風疹病毒IgG抗體化學發光免疫分析測定試劑盒及其製備方法

2023-05-28 02:39:01 1

專利名稱：：風疹病毒IgG抗體化學發光免疫分析測定試劑盒及其製備方法
技術領域：
：本發明涉及免疫分析醫學領域，具體地，本發明提供了一種風疹病毒IgG抗體化學發光免疫分析測定試劑盒及其製備方法。
背景技術：
：風疹病毒屬於披膜病毒科，具單股正鏈RNA，直徑為60nm，僅有一個血清型。風疹病毒的抗原結構相當穩定，是一種最危險的致畸因素。風疹病毒與巨細胞病毒、弓形蟲病毒、皰疹病毒1型和2型共同命名為T0RCH。這五大病毒的共同危害是造成流產、早產、死胎、胎兒畸形、殘疾兒。僥倖存活的新生兒常可發生生長發育遲緩、白內障、神經性耳聾、先天性心臟病、腦膜腦炎、巨細胞肝炎、溶血性貧血、視力、聽力障礙等，因此TORCH檢測對於優生優育至關重要。風疹是由風疹病毒引起的。風疹在我國己列入法定報告的傳染病。80年代以來曰本、美國、印度、墨西哥、澳大利亞等均有較大的流行。孕婦屬易感人群，一旦感染便可發生子宮內感染致胎兒畸形及嚴重後遺症，流產及死產率較正常妊娠高2-4倍。妊娠早期感染者致畸率為50%，中期為25%，末期為15%。因此，早期妊娠婦女若確診為風疹病毒感染時應行人工流產終止妊娠。為避免孕早期受到風疹病毒感染，在孕前必須檢查風疹IgG抗體，若IgG抗體陽性則表示曾經感染過風疹病毒，並有終生免疫力，不會再受感染，可以懷孕。若IgG抗體陰性則表示無抵抗力，容易受到風疹病毒感染，因此必須立即注射風疹疫苗，使體內產生抗體，然後再懷孕即可避免本病。因孕婦為易感人群，因此婚前和孕前風疹IgG抗體的檢測至關重要，避免感染風疹造不必要的後果。當前檢測風疹IgG抗體的診斷技術有金標、ELISA、PCR等方法。金標試劑操作簡單，快速，但肉眼觀察有一定誤差，準確率低；PCR具有靈敏度極高的特點，直接檢測病原體基因，但操作繁瑣、需要先進的儀器設備和較高的費用，不適用於基層推廣；而ELISA檢測方法，具有靈敏度高、特異性強的特點，目前臨床應用比較普遍，但存在漏檢、假陽性等問題。上述診斷技術，均有其特定的優缺點。本發明利用化學發光免疫分析法，是一種較先進而有效的方法，其優點是把高靈敏的化學發光分析和特異性強的免疫分析方法相結合，是目前發展和推廣應用最快的免疫分析方法，也是目前最先進的標記免疫測定技術，主要具有靈敏度高、特異性強、試劑價格低廉、試劑穩定且有效期長、方法穩定快速、檢測範圍寬、操作簡單自動化程度高等優點。高靈敏度的化學發光檢測技術以被廣大研究人員所認可，並正逐漸替代傳統的生物檢測技術。另外，現有技術中的化學發光免疫分析試劑盒為封閉式全自動化學發光測量系統，需要昂貴的全自動化學發光測量儀，從而限制了推廣使用，無法廣泛地應用於臨床診斷和科研工作。本發明的試劑盒採用微孔板化學發光免疫分析技術，既可應用於開放式的半自動化學發光測量儀，也可用於全自動的測量系統，可實現大批量快檢測，使用成本低，更易推廣應用。
發明內容本發明目的在於克服現有技術的不足，將化學發光免疫分析技術與間接反應檢測法相結合，提供了一種能夠簡便、快速、靈敏、穩定地檢測風疹IgG抗體的試劑盒。另外目前臨床應用普遍的。ELISA試劑盒樣品稀釋比例一般為1:100或者1:1000，操作繁瑣，費時費力，而本試劑盒的樣品稀釋，採用l:IO稀釋，大大節約了時間與成本，操作更簡便，且能夠減少非特異反應，該試劑盒適於在產業上有效地推廣應用。本發明"風疹病毒IgG抗體化學發光免疫分析測定試劑盒"可以準確地檢測出病人血清中風疹IgG抗體，它具有簡便、快速、靈敏、穩定等優點，某些指標均優於酶聯免疫分析法。並且，本發明可使用的檢測系統為開放式操作，簡便快速，不需要昂貴的全自動化學發光測量儀，特別適合廣大的中小醫院推廣使用，為臨床診斷和科研工作提供一種非常有價值的檢測手段。本發明的目的是提供一種化學發光免疫分析測定風疹病毒IgG抗體的試劑盒及其製備方法。本發明的試劑盒包括陰、陽性對照，包被的風疹病毒抗原固相載體，樣品稀釋液，鹼性磷酸酶標記的抗人IgG單抗，化學發光底物以及濃縮洗漆液。根據本發明的試劑盒，其中，所述陰、陽性對照分別為正常人血清、風疹IgG抗體陽性血清經1%BSA的磷酸鹽緩衝液稀釋的溶液；所述固相載體為微孔板、塑料珠或塑料管；所述樣品稀釋液為含有0.1%BSA、0.1%甘油、0.1%吐溫-20、0.05%二巰基乙醇、0.l%Proclin300的0.02MpH為7.4的磷酸鹽緩衝液；所述化學發光底物l，2-二氧乙垸類衍生物為(金剛烷)-l，2-二氧乙烷、3-(2'-螺旋金剛垸)-4-甲氧基-4-(3"-磷醯氧基)苯基-1，2-二氧乙烷(AMPPD)、CSTO或CDP-Star。本發明還提供了一種製備上述試劑盒的方法1)配製陰、陽性對照；該陰性對照為正常人血清經1%BSA的磷酸鹽緩衝液稀釋的溶液，陽性對照為風疹IgG抗體陽性血清經1%BSA的磷酸鹽緩衝液稀釋的溶液。2)以風疹病毒抗原包被固相載體；所述固相載體為微孔板、塑料珠或塑料管，包被固相載體的步驟為將0.046MpH值為4.6的檸檬酸緩衝液與適當濃度的風疹病毒抗原混合，並將所得混合液負載於固相載體上，BSA封閉，抽溼乾燥後用鋁箔袋密封。3)配製樣品稀釋液；該樣品稀釋液為含有0.1%BSA、0.1%甘油、0.1%吐溫-20、0.05%二巰基乙醇、0.l%Proclin300的0.02MpH值為7.4的磷酸鹽緩衝液。4)以鹼性磷酸酶標記抗人IgG單抗，用戊二醛交聯發製備。5)配製化學發光底物；化學發光底物液為含2(m的AMPPD溶液；6)配製濃縮洗滌液；所述洗滌液為20倍濃縮的Tris-HCl緩衝液；7)分裝上述陰、陽性對照、樣品稀釋液、濃縮洗滌液、酶標記物和化學發光底物；以及8)組裝為成品。具體的上述試劑盒包括包被有抗原的化學發光微孔板48或96孔、樣品稀釋液1瓶、酶標記物1瓶、陰性和陽性對照各1瓶、化學發光底物液1瓶、濃縮洗漆液1瓶。根據本發明的試劑盒，試劑盒採用風疹病毒純化的抗原包被固相載體，繼而加入酶標記的抗人IgG單抗，再與化學發光底物作用，測值即與標本中的風疹病毒IgG抗體成正相關。該檢測方法有效地利用了化學發光技術原理，又具有反應逐層加大，因而極大的提高了檢測的特異性和靈敏性。另外，樣品稀釋後能夠減少非特異反應，本法較常規ELISA試劑盒樣品稀釋比例大大縮小，直接在微孔板內加稀釋液與樣品即可完成樣品的稀釋，極大地節約了時間與成本。具體實施例方式實施例1製備本發明的風疹病毒IgG抗體化學發光免疫分析測定試劑盒本發明的風疹病毒IgG抗體診斷試劑盒包括陰、陽性對照，包被的風疹病毒抗原固相載體，樣品稀釋液，濃縮洗滌液，鹼性磷酸酶標記的抗人IgG單抗，化學發光底物。本發明的發明人首先對所用的原材料進行了篩選試驗和質量鑑定，包括包被抗原、標記抗體、白色微孔板的吸附性能和變異大小、ALP的活性、化學發光底物的發光強度及發光持續時間等。然後對固相載體用不同的包被緩衝液和封閉液進行試驗，選擇出最適合的包被緩衝液和封閉液，通過不同包被濃度試驗找到最佳的濃度條件。對於ALP的標記可以有不同的方法，通過反覆探索和對比試驗最終找到了簡便、產率高、成本低、質量可靠的標記方法，並對樣品稀釋液和酶標記物使用的稀釋液進行了長期的考察試驗，配製出了能夠減少非特異反應、靈敏度高、特異性好且長期保持活性而穩定的稀釋液。一、風疹病毒抗原預包被化學微孔板的製備(1)包被將風疹病毒純化抗原加至0.046MpH值為4.6檸檬酸緩衝液中混勻製成包被液，每孔lOOuL加入微孔板各孔內，4'C過夜。具體地，所述包被方法為檸檬酸4.44g檸檬酸三鈉7.3g去離子水定容至1000mL，調pH至4.6加入純化的風疹病毒抗原製成濃度為1:500的包被液，每孔100uL加入微孔板各孔內，4'C過夜。(2)洗滌用生理鹽水洗三次，拍幹。(3)封閉每孔分別加入封閉液200uL，室溫放置3小時，甩掉封閉液，在吸水紙上拍幹。具體地，封閉液配製方法為NaH2P042H200.2gNa2HP0412H202.9gBSA10gProclin300lmL去離子水定容至1000mL，調ra至7.0室溫除溼乾燥1824小時。然後進行封袋。二、陰、陽性對照的製備混合的正常人血清經過濾除菌後，用含有1%BSA的磷酸鹽緩衝液稀釋為溶液配製成陰性對照；將風疹IgG抗體陽性血清經過濾除菌，滅活後，用含有1%BSA的磷酸鹽緩衝液按1:200稀釋，配製成陽性對照；三、樣品稀釋液的製備BSAlg甘油lmL吐溫-20lmL二巰基乙醇0.5mLProclin300lmL用0.02M的磷酸鹽緩衝液定容至1000mL，調PH至7.4四、濃縮洗滌液的製備Tris24gNaCl160gKC14gHC115mL去離子水定容至1000mL，調pH至7.4使用時用去離子水稀釋20倍。五、鹼性磷酸酶標記抗人IgG單抗的製備用戊二醛交聯法將抗人IgG單抗與鹼性磷酸酶偶聯在一起，對PBS充分透析，加等體積甘油，—20。C以下保存。使用時用含有1.2%Tris，0.5%BSA，0.l%Proclin300的稀釋液稀釋，濃度為1:1000。六、化學發光底物液的製備本發明所使用的鹼性磷酸酶(ALP)的化學發光底物液的配製方法Tris24gNaCl160gKC14gHC115mLAMPPD200mLProclin300lmL去離子水定容至1000mL，調pH值為8.09.0七、半成品及成品組成上述步驟所得產品分裝即為半成品。抽出三份經過特異性、精密性、靈敏度及穩定性檢定合格才能組裝成風疹病毒IgG抗體測定試劑盒(化學發光法)。組裝成試劑盒後還需抽檢合格後才能出廠。實施例23製備本發明的風疹病毒IgG抗體化學發光免疫分析測定試劑盒除分別以塑料珠、塑料管作為載體，其餘均以與實施例1相同的方法製備本發明的測定試劑盒。實施例4本發明的試劑盒的使用方法1)自4t:冰箱中取出試劑盒，室溫平衡15分鐘。2)將試劑盒提供的20倍濃縮洗滌液用去離子水20倍稀釋後，配製成應用洗滌液。3)取出包被板條，插入板架上。4)設陰性對照3孔，陽性對照2孔，每孔分別加入100uL。將樣品稀釋液加於孔內100uL，再將待測血清10uL加入樣品稀釋液中，每次實驗設空白l孔。用微量震蕩器充分振蕩混勻，貼上封板膜，置37'C溫育30分鐘；5)用全自動洗板機或手工洗板5次，每孔400uL，最後在乾淨的吸水紙上扣幹；6)除空白孔外，每孔加入酶標記物100uL，用微量震蕩器充分振蕩混勻，貼上封板膜，置37。C溫育30分鐘；7)洗板方法同5);8)每孔加化學發光底物液100uL，振蕩混勻，置室溫避光反應5分鐘。9)必須於加化學發光底物液後的第530分鐘內測量，在化學發光測量儀上依序測量各孔的發光強度(RLU)，測量時間1秒/孔。10)結果判定根據測定標本(S)的RLU值與臨界值(CUT-OFF)的比值確定。臨界值(CUT-OFF)=2.1X陰性對照孔平均RLU值。若S/C0值》1，則為陽性反應，說明樣本中含有風疹IgG抗體。若S/C0值〈1，則為陰性反應，說明樣本中不含有風疹IgG抗體。實施例5本發明的試劑盒與其類似物交叉反應本發明試劑盒對TORCH其他四項IgG抗體陽性血清66例進行檢測，其中CMV-IgG陽性血清21例、T0X-IgG陽性血清18例、HSVl-IgG陽性血清16例和HSV2-IgG陽性血清11例，檢測結果如下表l表l本發明的試劑盒交叉試驗的檢測結果tableseeoriginaldocumentpage11從表l檢測結果可以看出，本試劑盒與其類似物無交叉，有很強的特異性。實施例6本發明的試劑盒與ELISA試劑盒對血樣測值的比較本發明試劑盒與ELISA試劑盒同時檢測58例風疹IgG抗體陽性血清標本和532例風疹IgG抗體陰性血清標本，兩種試劑盒的檢測結果分別見下表2與3:表258例陽性血清標本的檢測結果tableseeoriginaldocumentpage11表3tableseeoriginaldocumentpage12從表2可以看出，本試劑盒對陽性血清的檢出率98.2%(57/58)，ELISA試劑盒對陽性血清的檢出率96.5%(56/58)，可以看出本發明試劑盒對陽性血清的檢出率高於ELISA試劑盒。從表3可以看出，本試劑盒對陰性血清的檢出率97.4%(518/532)，ELISA試劑盒對陰性血清的檢出率96.0%(511/532)，可以看出本發明試劑盒對陰性血清的檢出率高於ELISA試劑盒。結果顯示本試劑盒的檢測結果與臨床具有更高的符合率，更適用於臨床推廣應用，安全可靠。權利要求1.一種用於檢測風疹IgG抗體的化學發光免疫分析診斷試劑盒，其特徵在於，包括陰、陽性對照，包被有風疹病毒抗原的固相載體，樣品稀釋液，鹼性磷酸酶標記的抗人IgG的單抗，化學發光底物以及濃縮洗滌液。2、如權利要求1所述的試劑盒，其特徵在於，所述陰、陽性對照分別為正常人血清、風疹IgG抗體陽性血清經1%BSA的磷酸鹽緩衝液稀釋的溶液。3、如權利要求1所述的試劑盒，其特徵在於，所述固相載體為微孔板、塑料珠或塑料管。4、如權利要求1所述的試劑盒，其特徵在於，所述樣品稀釋液為含有0.1%BSA、0.1%甘油、0.1%吐溫-20、0.05%二巰基乙醇、0,l%Proclin300的0.02MpH值為7.4的磷酸鹽緩衝液。5、如權利要求1所述的試劑盒，其特徵在於，所述化學發光底物1,2-二氧乙烷類衍生物為(金剛烷)-1,2-二氧乙烷、3-(2'-螺旋金剛烷)-4-甲氧基-4-(3"-磷醯氧基)苯基-1，2-二氧乙烷(AMPPD)、CSPD或CDP-Star。6、一種製備權利要求1所述試劑盒的方法，其特徵在於包括以下步驟配製陰、陽性對照；以純化的風疹病毒抗原包被固相載體；配製樣品稀釋液；用鹼性磷酸酶標記抗人IgG的單抗；配製化學發光底物以及配製濃縮洗滌液；分裝上述陰、陽性對照、樣品稀釋液、濃縮洗滌液、酶標記物和該酶所作用的化學發光底物；以及組裝為成品。7、如權利要求6所述的方法，其特徵在於，所述陰、陽性對照分別為正常人血清、風疹IgG抗體陽性血清經1%BSA的磷酸鹽緩衝液稀釋的溶液。8、如權利要求6所述的方法，其特徵在於，所述包被固相載體採用以下方法將0.046MpH值為4.6的檸檬酸緩衝液與適當濃度的風疹病毒抗原混合，並將所得混合液負載於固相載體上，BSA封閉，抽溼乾燥後用鋁箔袋密封。9、如權利要求6所述的方法，其特徵在於，所述樣品稀釋液為含有0.1%BSA、0.1%甘油、0.1%吐溫-20、0.05%二巰基乙醇、0.l%Proclin300的0.02MpH值為7.4的磷酸鹽緩衝液。全文摘要一種用於檢測風疹IgG抗體的化學發光免疫分析診斷試劑盒，包括陰、陽性對照，包被有風疹病毒抗原的固相載體，樣品稀釋液，鹼性磷酸酶標記的抗人IgG的單抗，化學發光底物以及濃縮洗滌液。所述試劑盒的製備方法，包括以下步驟1)配製陰、陽性對照；2)包被固相載體；3)配製樣品稀釋液；4)以鹼性磷酸酶標記抗人IgG的單抗；5)配製化學發光底物；6)配製濃縮洗滌液；7)分裝上述陰、陽性對照、樣品稀釋液、酶標記物、化學發光底物及濃縮洗滌液；8)組裝為成品。採用本試劑盒及其製備方法，可以簡便、快速、靈敏、準確地檢測人血清中的風疹IgG抗體，且便於推廣應用。文檔編號G01N21/76GK101368959SQ20081010267公開日2009年2月18日申請日期2008年3月25日優先權日2008年3月25日發明者唐寶軍,宋勝利,應希堂,坤張,胡國茂,趙娟娟申請人:北京科美東雅生物技術有限公司