基因工程腺病毒及其用途的製作方法
2023-05-28 00:39:16 5
專利名稱：基因工程腺病毒及其用途的製作方法
技術領域：
本發明涉及基因工程腺病毒，它們能選擇性地在p53功能缺失的腫瘤細胞中大量複製並最終殺死腫瘤細胞，但它們並不能在正常細胞中複製。此外，本發明還涉及含有該基因工程腺病毒的藥物組合物以及該基因工程腺病毒在製備用於治療癌症的藥物組合物中的用途。
癌症是一種異源性疾病的總稱，其特徵為非正常細胞的無限生長和增殖。通常認為，正常細胞的增殖受兩種相互拮抗的基因的調節，即原癌基因和腫瘤抑制基因。原癌基因能促進細胞的生長，而腫瘤抑制基因則抑制細胞的生長。當基因發生突變，即原癌基因被激活或腫瘤抑制基因失活，均可加速腫瘤細胞的生長。通常腫瘤抑制基因(包括p53，RB基因)的失活和原癌基因的激活同時發生，其結果是產生無限增殖的腫瘤細胞。
儘管不同類型的基因變化都有可能導致細胞生長調節基因的功能發生變化，並產生非正常的細胞增殖。通常認為需要多種因素同時作用才能將正常細胞轉化成為腫瘤細胞。其精確的分子途徑和隨之發生的細胞變化導致細胞惡性增殖的機理尚未明了。但已有許多報導表明，細胞內的一些蛋白在細胞增殖周期的調控中起著重要作用，當它們的功能發生變化時，往往會導致細胞的惡性轉化，例如當p53基因產物失活時，會使細胞的生長失去控制。
儘管已經有了許多發現，但目前癌症的治療絕大部分仍用常規的治療方法，如放療和化療。這些方法的治療指數很低，而且副作用很大，常給病人帶來很多痛苦，甚至生命受到威脅，如骨髓的抑制等。
近年來，已經有科學家應用基因治療的方法來修正或補充人等位基因的缺陷，用於治療一些遺傳性疾病，但目前為止成功率較小。其主要採用的方法是將一段寡核苷酸序列轉導入人細胞中，以期表達正常的功能蛋白，糾正等位基因的缺陷或補償細胞的某種功能。應用的載體是複製缺陷型重組腺病毒。如將腫瘤壞死因子(TNF)和白介素II(IL-2)導入細胞內進行腫瘤治療。在美國專利7769623、WO9514101等中記載了用複製缺陷型腺病毒將特定基因傳遞到癌症患者的病灶，在所述病灶表達由所述基因編碼的特定抑制腫瘤的蛋白質以達到治療癌症的目的。在體外的試驗中，這種方法是成功的，但在體內，有效率大大降低。
這種基因治療的方法到目前為止，還不能有效地修復缺陷的原癌基因或腫瘤抑制基因。腫瘤自身的細胞生物學特性使得現今還沒有一種有效的方法能治療癌症，而且所有基因治療的方法都太昂貴，這也限制了它的應用。
腺病毒可以感染呼吸道、眼、胃腸道和膀胱，已經鑑定出47個血清型。根據其血凝作用特性、致瘤性、對培養細胞的轉化和G+C百分比，將人腺病毒分成7個亞型。
腺病毒的複製循環分為早期和晚期兩個階段，晚期是從病毒DNA複製開始的。感染後，腺病毒迅速關閉細胞中DNA和蛋白質的合成。其關閉機制尚不清楚，但細胞中的蛋白質合成迅速受到抑制，而細胞DNA合成則稍晚。在32-36小時的一個病毒循環中，每細胞產生104個病毒顆粒。
腺病毒基因組中有11個基因，其中E1A區在早期基因合成中是非常重要的。研究表明，E1A蛋白質可結合腫瘤抑制基因RB105(成視網膜細胞瘤105kd)，而E1B蛋白可結合P53腫瘤抑制蛋白。E1B本身不能轉化細胞，但與E1A一起可穩定地轉化細胞。E3區含有調節與宿主對感染反應有關的基因。
正常情況下，腺病毒主要在細胞內有效的複製，它的核酸序列的E1B區基因編碼合成P55蛋白，此蛋白能同宿主細胞中的P53蛋白結合，並使其失活從而阻止了細胞凋亡的發生，使病毒得以複製，這樣缺失了P53蛋白功能的細胞可任病毒大量複製。通過這種方式，野生型腺病毒可在具有功能性P53蛋白的正常細胞中大量複製。
美國專利5677178中公開了用重組腺病毒治療腫瘤的方法，方法所使用的是由腺病毒II型(Ad2)和腺病毒V型(Ad5)構建的重組嵌合病毒dl1520，由於這種重組病毒不是天然存在於哺乳動物中的腺病毒，因此，這種病毒在人體中的生存狀態以及潛在的可能突變和所引起的危害尚難以確定。此外，該方法所用的病毒還保留了1/9的E3區，而E3區有抑制人體免疫系統的作用，該區的部分保留已證明可使該病毒產生抗性，因而有可能在人體中長期存在。這樣由於病毒的返祖現象，或由於其它因素的影響，該重組腺病毒會回復成可在正常人體細胞中表達的野生型病毒，從而對人體產生不利影響。
由於複製缺陷型腺病毒的增殖是以特定的宿主，即腫瘤細胞為靶，因此當特定的靶組織消失後，要求破壞特定靶組織的所述複製缺陷型腺病毒也應隨之從受體內消失，以免使所述複製缺陷型腺病毒在體內產生不需要的突變並保留在體內，而對宿主產生不利影響。因此，這就要求用於破壞特定靶組織的複製缺陷型腺病毒有儘可能高的靶特異性，從而使其只能在特定的靶組織中生活。
為此，本發明人經過研究和試驗構建了一種新型的重組腺病毒，它來源於Ad5。由於Ad5型腺病毒是天然存在於哺乳動物中的，它同人類的相互關係已經研究的非常明確，而且將E3區基因全部去除。這樣，當此病毒在體內發揮藥效後，人體自身的免疫系統可將之清除，從而避免了存留於體內可能產生的危害。因此，此新型的重組腺病毒的安全性優於現有技術改進的重組複製缺陷型腺病毒。
本發明的目的是提供一種改進的重組複製缺陷型腺病毒，以及含有該病毒的藥物組合物，此外，本發明還提供選擇性殺死腫瘤細胞的方法。
本發明的另一目的是提供選擇性殺死腫瘤細胞的方法，該方法包括，在感染的條件下，將殺死腫瘤細胞有效量的E1B區p53缺陷的重組缺陷腺病毒與含有腫瘤細胞的細胞種群接觸，由此產生感染的細胞種群，所述病毒為E1B/E1a雙突變的病毒，並可進一步包含有一個與病毒啟動子相連的陰性選擇基因。
另一方面，本發明提供含有重組複製缺陷型腺病毒及可藥用載體的藥物組合物。
此外，本發明還提供了重組缺陷腺病毒在製備用於治療腫瘤的藥物組合物中的用途。
圖1.S98基因工程腺病毒圖譜。圖2.在正常細胞中，S98基因工程腺病毒的複製。圖3.S98-001的藥效學試驗。
本發明的複製缺陷型腺病毒為經過改造的Ad5。Ad5的基因組含有35935個核苷酸。Ad5與人類的關係十分清楚，有明顯的自愈性。在已將Ad5全序列用於人的臨床實驗中，從未發生過轉化正常人細胞的特性。
本發明構建的重組複製缺陷型腺病毒如圖1中所示的S98-001和S98-002。在S98-001中，在E1B區的2025核苷酸處加入了TGA終止密碼子，同時缺失了核苷酸2501-3328，同時缺失了包括核苷酸27865-30995的整個E3區。由於E1B編碼P55蛋白，所以上述缺失使得複製缺陷型腺病毒只能生產出缺陷型P55蛋白質，而所述缺陷型P55蛋白同p53基因產物的結合能力大大降低或與之不能結合。因此，所述缺陷型Ad5不能在含有正常p53基因產物的正常細胞中複製，而只能選擇性地在p53功能缺陷的腫瘤細胞中大量複製，最終通過所述腺病毒的大量複製而殺死腫瘤細胞。由於該腺病毒是p53缺陷型的，因此，當體內腫瘤細胞被基本上全部殺死後，這些腺病毒因不能在正常細胞中複製最終也會死亡。因此，這些複製缺陷型病毒對於正常細胞來講是安全的。E3區是與宿主免疫系統有關的區域，該區的存在有可能使腺病毒抵禦宿主免疫系統，因此在本發明中，完全缺失了E3區。此外，由於本發明的重組腺病毒完全缺失了E3區，從而進一步降低了該病毒進入人體後會給人體帶來危害的可能性。本發明的複製缺陷型腺病毒的特異性為每殺死100-1000個腫瘤細胞才會殺死一個正常細胞。
除以上55KD區的突變外，所述突變腺病毒也可能有P19蛋白功能的缺失，它能增強細胞的病變效應，其相應的基因是p19cyt突變基因。但是，也有很多的突變保持了功能性p19基因，這是為了保持病毒DNA在感染細胞的過程中的完整性。
本發明所用的另一重組複製缺陷型腺病毒是S98-002，該病毒缺失了55kD內的核苷酸2501-3328以及包括核苷酸27865-30995的整個E3區。其目的也是為了提高所述複製缺陷型腺病毒的特異性和殺傷力，使所述病毒通過常規的給藥途徑和給藥形式，到達特定的靶區，選擇性地殺死腫瘤細胞，在腫瘤細胞被全部殺死後，所述病毒也因失去賴以複製的環境而隨之死亡。
本發明的重組複製缺陷型腺病毒可通過常規給藥途徑，如靜脈內給藥。給藥劑量為109PFU-1012PFU/患者，優選109PFU-1010PFU/個體。
實施例實施例1.質粒的構建pXC-1和pBHG11購於Microbix Biosystems，PXC-1含有人腺病毒5型(Ad5)基因序列，從bp22到5790。pBHG11含有Ad5基因序列，上有兩處缺失E1區的缺失，從bp188到1339，即用於形成病毒DNA殼蛋白的包裝信號，和E3區的缺失，從bp27,865到30,995。pBHG11的DNA不具有感染性，但pXC-1和pBHG11的共轉染能通過同源重組產生具有感染性的病毒。
為了構建pXC-1上Ad5從bp1338到2501DNA片斷的亞克隆，應用以下二個合成的寡核苷酸片斷，從pXC-1上擴增出PCR產物，引物如下HZ1(5』-CTATCCTGAGACGCCCGAC-3』)和HZ2(5』-GATCGGATCCAGGTCTCCAGTAAGTGGTAGCTGC-3』)(下標線處為BglII位點)並將它克隆到pGEM-T載體上(Promega)，產生HZ102。為了構建HZ103，以Xbal和BglII消化HZ102，得到的片斷和以同樣的方法進行切割的pXC-1進行連接。
為了在pXC-1 bp2025處構建一個終止位點，兩個寡核苷酸鏈HZ3(5』-AAAGGATAAATGGAGTAAAGAAACC-3』)HZ4(5』-CAGATGGGTTTCTTCACTCCATTTATCC-3』)被用於基因突變的過程，採用QuickChange(Strategene)，並產生質粒HZ104，以測序的方法檢測改變的序列。為了構建HZ105，用BglII和Xbal消化HZ104，釋放的片斷，同以相同的方法切割的pXC-1連接。
S98病毒的產生是通過二個重疊的質粒DNA，以同源重組的方法得到。挑選得到的噬斑，並在HYH細胞中擴增。病毒DNA從Qiagen血液試劑盒得到，用PCR和Southern-Blot法分析。
S98-001的產生是HZ105 DNA同pBHG11 DNA共轉染得到的。同樣，S98-002和S98-100是以pBHG11和HZ103 DNA或pXC-1 DNA共轉染得到的。
S98-100是S98野生型腺病毒，它含有E3區的缺失，從圖距77.5mu到86.2mu(見圖1)。它可用做陽性對照，來檢測S98病毒的特異性和殺傷力。
S98-001是腺病毒在E1B區發生一突變，此突變是缺失了一段合成495R蛋白(55KD)的核酸序列，以及同495R相關的合成mRNA-13s，14s和14.5s的序列，但並未影響其175R(19KD)蛋白的結構。S98-002是另一個Ad突變株，同S98-001類似，除了它仍具有合成mRNA-13s，14s和14.5s的序列。無論是S98-001還是S98-002，都能產生具有功能性的E1B 19KD蛋白，即仍可抑制細胞的凋亡。
S98病毒的結構是通過PCR，測序和Southern法進行確證。我們假設基因工程S98腺病毒，當它不表達E1B 55KD蛋白，它應該在正常細胞內無法複製，但可以在p53缺陷型細胞中大量複製。
實施例2.用噬斑法進行體外檢測首先採用噬斑法在p53缺陷型細胞中檢測這類病毒的生長能力，即定量檢測特定病毒感染某一細胞株的能力。噬斑法應用以下的細胞株卵巢癌細胞株(OVCAR-3，p53突變株)，肝癌細胞株(Hep3B，p53突變株)成噬質細胞瘤癌細胞株(U373，p53突變株)，結腸癌細胞株(SW620，p53突變株和RKO，p53正常株)，乳腺正常細胞(HBL-100，p53正常株)。因為HYH細胞表達E1A和E1B蛋白，S98病毒能對這些細胞株有效的形成噬斑。
表1顯示了被測病毒的複製樣本的平均百分比。對於所有的細胞系，將一個特定的病毒的滴度同它對HYH細胞的滴度進行標準化，這樣病毒和相應細胞系之間具有可比性。當某一細胞系的滴度同HYH細胞系的滴度均為標準化時，重組病毒的數量即可同S98-100，即野生型腺病毒具有可比性。S98基因工程病毒同野生型腺病毒的比率可用來評估病毒複製的有效性，以及對腫瘤細胞的特異性。例如，當比率小於100，表明被測病毒形成噬斑的能力小於野生型腺病毒。相反，當比率大於100時，則表明此病毒形成噬斑的能力比野生型腺病毒形成噬斑的能力更強。
從此噬斑檢測中，可觀察到首先，S98-001和S98-002在p53缺陷的細胞中有明顯的複製優勢。例如S98-001和S98-002同S98-100相比，能更有效的誘導p53缺陷細胞發生病變，Hep3B，卵巢癌細胞，結腸癌細胞。其次，S98-001和S98-002在p53功能正常的癌細胞和正常的人細胞中，發生病毒複製並導致細胞裂解的數目很少，其形成噬斑的數量呈數量級的減少。例如，在p53功能正常的結腸癌細胞RPO中，S98-001和S98-002比S98-100產生的噬斑數量，分別少470倍和250倍。在人正常的乳腺癌細胞中也取得了類似的結果。而S98-100在HBL-100細胞中形成噬斑的能力比S98-001和S98-002分別超出3000倍和1000倍。因此，基因工程腺病毒介導的細胞裂解，相對野生型腺病毒而言，在p53功能正常的細胞中呈數量級的減少。
該實驗表明，S98-001和S98-002在p53功能正常的細胞中(即HBL-100和RPO)形成的噬斑數明顯少於在p53功能缺陷的癌細胞中(即OVCAR-3，Hep3B，U373，SW620)形成的噬斑數。表1 噬斑法表示S98基因工程腺病毒在p53缺陷的人腫瘤細胞中的選擇性複製
注1.OVCAR-3是p53缺陷型的卵巢癌細胞系2.Hep3B是p53缺陷型的肝癌細胞系3.U373是p53缺陷型的神經膠質瘤細胞系4.SW620是p53缺陷型的結腸癌細胞系5.RKO是p53功能正常的結腸癌細胞系6.HBL-100是p53功能正常的正常乳腺細胞實施例3.體外細胞試驗第2個實驗是觀察不同病毒複製的特點和細胞產生的病變。其實驗過程如下所述。以逐漸遞增的病毒感染量來感染細胞，並監測細胞發生的病變。當觀察到MOI為0.01時，野生型腺病毒可使培養的單層細胞完全裂解，此即為實驗的終點。選擇人微管內皮細胞(hMVEC，來源於人肺)，一種原代不可再生的細胞，在體外檢測它對S98基因工程病毒和野生型腺病毒的敏感性。
結果表明，當S98-100在MOI為0.01時，10天內可使培養的單層細胞完全裂解。相反，S98-002感染的正常單層細胞，在相同的時間點，MOI分別為10，1.0，0.1和0.01時，沒有呈現明顯的細胞病變。只有當MOI比野生型腺病毒大100倍和1000倍時，才能觀察到相應的細胞病變的現象。因此，S98基因工程腺病毒同野生型腺病毒相比，對人正常細胞造成的細胞病變大大減少。
實施例4.細胞融合實驗為了確定病毒的複製是否同S98基因工程腺病毒在p53缺陷的細胞和正常細胞中，產生的細胞病變相關，我們在p53缺陷的細胞和正常細胞中以不同的病毒滴度進行實驗，所選細胞為hMVEC。當細胞生長至70％-90％融合時，分別以野生型腺病毒S98-001和S98-002感染90分鐘，MOI為10。感染48小時後，將細胞三次凍融，釋放出病毒。上清用HYH細胞滴定。將S98-001和S98-002在48小時感染細胞後產生的病毒數，同野生型腺病毒在同樣的細胞株和同樣的細胞周期內產生的病毒數進行標準化計算。結果列於圖3。
試驗表明，對正常細胞，S98基因工程病毒同野生型相比，病毒的滴度小於100倍。而對OVCAR-3細胞系，S98-001和S98-002是S98-100的病毒滴度的30％。這再一次證明，S98基因工程腺病毒在人正常細胞中的複製量很少。
實施例5.動物實驗首先將C33A細胞(人宮頸癌，p53缺陷型)、A549細胞(人胃癌，p53正常型)皮下注射到雌性無胸腺的裸鼠體內，當腫瘤體積大於200μl時，直接將S98-001/S98-002注射到腫瘤組織中，以S98-100為陽性對照，10％甘油的PBS溶液作為陰性對照。每種病毒分別接種各10個C33A和A549腫瘤。病毒的注射劑量分別為108PFU/mm3，107PFU/mm3，106PFU/mm3，105PFU/mm3，連續注射，共注射6天。每周記錄一次腫瘤的生長情況，連續記錄6周，結果列於表2。
表2 S98-001動物藥效學試驗數據(n＝10)
注1.表中1-4組所用的病毒的注射劑量分別為109顆粒數/mm3，108顆粒數/mm3，107顆粒數/mm3，106顆粒數/mm3。
2*以給藥後當天的瘤體積為100。
結果表明，S98-001接種到C33A裸鼠身上後，1周後即觀察到腫瘤體積減小，這種趨勢一直得到保持，5周後愈加明顯，到第6周後，腫瘤體積以縮減到原體積的1/3，即縮小了近70％，其中有一個腫瘤完全消失。在停止給藥後，腫瘤體積仍在不斷縮小。而在陰性對照組中，在給藥後，腫瘤體積持續增大，6周後，是原腫瘤體積的近4倍。因此，同陰性對照組相比，S98-001給藥組的腫瘤體積縮小了10倍以上。對於A549裸鼠，在6周後，S98-001給藥組同陰性對照組的腫瘤體積差別很小，均持續增大，最後直至潰破。對於S98-100，在同樣的劑量下，無論何種腫瘤模型均可使腫瘤體積明顯縮小，其程度大於S98-001(94％)。從而證實了S98-001可選擇性地殺死p53缺陷型腫瘤細胞。
本發明的基因工程腺病毒可經本領域的常規技術進行純化，純化後的基因工程腺病毒可用本領域常用的可藥用載體(如緩衝液等)製成常規的製劑形式如凍幹製劑、混懸液等進行使用。
本發明的方法也適用於製備其他重組病毒，如人乳頭瘤病毒，SV40，它們都缺少能同P53蛋白相結合併使之失活的相應的病毒蛋白。如人乳頭瘤病毒突變株不能編碼正常的E6蛋白，此蛋白即能同P53蛋白結合，因此它能在p53缺陷的腫瘤細胞中大量複製，並最終殺死腫瘤細胞。相應的，在正常細胞中，它不能進行複製。
本發明還包括給腫瘤病人用藥的一系列步驟，即以此重組病毒給特定類型的p53缺陷的腫瘤病人用藥。
儘管上文以實施例詳細描述了本發明，但本領域專業人員應當理解，可對本發明進行任何改變而不偏離本發明的範圍。
權利要求
1.一種重組的複製缺陷型腺病毒，其特徵在於該病毒不能表達可與細胞內功能性p53腫瘤抑制基因產物結合的蛋白並缺失了E3區。
2.權利要求1所述的重組複製缺陷型腺病毒，其中所述病毒不能編碼E1B P55多肽。
3.權利要求1或2所述的重組複製缺陷型腺病毒，所述病毒為S98-001(保藏號CCTCC-V98003)和S98-002。
4.權利要求1所述的重組複製缺陷型腺病毒，其中所述病毒可在p53缺陷的腫瘤細胞中大量複製，形成感染性的病毒顆粒。
5.藥物組合物，該組合物含有殺死腫瘤細胞有效量的權利要求1-4中任意一項所述的重組複製缺陷型腺病毒及可藥用載體。
6.選擇性殺死腫瘤細胞的方法，該方法包括，在感染的條件下，將殺死腫瘤細胞有效量的權利要求1-4中任意一項所述的重組複製缺陷型腺病毒與含有腫瘤細胞的細胞種群接觸，由此產生感染的細胞種群。
7.根據權利要求6的方法，其中所述腫瘤細胞為p53基因缺陷型。
8.選擇性殺死腫瘤細胞的方法，該方法包括，在感染的條件下，將殺死腫瘤細胞有效量的E1B區p53缺陷的重組缺陷腺病毒與含有腫瘤細胞的細胞種群接觸，由此產生感染的細胞種群，所述病毒為E1B/E1a雙突變的病毒，並可進一步包含有一個與病毒啟動子相連的陰性選擇基因。
9.權利要求1-4中任意一項所述的重組缺陷腺病毒在製備用於治療腫瘤的藥物組合物中的用途。
全文摘要
本發明構建了兩種基因工程腺病毒,它們能選擇性地在p53功能缺失的人腫瘤細胞中大量複製,並最終殺死腫瘤細胞。同時,它們並不能在正常細胞中複製。其抗腫瘤的療效是通過檢測小鼠身上的人腫瘤移植模型進行確證。試驗數據表明,此工程腺病毒可用於治療特定的腫瘤模型。
文檔編號A61K45/00GK1241632SQ98103219
公開日2000年1月19日 申請日期1998年7月15日 優先權日1998年7月15日
發明者張暉 申請人:杭州賽獅生物技術開發有限公司