糖肽抗生素的製備方法

2023-05-28 00:26:06

專利名稱:糖肽抗生素的製備方法
本發明涉及萬古黴素族中一類新型的糖肽抗生素，尤其是抗生素A82846，及其個別的組份A82846A，A82846B，A82846C，以及通過微生物新菌株的培養來製備該類抗生素的方法。
雖然在今天去獲得許多有用抗生素已不成問題，但是為人類醫藥事業而尋找更有效的抗生素仍有必要。例如萬古黴素就是一個十分成功且商品化了的抗生素，它已拯救了無數的生命，但是萬古黴素也存在一些問題，例如它可以引起耳毒性和腎毒性。於是迫切需要尋找一種具有像萬古黴素那樣的活性，但其藥效有所改善或者副作用較小的抗生素。
依照本發明業已發現具有很大價值的糖肽抗生素可以通過東方諾卡氏菌NRRL 18098，NRRL 18099或NRRL 18100在液面下進行需氧發酵來生產，培養基含有可吸收的碳，氮氣和無機鹽源。我們已經任意地設計了一些象A82846的糖肽抗生素及其組分。
抗生素A82846在結構上同萬古黴素相似，但其體內、體外抗革蘭氏陽性菌的活性有所改進。此外，由於它比萬古黴素具有更長的半壽期，因此它的藥效學也得到改進。
A82846組份應具有如下必要的物理和光譜性質A82846A的特性分子量1556實驗式C73H89N10O26Cl快原子轟擊一質譜(FAB-MS)(硫甘油)(M+1)實驗值1557.5803;計算值C70H90N10O26Cl＝1557.5716(見圖4)
紫外光譜(H2O)λmax281nm(ε5，052)，加鹼後移至300nm紅外光譜(KBr)1716，1655，1611，1586，1552，1504，1410，1340，1310，1230，1212，1132，1066，1028和1015cm(見圖1)核磁共振〔(CD3)2SO〕見圖7pKa(H2O)4.7，9.5(66%DMF)5.5，6.8，7.9，9.4，12.3(表觀分子量1542)A82846B的特性分子量1590實驗式C73H88N10O26Cl2快原子轟擊-質譜(硫甘油)(M+1)實驗值1591.5315;計算值C73H89N10O26Cl2＝1591.5327(見圖5)紫外光譜(HO)λmax280nm(ε5，192)，加鹼後移至300nm紅外光譜(KBr)1656，1586，1562，1504，1403，1264，1230，1135，1105，1065，1023和1018cm-1(見圖2)核磁共振〔(CD3)2SO〕見圖8pKa(H2O)4.65，9.5A82846C的特性分子量1522實驗式C73H90N10O26快原子轟擊-質譜(硫甘油)(M+Na)實驗值1545.5998;計算值C73H90N10O26Na＝1545.5925(見圖6)紫外光譜(H2O)λmax280nm(ε5，198)，加鹼後移至300nm紅外光譜(KBr)3600 3004(寬峰)，2999，2991，2950，1687 1650(寬峰)，1585，1570，1509，1503，1453，1449，1402，1212，1130，1102，1060，1032和1014cm-1(見圖3)
核磁共振〔(CD3)2SO〕見圖9pKa(H2O)4.6，9.4經用6NHCl水解後，A82846A，A82846B，和A82846C的胺基酸分析表明，存在天冬氨酸和兩個寬峰及痕量的甘氨酸。這兩個峰代表類放線菌素的和萬古黴素的胺基酸，兩者均存在於萬古黴素類的糖肽中。
核磁共振比較研究指出，A82846A，A82846B，A82846C均含有這樣一個新的氨基糖-4-素-萬古胺(3-methyl-acosamine)
A82846A的分子式相當於萬古黴素的分子式(C66H75N9O24Cl2)減去一個Cl原子，再加上另外的萬古胺類型(C7H14NO2)的氨基糖的成分。
A82846B的分子式相當於A82846A，其中一個氫原子被一個氯原子所取代。
A82846C的分子式相當於A82846A，其中一個氯原子已被一個氫原子取代。
A82846組份看來構成了一個新的糖肽族，在總體組成上，它同萬古黴素分子相似，其不同點主要在於氯的含量和另外的，具有萬古胺組成的亞單位的存在。
A82846組份看來具有下列結構式
A82846AX＝H Y＝ClA82846BX＝Cl Y＝ClA82846CX＝H Y＝H存在於A82846化合物中的糖基的絕對構型尚未被測定。A82846以及它的個別的組份A82846A，A82846B，A82846C可以通過反應形成各種鹽類。抗生素的所有這些形式作為本發明的一個組成部分。A82846的鹽類是很有用的，例如，用來分離和純化A82846。另外，這些鹽可以使水溶解度得到改善。
A82846的鹽類是通過標準的鹽類製備方法製得。例如，A82846可用一個合適的酸中和形成一個酸加成鹽。
酸加成鹽是特別有用的。具有代表性的鹽類包括與下列有機和無機酸進行標準反應而生成的鹽類，例如，硫酸，鹽酸，磷酸，乙酸，琥珀酸，檸檬酸，乳酸，蘋果酸，富馬酸，膽酸，巴莫酸(pamoic acid)，粘酸，D-穀氨酸，d-樟腦酸，戊二酸，乙二酸，苯二甲酸，酒石酸，甲酸，月桂酸，硬脂酸，水楊酸，甲磺酸，苯磺酸，山梨酸，苦味酸，苯甲酸，肉桂酸以及類似的酸。
適合於藥用的酸加成鹽，尤其是本發明優選的鹽類。
抗生素A82846可以用以下方法來生產，在液面下及需氧條件下，於一個合適的培養基中，對能產生A82846的東方諾卡氏菌(Nocardia orientalis)的菌株進行培養，直到有真實的抗菌活性產生。應用各種技術上熟悉的分離和純化方法步驟，可將抗生素回收。
本發明也涉及一種微生物的經生物學純化的培養物，上述微生物是從東方諾卡氏菌NRRL 18098，東方諾卡氏菌NRRL 18098，東方諾卡氏菌NRRL 18100或者是從能產生A82846的突變體、變異體或重組體中篩選出來的。這些微生物很有用，因為它們可以產生抗生素A82846。為了方便起見，在以下的討論中，將NRRL 18098菌株指定為培養物A82846，將NRRL 18099菌株指定為培養物A82846.1，將NRRL 18100菌株指定為培養物A82846.2。培養物A82846從Haiti土壤樣品中分離出來。培養物A82846.1是通過化學誘變作用從培養物A82846獲得，培養物A82846.2是一個分離自培養物A82846的天然的變異體。
培養物A82846，A82846.1，A82846.2於1986年8月8日被存放於美國農業部中西部北區研究中心的農業研究部(伊利諾斯州，61604，裴奧利亞，北方大學街1815號)，並作為該機構貯備培養物標本的一部分。公眾可按這些培養物的登記號，如NRRL 18098(A82846，親本菌株)，NRRL 18099(A82846.1，突變菌株)，NRRL 18100(A82846.2變異菌株)獲得它們。
Lilly研究實驗室的Frederick P.Mertz對培養物A82846，A82846.1，A82846.2進行了分類學研究。基於這些研究，這些新的微生物被劃歸為東方諾卡氏菌族(Pittenger和Brigham，1956)。Pridham和Lyons 1969，菌株類型ATCC 19795〔R.C.Pillenger和R.B.Brigham，「東方鏈黴菌種(Streptomyces orientalis n.sp.，萬古黴素的來源」，Antibiotics and chemotherapy 6，642-647(1956)〕。這一分類結果基於已發表的直接的實驗室比較和檢查報告〔《Bergey氏的細菌學測定手冊》，第八版，R.E.Buchanan和N.E.Gibbons編，Williams和Wilkins公司，巴爾的摩(美國)，1974;M.Goodfellow和K.P.Schaal，「諾卡氏菌(Nocardia)，馬杜拉放線菌(Actinomadura)和紅球菌(Rhodococcus)的鑑定方法」，於《微生物學家用鑑定方法》，第二版，F.A.Skinner和D.W.LoveLock編，應用細菌學技術協會，系列No.14，Academic Press，Inc.，紐約(美國)，1979，第261頁;R.E.Gordon，D.A.Barnett，J.E.Handerhan和C.H.Pang，「空腔諾卡氏菌(Nocardia coeliaca)，自營養東方諾卡氏菌和諾卡氏菌株，」Int.J.Syst.Bacteriol.24(1)，54-63(1974);R.E.Gordon，S.K.Mishra和D.A.Barnett，「某些另碎的諾卡氏菌屬肉色諾卡氏菌(N.carnea)越桔諾卡氏菌(N.vaccinii)，南非諾卡氏菌(N.transval-ensis)，東方諾卡氏菌和氣生菌落諾卡氏菌(N.aerocolonigenes)」，J.Gen.Microbiol.109，69-78(1978);S.J.Mishra，R.E.Gordon和D.A.Barnett，「具有醫學重要性的諾卡氏菌和鏈黴菌的鑑定」，J.Clin.Microbiot.11(6)，728-736(1980);H.Mordarska和M.Mordarski，「某些諾卡氏菌的化學分類學性質和分類」，J.Gen.Microbiology 71，77-86(1972);及R.Shinobu和M.Kawato，「關於氣生菌落鏈黴菌nov.sp.(Streptomyces aerocolonigenes nov.sp.)，在氣生菌絲體上形成第二菌落」，Bot.Mag.Tokyo 73，213-216(1960)〕。
使用的方法以下所使用的方法由國際鏈黴菌項目(ISP)所推薦，用來表示鏈黴菌種的特性〔E.B.Shirling和D.Gottlieb，「表示鏈黴菌種特性的方法」，Int.J.Syst.Bacteriol.16313-340(1966)〕，並且推薦了Gordon，Barnett，Handerhan和Pang等人的表示諾卡氏菌種的方法，文獻見上。
用光學顯微鏡進行了形態學研究。電子掃描顯微鏡(SEM)用於對芽孢表面裝飾進行研究。
對利福平和溶菌酶的抵抗性可以通過Gordon推薦的方法測定〔R.E.Gordon和D.A.Barnett，「以對利被平及某些分枝桿菌(Mycobacterium)種及諾卡氏菌種菌株的溶菌酶的抵抗性作為分類學工具」，Int.J.Syst.Bacteriol.27(3)，176-178(1977)〕。
ISCC-NBS矩心顏色表，標準樣品No.2106(國家標準局，1958，美國商業部，哥倫比亞特區，華盛頓)以及《顏色調和手冊》第四版(美國貨櫃公司，伊利諾斯州，芝加哥，1958)兩份材料用來確定顏色的名稱。
類黑素色素製作(生色性)用ISP NO.1(胰化腖酵母提取物液體培養基)，ISP NO.6(腖-酵母提取物鐵瓊脂)和ISP NO.7(酪氨酸瓊脂)等培養基測定。
整個細胞水解產物中的二氨基庚二酸(DAP)的異構體和碳水化合物Becker等建立的色譜法〔B.Becker，M.P.Lechevalier，R.E.Gordon和H.A.Lechevalier，「用全細胞水解產物的紙色譜法快速區分諾卡氏菌屬和鏈黴菌屬」，Appl.Microbiol.12，421-423(1964)〕，以及Lechevalier的色譜法〔M.P.Lechevalier，「具有臨床重要性的需氧放線菌的鑑定」，J.Lab.Clin.Med.71，934-944(1968)〕證實。
黴菌酸的測定方法基於Minnikin描述的技術〔D.E.Minnikin，I.G.Hutchinson和A.B.Caldicott，「含有細菌的黴菌酸的甲醇解產物的薄層色譜法」，J.Chromatography 188，221-233(1980)〕。
磷酸酯酶及脲酶用Blazevic描述的方法測定(D.J.Blazevic和G.M.Ederer，《診斷微生物學中生化試驗原理》，John Wiley和Sons，Inc.，紐約，1975，第136頁)。明膠液化作用用來測定蛋白酶活性。
對抗生素的抗性的測量，可通過填塞抗生素靈敏度圓盤，到經過接種的ISP NO.2瓊脂平皿上的方法。
澱粉水解的測定可以在ISP NO.4(無機鹽澱粉)瓊脂平皿上，用碘測試澱粉的存在(見上述Blazevic和Ederer的文獻)。
馬尿酸鹽的水解可用Bacto鑑別圓盤，它可快速檢測馬尿酸鹽的水解。
培養的特性培養物A82846和A82846.2在所有使用過的複合的和指定的培養基上生長均良好。這些培養物在大多數培養基上產生氣生菌絲體。氣生芽孢群的顏色是白色或灰色的，取決於所用的培養基。在許多培養基上均產生一種明顯的，棕色的可溶性顏料;其背面呈棕色到淺黃白色。
培養物A82846.1在所有使用過的培養基上也能生長，但其比起親株來不夠豐富。A82846.1難得產生氣生菌絲體，如果存在，顏色是白的。在少數培養基上，偶爾出現不明顯的淺棕色的可溶性顏料;其背面的顏色由棕色到淺黃白色。
培養物A82846，A82846.1和A82846.2的培養特性總結於表Ⅰ中。培養物A82846和A82846.2非常相似，其差別僅在於少數培養的性質。由於它們的相似性，也因為A82846.2是A82846天然的變異體，所以不必再作進一步的比較了。
表ⅠA82846，A82846.1及A82846.2在各種培養基上的培養特性a，b
aG＝生長;R＝背面;Am＝氣生菌絲體;Sp＝可溶性色素。
b於30℃下培養21天形態學特性培養物A82846，A82846.1和A82846.2產生一大批基底菌絲體。氣生菌絲形成外觀像蜘蛛網狀的分生孢子的長鏈，在Bergey氏細菌學測定手冊中，被歸類為非鏈黴菌的特徵。
在所有的培養基中，芽孢表面裝飾是光滑的。芽孢呈圓柱狀，其大小範圍為，A828461.2～1.3×0.4～0.5μm，A82846.11.4～2.2×0.3～0.4μm。
當在液面下，且在振搖條件下生長時，A82846顯示出最小碎裂，A82846.1大幅度地碎裂，A82846.2顯示出中等程度的碎裂。
生理學特性培養物A82846和A82846.1兩者均自以下物質產生酸阿糖，纖維素二糖，葡聚糖果糖，半乳糖，葡萄糖，α-甲基-D-糖苷，甘油，肌醇，乳糖，麥芽糖，甘露糖醇，甘露糖，蜜二糖，鼠李糖，核糖，蔗糖，海藻糖和木糖，但是均不從下列物質中產生酸阿東糖醇，纖維素，半乳糖醇，赤蘚糖，菊粉，山梨醇和木糖醇。A82846也可從乙醇，糖原，松三糖，棉子糖和水楊苷中產生酸，但A82846.1卻不能。兩種培養物均可使用乙酸鹽，檸檬酸鹽，乳酸鹽，蘋果酸鹽，草酸鹽，丙酸鹽，丙酮酸鹽和琥珀酸鹽，但不用苯甲酸鹽，粘酸鹽和酒石酸鹽。培養物A82846.1可使用丁酸鹽，但A82846則不用。
A82846和A82846.1可分解酪蛋白，次黃嘌呤，酪氨酸，尿素和DNA，但不分解腺瞟呤，蘋果酸鈣或黃嘌呤。兩種培養物均可水解澱粉，但不能水解七葉苷或馬尿酸鹽，還原硝酸鹽及液化明膠，它們可於50℃存活8小時，並產生催化酶H2S及磷酸酯酶。
培養物A82846和A82846.1具有同樣的抵抗抗生素的性質。它們可以抵抗桿菌肽(10個單位)，頭孢菌素Ⅰ(30μg)，艮他黴素(10μg)，林肯黴素(2μg)竹桃黴素(15μg)，青黴素G(10個單位)，鏈黴素(10μg)，萬古黴素(30μg)，託普黴素(10μg)，紅黴素(15μg)，萘啶酮酸(30μg)，多粘菌素B(300個單位，三甲氧苄二氨嘧啶(5μg)和磺胺嘧啶(300μg)，並對以下抗生素敏感新黴素(30μg)，利福平(5μg)，四環素(30μg)，氯黴素(30μg)，新生黴素(30μg)，扃桃胺(3μg)。
A82846和A82846.1均可使革蘭氏陽性菌染色，但不能使耐酸菌染色。A82846可產生類黑素色素，而A82846.1則不能。
細胞壁分析水解後的A82846全細胞含有二氨基庚二酸的內消旋異構體，以及阿糖和半乳糖。根據Becker等人的工作(見上)，培養物具有Ⅳ型細胞壁。糖的形式是A型(Lechavalier，見上)。培養物不產生黴菌酸(LCN-A)。
A82846菌株的特性有關A82846菌株的化學分類及其一般培養特性與對諾卡氏菌屬Trevisan 1889的陳述是一致的〔V.B.D.Skerman，V.McGowan和P.H.A.Sneath編《經批准細菌名稱一覽表》，Int.J.Syst.Bacteriol.30，225-420(1980)〕。
Gordon，Mishra和Barnett等人(見上)發表了從十四種諾卡氏菌種的性質中，計算得到相似係數，其中5種菌株來源自Lilly培養物標本收集。並使用了Jaccard係數〔參見P.H.A.Sneath，」計算機應用於分類學」，J.Gen.Microbiol.17，201(1957)〕和簡單匹配係數〔參見R.R.Sokal和C.D.Michener，「評價系統關係的統計方法」，Kan Uinv.Sci.Bull.38，1409(1958)〕。這些比較結果總結於表Ⅱ。
表Ⅱ A82846及其它19種諾卡氏菌種的相似係數相似係數培養物 Ssm SjA82846 100 100氣生菌落諾卡氏菌 84 76氣生菌落諾卡氏菌(A42125)＊ 83 78東方諾卡氏菌(M43-05865) 78 72東方諾卡氏菌(A51568.1) 78 72東方諾卡氏菌 75 68東方諾卡氏菌(M5-18215) 73 66東方諾卡氏菌(M5-18260) 73 66馬杜拉諾卡氏菌(N，madurae) 73 63希蘇他諾卡氏菌(N.hirsuta) 62 60自營養諾卡氏菌(N.autotrophica) 62 53
達松維爾諾卡氏菌(N.dassonvillei) 62 50阿瑪諾卡氏菌(N.Amarae) 62 46巴西諾卡氏菌(N.brasiliensis) 56 43越桔諾卡氏菌 56 43南非諾卡氏菌 48 38豚鼠諾卡氏菌(N.caviae) 48 32白樂傑諾卡氏菌(N.pelletieri) 48 24星狀諾卡氏菌(N.asteroides) 46 23肉色諾卡氏菌 43 25＊括號內的數字表示來源自Lilly培養物標本的菌株。
因為馬杜拉諾卡氏菌轉變到了馬杜拉放線菌屬，故不予考慮。氣生菌落諾卡氏菌和東方諾卡氏菌兩個種具有較好的相似係數。同時也對A82846和上述兩菌種作了實驗比較。表Ⅲ給出了比較結果。
表Ⅲ A82846和東方諾卡氏菌及氣生菌落諾卡氏菌的性質比較培養物a性質 82846 東方諾卡氏菌 氣生菌落諾卡氏菌產生氣生菌絲 + + +氣生顏色為白色 + + +產生分生孢子 + + +芽孢表面光滑 + + +芽孢呈圓柱狀 + + -產生可溶性色素 + - -革蘭氏染色陽性 + + +染色後耐酸 - - -顯示碎裂 + + +產生催化酶 + + +
水解七葉苷 - + +馬尿酸鹽 - - -澱粉 + + +蘋果酸鈣 - + +還原硝酸鹽 + + -分解腺嘌呤 - - -酪蛋白 + + +次黃嘌呤 + + +酪氨酸 + + +尿素 + + +黃嘌呤 - - -液化明膠 + + -產生磷酸酯酶 + + +50℃存活，8小時 + + -從下列化合物產生酸阿東糖醇 - + -阿糖 + + +纖維素二糖 + + +赤蘚糖 - + -葡萄糖 + + +α-甲基-糖苷 + + -甘油 + + +肌醇 + + +乳糖 + + +
麥芽糖 + + +甘露糖醇 + + +甘露糖 + + +松三糖 + - -密二糖 + - +棉子糖 + - -鼠李糖 + + +山梨糖 - - -海藻糖 + + +木糖醇 + + +對照物 - - -利用苯甲酸鹽 - - -檸檬酸鹽 + + +粘酸鹽 - - -琥珀酸鹽 + + +酒石酸鹽 - - -對照物 - - -對下列抗生素的抗性桿菌肽(10單位) + - -頭孢菌素I 30μg) + + +艮他黴素(10μg) + - -林肯黴素(2μg) + + +新黴素(30μg) - - -竹桃黴素(15μg) + - -青黴素G(10單位) + + +
利福黴素(5μg) - - -鏈黴素(10μg) + + -四環素(30μg) - - -託首黴素(10μg) + + -萬古黴素(30μg) + + -氯黴素(30μg) - - -紅黴素(15μg) + - -萘啶酮酸(30μg) + + -新生黴素(30μg) - + -多粘菌素B(300單位) + + +三甲氧苄二氨嘧啶(5μg) + + +注a+＝菌株具有該性質;-＝菌株不具有該性質。
採用大量的單位特性，重新計算了相似係數。結果總結於表Ⅳ。
表Ⅳ A82846，東方諾卡氏菌及氣生菌落諾卡氏菌的相似係數相似係數培養物 Ssm SjA82846 100 100東方諾卡氏菌 81 76氣生菌落諾卡氏菌 73 65無論是東方諾卡氏菌還是氣生菌落諾卡氏菌在其細胞壁上均沒有黴菌酸、Gordon(見上)描述了三個關鍵性質，以區別東方諾卡氏菌和氣生菌落諾卡氏菌。採用Gordon的關鍵性質來比較A82846和諸卡氏菌種，其結果如表Ⅴ所示。
表ⅤA82846，東方諾卡氏菌及氣生菌落諾卡氏菌的關鍵性質比較性質從下列化合物產生酸 對溶菌酶培養物 赤蘚糖 甲基-α-糖苷 的 抗性A82846 - + +東方諾卡氏菌 + + -氣生菌落諾卡氏菌 - - +雖然A82846在關鍵性質上不能與兩種諾卡氏菌株相符合，但它在培養特性上與東方諾卡氏菌關係密切，並具有較高的相似係數。它也象東方諾卡氏菌那樣，產生糖肽抗生素。因此，A82846被歸屬於東方諾卡氏菌株(pittenger和Brigham，1956)Pridham和Lyons 1969。由於東方諾卡氏菌可於《經批准的抗生素名稱一覽表》(見上)中找到，因此，它是一個有效的，已發表的菌種。
培養物A82846.1是培養物A82846的化學誘導突變體。A82846.1有別於A82846，其特徵見表Ⅵ所示。
表Ⅵ A82846和A82846.1差異比較性質 A82846 A82864.1碎裂 最小量 豐富菌落大小 7mm 5mm菌落表面 硬 軟氣生菌絲 豐富 痕量背面顏色 深棕色 淺棕色可溶性色素 + -從下列化合物產生酸乙醇 + -糖原 + -松三糖 + -棉子糖 + -
水楊苷 + -利用α-甲基-糖苷 + -糖原 + -松三糖 + -山梨糖 + -丁酸鹽 - +類黑素色素 + -A82846.1和A82846在產生抗菌活性的總量上也有所不同。該兩菌株之間另一個明顯的差異是A82846.1與A82846不同，不產生氣生菌絲，及顯著可溶色素。
培養物A82846.2是培養物A82846的天然變異體，因此，A82846.2的鑑定特性與A82846的基本上相同。兩者的主要差異在於在振搖燒瓶中生長的條件下，培養物A82846.2可產生比培養物A82846更大量抗生的A82846。
象在其他微生物一樣的情況下，可使本發明中的產生A82846的培養物，東方諾卡氏菌株NRRL 18098，NRRL 18099和NRRL 18100等的特性發生變化。因此這些菌株的後代，如重組體、突變體和變異體，可通過熟知的技術方法獲得。例如，變異體可以通過天然選擇獲得，突變體則可以通過使用各種已知的物理和化學突變方法獲得，如紫外光，X射線，γ射線以及一些化學品如N-甲基-N′-硝基-N-亞硝基胍乙啶。
重組體菌株可用熟知的技術，使東方諾卡氏菌株轉化而產生。由於諾卡氏菌和鏈黴菌的相似性，用於鏈黴菌的轉化技術及所產生的重組體媒介物，同樣可以用來轉化諾卡氏菌株。通過使用重組體工藝學，除了這些菌株所產生的抗生素外，東方諾卡氏菌株還能被轉化而壓榨出種種基因產物。例如，人們可以用重組體媒介物來轉化菌株，該媒介物可以授與菌株對抗生素的抵抗力，而在正常的情況下，這些菌株對該抗生素是十分敏感的。這樣得到的轉化物不僅能產生A82846抗生素，而且還能產生授與抵抗力的酶，後者允許從廣泛類型細胞中作轉化菌株的選擇。此外，使用相似的技術，人們可以修飾現有的菌株，採用內源的抗生素生物合成基因的複製，以便取得更高產量的抗生素。東方諾卡氏菌株NRRL 18098，NRRL 18099和NRRL 18100的後代，如天然的和誘導的變異體，突變體及重組體等，它們均保留了A82846產品的特性，也是本發明的一個組成部分。
用於使東方諾卡氏菌培養物生長的培養基，可用多種培養基中的一種。為了生產上的經濟實惠，達到令人滿意的產量以及產品分離方便，某些培養基得優先選用。因此，在大規模的發酵中。優選的碳水化合物來源為葡萄糖和馬鈴薯糊精，儘管核糖，木糖，果糖，半乳糖，甘露糖，甘露糖醇，可溶性澱粉及其類似物也可使用。
優選的氮源是酶-水解酪蛋白和肉腖，儘管酵母提取物，酸-水解酪蛋白，牛肉提取物，魚粉，肝粉及其類似物也可用來作氮源。
在可以併入培養基的營養性無機鹽中，慣用的有能產生下列離子的可溶性鹽Zn2+，Na+，Mg2+，Ca2+，NH+4，Cl-，CO2-3，SO2-4，NO-3及同類的離子。
培養基中還應含有微生物生長和發育所需的，必要的痕量元素。這些痕量元素通常以雜質形式存在於培養基的其它代用品中，其量足以滿足微生物生長的需要。如果發生起泡問題，可在大規模發酵培養基中加入小量(0.2ml/L)的的抗泡沫劑，如聚丙二醇。
為了大量生產A82846抗生素，優先選用在罐內液面下需氧發酵。少量抗生素可以通過振搖燒瓶培養法獲得。由於抗生素生產的時滯與用微生物芽胞形式給大罐接種有關，因此優先採用生長性的接種體。生長性接種體的製備，通過將微生物的芽胞形式或菌絲碎片，接種於小體積培養基上，得到新鮮的，活潑生長的微生物培養物。而後將生長性接種體轉移至大罐中。生長性接種體培養基與用於大規模發酵的一樣，當然其它培養基也是適用的。
使產生A82846的微生物在約23～37℃的條件下生長，可獲得抗生素A82846。A82846生產最適宜溫度看來約為30～31℃。
由於培養過程通常在液面下需氧條件下進行，所以在用常規的渦輪轉子葉片攪拌培養基的同時，將無菌空氣從底部吹入容器。迄今為止，在所採用的條件下，發酵培養的最大氧吸收量每分鐘不超過約0.2mM/L。一般來說，通氣速度和攪拌速度應足以使溶解氧的水平，維持在50%或以上的飽和度。
抗生素A82846的生產能仿效。在發酵過程中，檢驗肉湯樣品，以測定對微生物的抗生活性，已知這些微生物對抗生素是敏感的。一個有用的供鑑定用的微生物是枯草桿菌ATCC6633，生物鑑定通常在研究的瓊脂平皿上進行。
當抗生素A82846經在液面下需氧條件下發酵產生之後，可用工藝上採用的技術方法，將其從發酵培養基中回收得到。在產生A82846的微生物的發酵過程中產生的抗菌活性，既存在於菌絲體中，也存在於肉湯中。
通過起始時調節pH至10.5，使A82846從菌絲體中釋放出來，並過濾培養基，使肉湯從菌絲體團塊中分離出來，可達到A82846最大限定的回收目的。
A82846可通過各種技術，從過濾肉湯中使之回收。優選的技術包括以下步驟調節過濾肉湯的pH至約7，然後將其吸附於陽離子交換樹脂上，例如，Dowex XF5-43278，Dowex-50或大網狀樹脂IR-120。再用合適的溶劑，如稀NH4OH溶液，將活性物質從樹脂上洗脫下來。將活性組分在真空減壓條件下濃縮，並將其吸附在一個大網絡樹脂上，如DiaionHP-20和大網狀樹脂XAD-4上，而後用合適的溶劑，如含有1%乙酸的水∶異丙醇(95∶5)洗脫，得到A82846。該活性物質也可用含有少量酸的水∶乙醯腈或水∶甲醇混合溶劑洗脫。
A82846可用同樣的方法步驟分離得到個別組分A82846A，A82846B，A82846C，優選的分離方法包括反相矽膠(C18或C8)層析。
另一方面，可以用培養基固態物質，包括培養基成份及菌絲體，而無須提取或分離(但是最好除去水之後用)，以作為A82846的來源。例如，在A82846產生之後，整個發酵肉湯可用冷凍乾燥，圓桶烘乾，或共沸蒸餾並乾燥等方法進行。然後將乾燥的肉湯直接混入預混飼料中。
抗生素A82846在體內、外具有極好的抗革蘭氏陽性致病菌的活性。這類抗生素有一種特別的，出乎意料的貢獻，它們具有長的血清半壽期，例如，當靜脈注射給予大鼠時，萬古黴素的血清半壽期是45分鐘，而A82846A和A82846B的半壽期均為2.2小時。
表Ⅶ和表Ⅷ給出了A82846抑制某些細菌的最小抑制濃度(MIC)。表Ⅶ和表Ⅷ中MIC值是用標準的瓊脂稀釋法鑑定而得的。
表Ⅶ A82846抗生素的體外抗菌活性最小抑制濃度MIC(mcg/ml)A82846A A82846B A82846C金黃色葡萄球菌 X1.1 0.125 0.125 1(Staphylococcus aureus X1.1)金黃色葡萄球菌 V41a0.125 0.125 1(Staphylococcus aureus V41)金黃色葡萄球菌 X400b0.125 0.125 1(Staphylococcus aureus X400b)金黃色葡萄球菌 S13E 0.125 0.125 1(Staphylococcus aureus S13E)表皮葡萄球菌 270 0.25 0.25 1(Staphylococcus epidermidis 270)表皮葡萄球菌 222 0.25 0.25 1(Staphylococcus epidermidis 222)釀膿鏈球菌C203 0.125 0.125 1(Streptococcus pyogenes C203)肺類鏈球菌 Park I 0.125 0.125 2(Streptococcus pneumoniae Park I)鏈球菌D群 X66 0.25 0.25 2(Streptococcus Group D X66)鏈球菌D群 2041 0.5 0.5 4(Streptococcus Group D 2041)流感嗜血菌C.L.c(Haemophilus influenzae C.L.c)
表Ⅶ A82846抗生素的體外抗菌活性(續)最小抑制濃度MIC(mcg/ml)A82846A A82846B A82846C流感嗜血菌 76d- - -(Haemophilus influenzae 76d)大腸埃希氏菌 EC14 - - -(Escherichia coli EC14)肺炎克雷伯氏菌 X26) - - -(Klebsiella pneumoniae X26)綠濃桿菌 X239(Pscudomonas aeruginosa X239a青黴素抗株b二甲氧基苯青黴素抗株cα-氨基苄青黴素敏感株dα-氨基苄青黴素抗株e-＝128mcg/mL時無活性，最高水平測試。
表Ⅷ A82846A，A82846B和萬古黴素的體外活性最小抑制濃度MIC(mcg/ml)被測試微生物 菌株數 A82846A A82846B 萬古黴素金黃色葡萄球菌 20 0.125- 0.25- 0.5-2.0(Staphylococcus aureus) 1.0 1.0表皮葡萄球菌 20 0.25- 0.5-1.0 1.0-2.0(Staphylococcus epidermidis) 2.0釀膿鏈球菌 12 0.125- 0.125- 0.5(Streptococcus pyogenes) 0.25 0.25肺炎鏈球菌 20 ≤0.015 0.125- ≤0.015-(Streptococcus pneumoniae) -0.25 0.25 4.0鏈球菌 sp.D群 20 0.25- 0.25- 1.0-2.0(Streptococcus sp.group.D) 1.0 1.0唾液鏈球菌 1 1.0 0.25 0.5(Streptococcus salivaris)血鏈球菌 4 0.25- 0.25 0.5-1.0(Streptococcus sanguis) 0.5變異鏈球菌 2 0.125- 0.125- 0.125-(Streptococcus mutans) 0.5 1.0 2.0A82846類化合物抗微生物活性的一個重要方面，是它們對厭氧細菌有活性。這種活性在表Ⅸ加以說明，該表總結了A82846A和A82846B對各種厭氧細菌的活性，活性測定用標準的瓊脂稀釋鑑定法。在孵育24小時後讀出終點結果。
表Ⅸ A82846A，A82846B對厭氧菌的活性最小抑制濃度MIC(mcg/ml)厭氧菌 被測試菌株數 A82846A A82846B 萬古黴素革蘭氏陽性菌株艱難梭菌 19 0.125-1 ≤0.06 0.5-4(Clostridium defficile) -0.125產氣莢膜梭菌 1 ≤0.25 0.5 2(Clostridium perfringens)敗毒梭菌 1 0.5 0.5 2(Clostridium septicum)產氣真桿菌 1 ≤0.25 0.5 2(Eubacterium aerofaciens)不解糖消化球菌 3 ≤0.25 0.06- 1(Peptococcus 0.5asaccharolyticus)普氏硝化球菌 4 1-2 1-4 1-4(Peptococcus prevoti)可變消化球菌 1 0.5 1 1(Peptococcus variabilis)星群消化球菌 1 0.25 0.25 1(Peptococcus constellatus)大型消化球菌 3 0.06- 0.125- 0.25-1(Peptococcus magnus) 0.125 0.25
表Ⅸ A82846A和A82846B對厭氧菌的活性(續)最小抑制濃度MIC(mcg/ml)厭氧菌 被測試菌株數 A82846A A82846B 萬古黴素厭氧消化鏈球菌 8 0.06-2 0.06-8 0.25-2(Peptostreptococcusanaerobius)中間型消化鏈球菌 3 ≤0.25 0.25- 0.5-1(Peptostreptococcus 0.5intermedius)瘡皰丙酸桿菌 19 ≤0.25 ≤0.25 2-16(Propionibacterium acnes)革蘭氏陰性菌株脆弱擬桿菌 3 ＞128 ＞128 32-64(Bacteroides fragilis)多形擬桿菌 1 128 128 64(Bacteroidesthetaiotaomicron)產黑素擬桿菌 2 ＞128 ＞128 ＞128(Bacteroidesmelaninogenicus)普通擬桿菌 1 128 ＞128 64(Bacteroides vulgatis)齧蝕擬桿菌 1 ＞128 ＞128 64(Bacteroides corrodens)
表Ⅸ A82846A和A82846B對厭氧菌的活性(續)最小抑制濃度MIC(mcg/ml)厭氧菌 被測試菌株數 A82846A A82846B 萬古黴素共生梭桿菌 1 128 128 4(Fusobacteriumsymbiosum)壞死梭桿菌 1 128 128 1(Fusobacterium necrophorum)A82846抗生素在用實驗手段引起感染的實驗動物體內，已顯示出抗微生物活性。將兩種劑量的被測試化合物，給予已被待測試微生物感染的小鼠，觀察到的活性用ED50值來表示〔保護50%的實驗動物的有效劑量，單位為mg/kg，參見Warren Wick，et al.，J.Bacteriol.81，233-235(1961)〕。所測得的下述化合物的ED50值列於表Ⅹ。
表Ⅹ A82846抗生素的體內活性ED50值化合物 金黃色葡萄球菌 釀膿鏈球菌 肺炎鏈球菌A82846A 0.19 0.19 0.17A82846B 0.19 0.20 0.18A82846C 2.18 2.71 5.87萬古黴素 1.3 0.72 1.52a mg/kg×2;感染後1小時和4小時大鼠皮下給予劑量A82846抗生素抗菌活性的一個主要方面，是它們對腎盂腎炎的治療功效。例如A82846A和A82846B在大鼠遺傳性腎盂腎炎感染實驗中所提供的保護作用比萬古黴素更有效。進行該實驗所用方法，如同美國專利4，208，403所描述的那樣。其觀測結果總結於表Ⅺ。
表Ⅺ A82846A和B對大鼠遺傳性腎盂腎炎試驗的活性劑量 治癒大鼠 細菌滴度下降一萬倍化合物 (mg/kg×12)a百分數 (4Log)的大鼠百分數A82846A 10 88 1005 75 882 63 100A82846B 10 100 1005 100 1002 50 88萬古黴素 10 63 1005 38 882 38 75注a隔日皮下給藥劑量，持續6天A82846抗生素在治療心內膜炎方面也很有用。例如，A82846A和B在治療大鼠實驗性導管誘發的心內膜炎時，與萬古黴素比同樣有效。在本實驗中，實驗大鼠的準備工作是將一根塑料導管插入大鼠的右頸動脈，往下達到右心室，並安全地固定好。該動物休息兩天，然後靜脈給予待測微生物糞鏈球菌X-66，微生物滴度大約為5×108/ml，給藥量0.5ml。
在感染前15分鐘皮下給藥，每隔12小時一次，持續14天，共計28次治療。治療後動物保持2天，然後取出心臟，製成勻漿，稀釋，並置於trypticase大豆瓊脂平皿上，將平皿孵育48小時，然後計數。研究結果總結於表Ⅻ。
表Ⅻ A82846A和B對大鼠心內膜炎試驗的活性a16天劑量b治癒的大鼠細菌滴度下降一萬倍化合物 (mg/kg×28) 百分數 (4Log)的大鼠百分數A82846A 20 100 100A82846B 20 100 100萬古黴素 20 100 100注a.用糞鏈球菌X-66導管誘發的心內膜炎。
注b.皮下劑量，每隔12小時給藥，持續14天。
注c.下降4Log死亡的動物百分數。
A82846抗生素的藥劑配方也是本發明的一部分。因而，該抗生素，尤以其符合藥劑學要求的鹽為優選，可配成口服或注射製劑，用於治療和預防細菌感染。例如，可以將該化合物與常規的藥用載體賦形劑調配，製成片劑，膠囊，劑，懸浮劑，糖漿，糯米紙囊劑以及類似劑型。
在含A82846抗生素製劑複方中，活性化合物重量比可從0.1%至90%左右，通常為10%至30%左右。該製劑中可以含有常規的載體和賦形劑，如玉米澱粉或明膠，乳糖，蔗糖，微晶纖維素，高嶺土，甘露糖醇，磷酸二鈣，氯化鈉和藻酸。本發明提供配方中適用的崩解劑包括croscarmellose鈉，微晶纖維素，玉米澱粉，澱粉甘醇酸酯鈉，及藻酸。
片劑中的粘合劑可以選用阿拉伯膠，甲基纖維素，羧甲基纖維素鈉，聚乙烯吡咯烷酮(povidone)，羥丙基甲基纖維素，蔗糖，澱粉及乙基纖維素。
潤滑劑可以選用硬脂酸鎂或其它金屬硬脂酸鹽，硬脂酸，矽流體，滑石粉，臘，油類及膠體矽。
調味劑可以選用薄荷，冬青油，櫻桃調味劑或其它類似物。
如果需要可加入著色劑以改善片子外觀，或有助於產品的鑑別。
為靜脈給藥，可將一種水溶型此類抗生素溶於常規的靜脈輸液中的其中一種，再輸注給藥。此類輸液如生理鹽水，林格注射液或5%葡萄糖溶液，均可使用。
為肌肉給藥，可將該化合物適宜的可溶性鹽構成的無菌製劑，如鹽酸鹽製劑，溶於藥用稀釋劑，並用此溶液給藥，稀釋劑為注射用水，生理鹽水或5%葡萄糖溶液。該化合物適宜的非溶解體可製成水性或油性的藥用懸浮劑，並以上劑型給藥。藥用油劑可用長鏈脂肪酸酯，如油酸乙酯。
為了口服，可將該抗生素適宜的鹽配成的無菌製劑，如鹽酸鹽製劑，以蒸餾水或去離子水作為稀釋劑配製。此法特別有用。
或者，抗生素的單位劑型為密封在安瓿中的加稀釋劑的無菌溶液，尤以其鹽的形式為佳。單位劑型中的抗生素濃度是可變的，例如，從約1%至50%左右，這取決於該抗生素特定的物態及其溶解性和醫生所需的劑量。
另一方面，本發明進一提供了針對一些傳染病，特別是那些由革蘭氏陽性菌，在動物體引起的傳染病，而採用的治療方法。這些動物或者是對微生物敏感的，或者是易受病菌感染的。
為此目的，本方法包括給動物服用一定有效量的A82846抗生素。一般說來，A82846抗生素的有效量為0.5-100mg/kg的劑量。最好的劑量大約為1-60mg/kg的活性化合物。對成年人，典型的日劑量大約為50mg-1.0g。
在實踐中應用此法時，可採用每日給一個單劑量或一日給多個劑量。治療方案為在一段時間內連續給藥，療程為幾天或一周至六周。每次給藥劑量或全部給藥劑量由以下因素決定感染的性質和嚴重程度;患者的年齡及平時的健康狀況;患者對抗生素的耐藥性，以及微生物本身或感染中涉及的微生物。
一個簡便的治療實踐方法是通過靜脈輸注給抗生素。在本方法中，將合適的抗生素可溶性鹽的無菌配方，與生理液(如5%葡萄糖)混合生成的溶液通過靜脈緩慢輸注，或可用背在肩上的脈輸注法。
在其它具體方面，本發明還關係到1)提高家禽、豬、羊和牛等動物飼料利用率的方法;2)促進家禽、豬、羊和牛等動物的生長方法，以提高肉類的產量;及3)提高授乳反芻動物產奶的方法。為了提高飼料利用率和促進生長，可將A82846抗生素以每噸飼料中加進大約2-200g的比例給予牲口口服。以菜牛為例，大約為12-3000mg/頭/天的藥量範圍是合適的。為了提高授乳反芻動物的產奶量，建議每日量大約為0.04-16mg/kg體重(或大約25-5000mg/頭/天)。
在這些方面，本發明的化合物一般以動物飼料預混品的形式出售。這樣的預混物包含一種或多種適合農藝學要求的載體物質。
為了更全面地闡明本發明的操作過程，現提供以下實例。
實例1A82846高壓液相鑑定方法下列分析型高壓液相系統適用於A82846成份。
1.陽離子交換樹脂柱柱載體Zorbax＊SCX(4.6×150mm)系統梯度洗脫，5分鐘內，A∶B從(4∶1)至(1∶9)，維持15分鐘。
A＝MeOH∶0.1M NaH2PO4(1∶9)B＝MeOH∶0.9M NaH2PO4(1∶9)流速1.0毫升/分檢測紫外光，225nm處保留時間與濃度有關，大約為A82846C＝6.6分鐘A82846B＝8.9分鐘A82846A＝9.5分鐘2.反相柱柱載體Zorbax ODA(4.6×150mm)系統梯度洗脫，1%(NH4)H2PO4∶CH3CN20分鐘內，從(95∶5)至(1∶1)。
流速1.0毫升/分鐘檢測紫外光，225nm處保留時間A82846A＝7.3分鐘A82846C＝7.6分鐘A82846B＝8.0分鐘＊Zorbax柱是E.I.duPont de Nemours公司(Wilmington，Delaware州，19898)的產品。
實例2用培養物A82846製備抗生素A82846A.培養物A82846的燒瓶振搖發酵法將培養物東方諾卡氏菌NRRL18098的冷凍乾燥片或保存在液氮中的懸浮物，接種到含有下列成份的接種培養基中，接種培養基原料成份 含量(%)葡萄糖 1.0可溶性澱粉 2.0酵母提取物 0.5酪蛋白的酶促水解物＊ 0.5CaCO30.1去離子水 適量加到1L在滅菌前用NaOH將培養基pH調至7.5左右。
＊NZ Amine A，Sheffield化學公司，Norwich，紐約。
向接種培養基中加入2.5%的瓊脂製成的斜面或平皿培養基。斜面接種在30℃下孵育約需10至14天。用無菌工具刮擦成熟的斜面培養物，使芽孢鬆散並移開，同時浸漬菌絲叢。這樣得到的大約四分之一的鬆散芽孢和培養物用於接種到50ml第一級接種培養基上。
經接種的第一級培養基，在250ml錐形瓶中，於30℃孵育約24-48小時，在一振蕩器上，以250rpm的轉速，圍繞直徑為2英寸(5.08cm)的圓旋轉。
將上述孵育過的第一級培養基(0.5ml)接種到50ml含有下列成份的產物培養基中成份 含量%葡萄糖 2.5大豆粉 1.5馬鈴薯糊精 3.0CaCO 0.25赤糖糊糖漿 0.3酸性水解酪蛋白＊ 0.5去離子水 適量加到1L(無菌劑pH用NaOH調至7.5)＊Hy-Case，Sheffield化學公司。
經孵育過的產物培養基，在一個250ml廣口錐形瓶中，於30℃孵育4-5天，在一振蕩器上，以250rpm的轉速，圍繞直徑為2英寸的圓旋轉。
B.培養物A82846的罐式發酵法為提供大體積接種物，按A節所述方法製得的10ml經孵育的第一期培養基，接種到400ml具有與第一期培養基成份相同的第二期生長培養基中。該第二期生長培養基在2-L廣口錐形瓶中，於30℃孵育約48小時，在一振蕩器上，以250rpm的轉速，圍繞直徑為2英寸的圓旋轉。
將這樣製得的經孵育的第二期生長培養基(100ml)，接種到100L無菌生產培養基上(後者按A節所述方法製得)，但需再加入P-2000抗泡沫劑(0.3g/升)。經孵育的產物培養基在165-L攪拌發酵罐中，於30℃發酵90-100小時。調節攪拌發酵罐(80rpm)中的氣流，維持溶解氧水平在飽和空氣的50%以上。
C.培養物A82846另一種罐式發酵法仿效B節所述方法。除了以下條件有所不同，即將一定量生長培養基用來接種到近1200加侖生產培養基上，後者在1600加侖(4536-L)發酵罐中。
實例3用培養物A82846.1製備抗生素A82846用培養物東方諾卡氏菌NRRL18099的冷凍乾燥片或保存在液氮中的懸浮物，按實例2所述方法進行培養。除了以下條件有所不同，即生產培養基為下列組成原料成份 含量(%)葡萄糖 1.0馬鈴薯糊精 2.0腖＊ 1.0CaCO30.2赤糖糊糖漿 2.0去離子水 適量加到1L無需調pH值＊Bacto-腖(Difco實驗室)實例4用培養物A82846.2製備抗生素A82846培養物東方諾卡氏菌NRRL18100，或者用其冷凍乾燥片，或者為保存在液氮中的懸浮物，以實例2所述方法進行培養。除下列條件有所不同，即所用的酸水解酪蛋白為Amicase(sheffield化學公司)。
實例5A82846粗品的製備在1600加侖發酵罐中按實例2C節所述方法製得，發酵液(4200L)用5N NaOH調pH值至10.5，並加入3%硅藻土545(助濾)。該混合液用壓濾器過濾，用水洗滌壓濾器。合併濾液及洗滌水(4200L)，用5N HCl(或H2SO4)調pH至7，上Dowex-XFS-43278(NH+4)樹脂柱(200L濾液/10L樹脂)，以750ml/分的流速洗脫柱子，各組分既可用枯草桿菌進行生物鑑定，也可用高壓液著進行檢測。
用5倍於柱體積的水洗滌柱子，每100L收集一次，為等分試樣。
用5倍柱體積的0.05N的NH4OH將樹脂上吸附的活性物質洗脫下來，每25L收集一份，合併含A82846的各組分，減壓濃縮至體積約為30L。該溶液上10L用水飽和過的Diaion HP-20樹脂柱。用3倍柱體積的水以300ml/分的流速，洗滌樹脂柱。洗滌水棄去。用含1%乙酸的水∶異丙醇(94∶5)溶液，以100ml/分洗脫柱子上的活性成份，每收集4L為1份，並用生物鑑定法及高壓液相法鑑定。合併含A82846(＃6-14)的組份，減壓濃縮，冷凍乾燥，得356克A82846粗品。
實例6A82846和A82846B的分離A.富集的A82846A及A82846B的分離將30g按實例5製備的A82846溶於500ml水中，並上30L加壓不鏽鋼層析柱，柱載體為用1%NH4H2PO4飽和的矽膠LP-1/C18。該柱用1%NH4H2PO4(60L)至含1%NH4H2PO4(60L)水∶乙腈(88∶12)的溶液進行梯度洗脫，流速為250-300ml/分(最大壓力為600psi)，每收集4L為一份，用紫外在254nm處對洗脫液進行監測。用分析型高壓液相色譜對個別組分進行鑑定，分別合併富含A82846A(＃6-9)和A82846B(＃10-17)的組份，並減壓濃縮。
B.A82846A的純制將A節所述方法，從兩份30g原料得到的富集A82846A的濃縮物，上1750ml的Diaion HP-20SS柱，進行脫鹽，用水洗滌，並用含0.5%乙酸的水∶異丙醇(95∶5)溶液洗脫，用分析型高壓液相色譜進行鑑定，合併含有A82846A的組份，濃縮，冷凍乾燥，得到7.4g富集A82846A的產品。
將7.2g富集A82846A的製品溶於水中，用以1%(NH4)H2PO4飽和的矽膠LP-1/C18為載體的製備型高壓液相柱對該產品進行層析。柱子以1%(NH4)H2PO4至1%(NH4)H2PO4∶乙腈(9∶1)進行梯度洗脫，用分析型高壓液相色譜紫外檢測儀於254nm處對洗脫液進行監測，洗脫流速為48ml/分，開頭10L洗脫液流出後，以500ml為一份進行收集。
分別將含有A82846A(＃4-10)的組份及含有A82846B(＃12-20)的組份進行合併，減壓濃縮。合併3批A82846A濃縮物，用1750ml Diaion HP-20SS柱對該濃縮物進行脫鹽，柱子用水洗，用含0.5%乙酸的水∶異丙醇(95∶5)溶液對A82846A進行洗脫，高壓液相色譜監測洗脫過程。合併含有A82846A的組份，濃縮，冷凍乾燥，得到A82846A純品7.9g。
A82846A的紅外光譜(KBr壓片法)見圖1;A82846A在硫甘油中的快原子轟擊-質譜(FAB-MS)見圖4;A82846A鹽酸鹽的核磁共振譜〔二甲亞碸-d6，即(methyl sulfoxide)-d6〕見圖7，測試溫度為60℃，儀器為Bruker AM500分光計，(壓制HDO(水)峰)。
C.A82846B的純制按B節所述方法，從3批用製備型高壓液相層析分離的A82846A和A82846B的洗脫液中，得到富集A82846B的組份，將組份合併，用1750ml的Diaion HP-20SS柱進行脫鹽，水洗柱子。用含0.5%乙酸的水∶異丙醇(95∶5)溶液洗脫，用高壓液相色譜監測洗脫過程，含A82846B的組份合併，減壓濃縮，冷凍乾燥，得A82846B純品8.8g。
A82846B的紅外光譜(KBr壓片法)見圖2;A82846B在硫甘油中的快原子轟擊-質譜(FAB-MS)見圖5;A82846B乙酸酯的核磁共振譜見圖8，溶液為二甲亞碸-d6，儀器為Bruker AM500分光計，測試溫度為60℃。
D.脫鹽脫鹽過程也可用Diaion HP-20樹脂完成，以含0.1%乙酸的甲醇∶水(4∶1)的溶液洗脫。
實例7A82846C的離析A.A82846的分離按實例2，B節所述方法，從4批165-L發酵原料得到的發酵液，用5N NaOH調節pH值至10.5，加入3%Hyflo Supercel助濾劑後進行過濾。濾液(430L)用5N HCl調節pH值至7，然後上含10L Dowex-XFS-43278(NH+4)樹脂的層析柱進行層析。柱子用50L水洗滌，活性物質用0.05N NH4OH洗脫，每收集4L為一份。洗脫過程用生物鑑定法進行監測。合併活性組份(＃1-7)，減壓濃縮至體積約為1700ml。冷凍乾燥，得A82846粗品283.9g。
B.A82846A，B和C的分離將A節方法所得A82846粗品2g溶於水中，用2″×45″不鏽鋼製備型高壓液相層析柱進行分離，柱載體含2110ml矽膠LP-1/C18樹脂於1%(NH4)H2PO4中的溶液。柱子用1%(NH4)H2PO4至1%(NH4)H2PO4∶乙腈(92∶8)進行梯度洗脫，流速70ml/分，每收集400ml為一份，並用紫外儀在254nm處進行監測。
將含A82846A(＃11-14)的組份合併為第1庫，將含A82846C(＃16-20)的合併為第2庫，將含A82846B(＃21-25)的合併為第3庫。
C.A82846C的純制將第2庫體積濃縮至200ml左右，然後上7×45cm玻璃層析柱進行脫鹽，柱載體為1800ml Diaion HP-20樹脂。活性物質用含0.1%乙酸的MeOH∶H2O(4∶1)溶液進行洗脫。每收集1L為一份，流速為25ml/分。將含C(＃9-12)的組份合併，訪壓濃縮，冷凍乾燥，得A82846C的半純品662.6mg。
該半純品(500mg)進一步用反相高壓液相步驟重複多次純化，層析用1″×48″鋼柱，450ml矽膠LP-1/C18為載體，以1%(NH4)H2PO4至1%(NH4)H2PO4∶乙腈(92∶8)進行梯度洗脫，流速為11ml/分，每收集25ml為一份，並用紫外儀在245nm處進行監測。合併A82846C(＃169-210)組份，用5×45cm玻璃層析柱進行脫鹽，柱載體為HP-20樹脂。以含0.1%乙酸的MeOH∶H2O(4∶1)的溶液洗脫，每收集100ml為一份，隨後用分析型高壓液相儀洗脫，並在紫外儀225nm處鹽測。將含有A82846C(＃5-11)的組份合併，減壓濃縮，冷凍乾燥，得127.3mgA82846C。
採用與A82846C同樣的方法，對含A82846A的第一庫以及含A82846B的第3庫，分別進行純化，進一步得到純化的A82846A和A82846B。
D.A82846C的進一步純化進一步用下列製備型色譜法對A82846C(70mg)進行純化柱載體Zorbax SCX(9.2×250mm)陽離子交換型流動相線性梯度改變，在6分鐘內，從含10%甲醇的0.15M NaH2PO4緩衝液至含10%甲醇的0.9M NaH2PO4緩衝液，並保持5分鐘，對緩衝液不作調節。
流速6.0ml/分檢測紫外，280nm處載荷6.0mg/注射，於水液中使用配備有峰檢測功能的自動組份收集器(Gilson 201C)對A82846C進行收集;通過Millipore Waters M600梯度高壓液相色譜系統，釋放流動相，並使用日立牌自動進樣器注入樣品溶液。
將含有A82846C的組份合併，濃縮至體積為30ml，上HP-20層析柱(50ml)，柱用水洗滌，並用含0.5%乙酸的H2O∶異丙醇(95∶5)溶液洗脫，每收集25ml為一份，合併含A82846C(＃9-14)的組份，濃縮，冷凍乾燥，得37mg純化的A82846C。
A82846C的紅外光譜(KBr壓片法)見圖3;A82846C在硫甘油中的FAB-MS見圖6;A82846C乙酸酯的核磁共振譜見圖9，溶劑為二甲亞碸-d，儀器為Bruker AM500型儀〔壓制HDO(水)峰〕，測試溫度為60℃。
實例8A82846鹽的製備步驟在每種情況下，將A82846組分(100mg)溶於去離子水(10ml)中。用0.5N的酸(HCl，H2SO4，H3PO4)調節該溶液pH值至3左右。經冷凍乾燥，析出適宜的鹽。特別要指出的是，若是pH值比3低得多時(即pH2)，則該成分將會降解。所得產量如下鹽 產量(mg)A82846A A82846BHCl 93.8 88.1H2SO492.5 75.4H3PO4110.8 105.7
實例9A82846A片劑配方可用下列原料，按下表所示量，製備A82846A的片劑。
原料成分 重量A82846A磷酸鹽 282.9mg徵晶纖維素 101.1mgCroscarmellose鈉 12.0mg聚乙烯吡咯烷酮(PVP) 12.0mg硬脂酸鎂 3.0mg硬脂酸 4.0mg(純水 0.16ml)在一合適容器中加入A82846A磷酸鹽，一小部分微晶纖維素和一小部分Croscarmellose鈉，調和至均勻。配製聚乙烯吡咯烷酮的水溶液，將該溶液加到配好的粉末中。將此混合物製成顆粒，必要時過篩，而後乾燥。向該乾燥的混合物中加進剩餘的微晶纖維素和Croscarmellose鈉，調和均勻，再加進硬脂酸鎂和硬脂酸，調勻混合物，將生成的粉末狀混合物壓片。
實例10A82846B膠囊配方可用下列原料，按下表所示量，配製A82846B的膠囊。
原料成分 重量A82846B鹽酸鹽 262.2mg玉米澱粉細粉 137.7mg矽流體(350釐斯託克斯) 2.7mg玉米澱粉 147.1mg
在合適的容器中，將A82846B鹽酸鹽，澱粉細粉，矽流體(350釐斯託克斯)和澱粉粉末在合適的混合器中混勻。裝填入尺寸適宜的硬明膠膠囊內。
實例11A82846A懸浮劑配方通過結晶或沉澱法製成無菌的不溶性形式的A82846A。研磨或篩選成粒子大小適宜於懸浮劑用的顆粒，將A82846A懸浮於下列賦形劑中。
原料成分 量卵磷脂 1%檸檬酸鈉 2%對羥苯甲酸丙酯 0.015%注射用水 適量至所需體積該懸浮劑可大量製備，並分裝到小瓶中，或者臨時製備，在小瓶中將賦形劑加到A82846A中去。
權利要求
1.一種生產抗生素A82846，A82846A，A82846B，或A82846C的工藝方法，它包括培養東方諾卡氏菌(Nocardia orientalis)NRRL 18098，NRRL 18099或NRRL 18100，或其能在含有可吸收碳、氮氣和無機鹽源的培養基內，在液面下需氧發酵條件下產生A82846後代的工藝方法，接著可任意從發酵培養基內分離出抗生素，和/或使抗生素成鹽，若前者不呈鹽形式的話。
2.按照「權利要求
1」的工藝方法，製備A82846A或其符合藥物學上可接受的鹽。
3.按照「權利要求
1」的工藝方法，製備A82846B或其符合藥物學上可接受的鹽。
4.選自東方諾卡氏菌株NRRL 18098，NRRL 18099和NRRL 18100或其能產生A82846後代的生物純培養物。
專利摘要
用東方諾卡氏菌株NRRL 18098，NRRL18099和NRRL 18100生產新型糖肽抗生素A82846，包括A82846A，A82846B和A82846C。A82846抗生素與萬古黴素相比，具有抗革蘭氏陽性菌的活性。
文檔編號A61P31/04GK87106483SQ87106483
公開日1988年6月8日 申請日期1987年9月19日
發明者羅伯特·L·哈米爾, 詹姆斯·艾伯特·馬比, 戴維·弗朗西斯·馬奧尼, 沃爾特·中司三男, 姚慈晃 申請人:伊萊利利公司導出引文BiBTeX, EndNote, RefMan