基醚的作用。
68.一種分離的重組多肽，其包含: SEQ ID NO:541 ;或者除了保守殘基 47-57，63-76，100，101，104，107，111，112，115，116，176，194，197，198，201，202 和 206 以外的保守性取代。
69.一種分離的重組穀胱甘肽S轉移酶，其包含: 胺基酸序列，該胺基酸序列與SEQ ID NO:541具有至少95%的一致性，並且該胺基酸序列保留了保守性殘基 47-57,63-76,100，101，104，107，111，112，115，116，176，194，197，198，201，202 和 206 ； 其中所述的胺基酸序列起到切割β-芳基醚的作用。
70.一種分離的重組穀胱甘肽S轉移酶，其包含: 與SEQ ID NO:541具有至少95%的一致性的胺基酸序列；其中所述的胺基酸序列起到切割芳基醚的作用。
71.一種分離的重組多肽，其包含: 長度範圍為大約256至大約260個胺基酸； 由以下部分構成的第一胺基酸區域:得自SEQ ID NO:541的殘基47-57，或者除了 SEQID NO:101的保守殘基47，48，49，50，52，54，55，56，57以外的保守性取代；以及第二胺基酸區域，其由得自SEQ ID NO:541的63-76構成；以及由以下部分構成的第三胺基酸區域:得自SEQ ID NO:541的殘基99-230，或者除了保守殘基 100，101，104，107，111，112，115，116，176，194，197，198，201，202 和 206 以外的保守性取代。
72.—種分離的重組穀胱甘肽S轉移酶，其包含: 長度範圍為大約279至大約281個胺基酸； 第一胺基酸區域，其與得自SEQ ID NO:541的47-57具有至少95%的一致性，或者除了保守殘基47，48，49，50，52，54，55，56，57以外的保守性取代； 第二胺基酸區域，其由得自SEQ ID NO:541的63-76構成；以及第三胺基酸區域，其與得自SEQ ID NO:541的殘基99-230具有至少95%的一致性，或者除了保守殘基 100，101，104，107，111，112，115，116，176，194，197，198, 201, 202 和 206 以外的保守性取代； 其中所述的重組穀胱甘肽S轉移酶起到切割β-芳基醚的作用。
73.權利要求72所述的分離的重組多肽，其中除了所述的保守殘基以外的胺基酸取代為保守性取代。
74.一種切割芳基醚鍵的方法，其包括: 將胺基酸序列與木質素衍生的化合物相接觸，其中所述的胺基酸序列與SEQ ID NO:541具有至少95 %的一致性，並且該胺基酸序列保留了殘基47-57，63-76，100，101，104，107，111，112，115，116，176，194，197，198,201,202 和 206 ;其中所述的木質素衍生的化合物具有(i) β -芳基醚鍵；並且(ii)分子量範圍為大約180道爾頓至大約3000道爾頓； 其中所述的接觸是在其中所述的木質素衍生的化合物是可溶的溶劑環境中進行。
75.權利要求74所述的方法，其中所述的木質素衍生的化合物的分子量為大約180道爾頓至大約1000道爾頓。
76.權利要求74所述的方法，其中除了所述的保守殘基以外的胺基酸取代為保守性取代。
77.權利要求74所述的方法，其中所述的溶劑環境包含水。
78.權利要求74所述的方法，其中所述的溶劑環境包含極性有機溶劑。
79.一種切割芳基醚鍵的方法，其包括: 將多肽與木質素衍生的化合物相接觸，其中所述的多肽包含SEQ IDNO:541 ;或者除了保守殘基 47-57,63-76,100，101，104，107，111，112，115，116，176，194，197，198,201,202和206以外的保守性取代；其中所述的木質素衍生的化合物具有⑴β -芳基醚鍵；並且(ii)分子量範圍為大約180道爾頓至大約3000道爾頓； 其中所述的接觸是在其中所述的木質素衍生的化合物是可溶的溶劑環境中進行。
80.權利要求79所述的方法，其中所述的木質素衍生的化合物的分子量為大約180道爾頓至大約1000道爾頓。
81.權利要求79所述的方法，其中所述的溶劑環境包含水。
82.權利要求79所述的方法，其中所述的溶劑環境包含極性有機溶劑。
83.一種用於生物加工木質素衍生的化合物的系統，其包括: 多肽，其與SEQ ID NO:541具有至少95%的一致性，所述的胺基酸序列保留了殘基47-57,63-76,100，101，104，107，111，112，115，116，176，194，197，198,201,202 和 206 ；木質素衍生的化合物，其具有β -芳基醚鍵；並且分子量範圍為大約180道爾頓至大約3000道爾頓；以及 所述的木質素衍生的化合物可溶於其中的溶劑； 其中所述的系統通過將所述的多肽與所述的木質素衍生的化合物在所述的溶劑中相接觸來起到切割所述的β-芳基醚鍵的作用。
84.權利要求83所述的系統，其中除了所述的保守殘基以外的胺基酸取代為保守性取代。
85.—種包含核苷酸序列的重組多核苷酸,其中所述的核苷酸序列編碼了權利要求65所述的多肽。
86.—種包含核苷酸序列的重組多核苷酸，其中所述的核苷酸序列編碼了權利要求68所述的多肽。
87.—種包含權利要求65所述的多核苷酸的載體。
88.—種包含權利要求68所述的多核苷酸的載體。
89.—種包含權利要求65所述的多核苷酸的質粒。
90.—種包含權利要求68所述的多核苷酸的質粒。
91.一種由權利要求87所述的載體轉化的宿主細胞。
92.一種由權利要求88所述的載體轉化的宿主細胞。
93.一種切割芳基醚鍵的方法，其包括: 在適於生產所述的多肽的條件下培養權利要求91所述的宿主細胞； 由所述的宿主細胞培養物回收所述的多肽；以及 將所述的多肽與木質素衍生的化合物相接觸，其中所述的木質素衍生的化合物具有(?) β -芳基醚鍵；並且(ii)分子量範圍為大約180道爾頓至大約3000道爾頓； 其中所述的接觸是在其中所述的木質素衍生的化合物是可溶的溶劑環境中進行。
94.權利要求93所述的方法，其中所述的宿主細胞為大腸桿菌。
95.權利要求93所述的方法，其中所述的宿主細胞為棕色固氮菌。
96.權利要求93所述的方法，其中所述的木質素衍生的化合物的分子量為大約180道爾頓至大約1000道爾頓。
97.權利要求93所述的方法，其中除了所述的保守殘基以外的胺基酸取代為保守性取代。
98.權利要求93所述的方法，其中所述的溶劑環境包含水。
99.權利要求93所述的方法，其中所述的溶劑環境包含極性有機溶劑。
100.—種切割β-芳基醚鍵的方法，其包括: 在適於生產所述的多肽的條件下培養權利要求92所述的宿主細胞； 由所述的宿主細胞 培養物回收所述的多肽；以及 將所述的多肽與木質素衍生的化合物相接觸，其中所述的木質素衍生的化合物具有(?) β -芳基醚鍵；並且(ii)分子量範圍為大約180道爾頓至大約3000道爾頓； 其中所述的接觸是在其中所述的木質素衍生的化合物是可溶的溶劑環境中進行。
101.權利要求100所述的方法，其中所述的宿主細胞為大腸桿菌。
102.權利要求100所述的方法，其中所述的宿主細胞為棕色固氮菌。
103.權利要求100所述的方法，其中所述的木質素衍生的化合物的分子量為大約180道爾頓至大約1000道爾頓。
104.權利要求100所述的方法，其中所述的溶劑環境包含水。
105.權利要求100所述的方法，其中所述的溶劑環境包含極性有機溶劑。
106.一種用於生物加工木質素衍生的化合物的系統，其包括: 權利要求91所述的轉化的宿主細胞； 木質素衍生的化合物，其具有β -芳基醚鍵；並且分子量範圍為大約180道爾頓至大約3000道爾頓；以及 所述的木質素衍生的化合物可溶於其中的溶劑； 其中所述的系統通過將所述的多肽與所述的木質素衍生的化合物在所述的溶劑中相接觸來起到切割所述的β-芳基醚鍵的作用。
107.權利要求106所述的系統，其中所述的轉化的宿主細胞包括棕色固氮菌。
108.權利要求106所述的系統，其中所述的轉化的宿主細胞在其中所述的木質素衍生的化合物是可溶的溶劑中表達權利要求65所述的多肽。
109.一種用於生物加工木質素衍生的化合物的系統，其包括: 轉化子，其包含使用權利要求87所述的載體轉化的宿主細胞，該轉化子表達所述的多肽； 木質素衍生的化合物，其具有β -芳基醚鍵；並且分子量範圍為大約180道爾頓至大約3000道爾頓；以及 所述的木質素衍生的化合物可溶於其中的溶劑； 其中所述的系統通過將所述的多肽與所述的木質素衍生的化合物在所述的溶劑中相接觸來起到切割所述的β-芳基醚鍵的作用。
110.權利要求109所述的系統，其中所述的轉化子包括大腸桿菌。
111.權利要求109所述的系統，其中所述的轉化子包括棕色固氮菌。
112.權利要求109所述的系統，其中除了所述的保守殘基以外的胺基酸取代為保守性取代。
113.權利要求109所述的系統，其中所述的轉化的宿主細胞在其中所述的木質素衍生的化合物是可溶的溶劑中表達所述的多肽。
114.權利要求109所述的系統，其中所述的木質素衍生的化合物的分子量為大約180道爾頓至大約1000道爾頓。
115.權利要求109所述的系統，其中所述的溶劑環境包含水。
116.權利要求109所述的系統，其中所述的溶劑環境包含極性有機溶劑。
117.一種用於生物加工木質素衍生的化合物的系統，其包括: 轉化子，其包含使用權利要求88所述的載體轉化的宿主細胞，該轉化子表達所述的多肽； 木質素衍生的化合物，其具有β_芳基醚鍵；並且分子量範圍為大約180道爾頓至大約3000道爾頓；以及 所述的木質素衍生的化合物可溶於其中的溶劑； 其中所述的系統通過將所述的多肽與所述的木質素衍生的化合物在所述的溶劑中相接觸來起到切割所述的芳基醚鍵的作用。
118.權利要求117所述的系統，其中所述的轉化子包括大腸桿菌。
119.權利要求117所述的系統，其中所述的轉化子包括棕色固氮菌。
120.權利要求117所述的系統，其中所述的轉化的宿主細胞在其中所述的木質素衍生的化合物是可溶的溶劑中表達所述的多肽。
121.權利要求117所述的系統，其中所述的木質素衍生的化合物的分子量為大約180道爾頓至大約1000道爾頓。
122.權利要求117所述的系統，其中所述的溶劑環境包含水。
123.權利要求117所述的系統，其中所述的溶劑環境包含極性有機溶劑。
124.—種用於生物加工木質素衍生的化合物的系統，其包括: 轉化子，其包含使用權利要求87所述的載體轉化的棕色固氮菌宿主細胞，該轉化子表達所述的多肽； 木質素衍生的化合物，其具有β_芳基醚鍵；並且分子量範圍為大約180道爾頓至大約3000道爾頓；以及 所述的木質素衍生的化合物可溶於其中的溶劑； 其中所述的系統通過將所述的多肽與所述的木質素衍生的化合物在所述的溶劑中相接觸來起到切割所述的芳基醚鍵的作用。
125.權利要求124所述的系統，其中所述的轉化的宿主細胞在其中所述的木質素衍生的化合物是可溶的溶劑中表達所述的多肽。
126.權利要求124所述的系統，其中所述的木質素衍生的化合物的分子量為大約180道爾頓至大約1000道爾頓。
127.權利要求124所述的系統，其中所述的溶劑環境包含水。
128.權利要求124所述的系統，其中所述的溶劑環境包含極性有機溶劑。
【文檔編號】C12P1/04GK103797026SQ201180044555
【公開日】2014年5月14日 申請日期:2011年8月29日 優先權日:2010年9月15日
【發明者】R·查特吉, K·贊恩, K·米歇爾, G·Y·劉 申請人:阿利吉那科技有限公司