一種高效篩選衣藻放氫突變體的方法
2023-05-28 07:59:36 1
專利名稱：一種高效篩選衣藻放氫突變體的方法
技術領域：
本發明涉及一種篩選衣藻放氫突變體的方法。
背景技術：
由於礦物資源的日益枯竭，尋找清潔的替代能源已成為一項迫切的課題。氫是宇宙間最簡單同時也是最為豐富的元素，它的熱值高達118. 4kJ/g，燃燒後只生成水，被普遍認為是一種最有吸引力的替代能源。但是，氫氣在地球表面的濃度小於lmg/L，僅佔地球表面大氣的極小部分，在自然界中大部分的氫是以化合態存在的，傳統的化學產氫方法採用電解水或熱解石油、天然氣， 生產成本也普遍較高。因此，新的產氫方法，特別是那些能利用可再生能源，大量生產的產氫方法倍受注目。藻類光合制氫是微藻利用太陽能裂解水釋放氫氣的生物過程，是實現氫能可持續生產的重要途徑之一。由於光合作用水光解放氧和產氫是微藻細胞內兩個既相互矛盾又密切關聯的複雜生物代謝過程，而目前人們對這些過程發生機制和調節方式還不清楚，致使遺傳改造不能有效進行，光能轉化到氫的效率得不到顯著提高，從源頭上嚴重製約了微藻制氫途徑的應用。
發明內容
本發明的目的是提供一種有效的高通量篩選衣藻放氫突變體的方法。本發明所提供的篩選衣藻放氫突變體的方法，包括下述步驟1)將 pJD67 質粒導入萊茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii) CC425 中，將轉化子在無精氨酸的培養基上培養篩選能生長的轉化子，即為插入PJD67質粒的突變體；2)在插入pJD67質粒的突變體中篩選獲得放氫量提高的轉基因衣藻突變體。所述方法中，所述篩選獲得放氫量提高的轉基因衣藻突變體，是將插入pJD67質粒的突變體進行培養，篩選細胞澱粉含量提高的突變體，然後在無硫培養基中培養，篩選放氫量提高的衣藻突變體。所述方法中，培養插入PJD67質粒的突變體的培養液為由NH4Cl 4g/L ； MgSO4 · 7H20. lg/L ；CaCl2 · 2H20 0. 05g/L ；K2HPO4O. 108g/L ；KH2PO4O. 056g/L ；Trisbase 2. 423g/L ；Hutner's trace element lml/L，冰乙酸 lml/L禾口水組成，其中，Hutner』 s trace element 由 H3BO4Il. 4g/L, ZnSO4 · 7H20 22. Og/L, MnCl2 · 4H205. 06g/L, CoCl2 · 6H20 1. 61g/ L, CuSO4 · 5H20 1. 57g/L, (NH4)6Mo7Om · 4H20 1. lOg/L, FeSO4 · 7H20 4. 99g/L 和水組成；培養萊茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)CC425的培養基為培養突變體的培養液中添加質量百分濃度為0. 的精氨酸的培養基；所述無硫培養基是將上述培養插入PJD67質粒的突變體的培養液中中的硫化物以等摩爾換成相應的氯化物獲得的培養基。本發明還保護一株上述方法獲得放氫量最高的突變藻株，萊茵衣藻 (Chlamydomonas reinhardtii)CrSA-3,其保藏編號為 CGMCC Na . 3983。與萊茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)，藻種CC425相比，CrSA-3澱粉含量是萊茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)，藻種CC425的4. 5倍，但放氫量可達到萊茵衣藻 (Chlamydomonas reinhardtii)，■禾中 CC425 白勺 10 .。萊茵衣藻(Chlamydomonasreinhardtii) CrSA-3，於 2010 年 7 月 6 日保藏於中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱CGMCC，地址為北京市朝陽區北辰西路 1號院3號，中國科學院微生物研究所)，保藏登記號分別為CGMCC No . 3983。本發明的方法，以光合產氫模式綠藻細胞為材料，採用新近發展的分子遺傳學方法，高效率地轉化了野生型藻株，通過精氨酸特異性篩選獲得突變體株系，構建了覆蓋全基因組的飽和突變體庫。同時根據研究揭示了澱粉在產氫中的重要作用，發展出一種有效的高通量篩選衣藻放氫突變體的方法，利用先篩選澱粉含量高的突變株，減少直接測量產氫量的工作量，提高了篩選衣藻放氫突變體的效率。這也為提高微藻光合產氫機理研究奠定了重要基礎，同時為將來的大規模產氫技術改進提供依據。下面結合附圖和具體實施例對本發明作進一步說明。
圖1為篩選的衣藻突變體澱粉含量檢測結果。圖2為篩選的衣藻突變體放氫量的測定結果。圖3為篩選的衣藻突變體與對照CC425澱粉和放氫量的比值。 圖4為pJD67質粒結構示意圖
具體實施例方式下述實施例所述的方法，如無特別說明，均為常規方法。實施例1、有效的高通量篩選衣藻放氫突變體的方法及其效果驗證一、材料1、植物材料萊茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)，藻種CC425 (精氨酸缺陷型，Arg-)從杜克大學藻種庫萊茵衣藻(Chlamy center, http://www.chlamy.org/)購買； 其他突變體均由本實驗室採用T-DNA隨機插入方法獲得。2、質粒pJD67質粒購自杜克大學萊茵衣藻中心(Chlamy center, http://www. chlamy. org/) ；pJD67質粒由已經商業化的pBluscript SK質粒改造而來，全長lU84bp，含有精醯琥珀酸裂解酶基因及氨苄青黴素抗性基因。轉化藻株時，用KpnI線性化處理，可提高轉化效率。PJD67序列為序列1。3、培養基1)正常 TAP 培養液=NH4Cl 0. 4g/L ；MgSO4 · 7H20 0. lg/L ；CaCl2 · 2H20 0. 05g/ L ；K2HPO4O. 108g/L ；KH2PO4O. 056g/L ；Trisbase 2. 423g/L ；亨特微量元素(Hunter，strace elements) lml/L,冰乙酸 lml/L，其餘為水。2)缺硫TAP培養液(g/L)將正常培養液中的硫化物以等摩爾換成相應的氯化物。3)固體TAP培養基在正常TAP培養液中加1. 5%的瓊脂粉。4)亨特微量元素(Hunter's trace elements) =H3BO4Il. 4g/L,ZnSO4 ·7Η20 22. Og/ L, MnCl2 · 4H20 5. 06g/L, CoCl2 · 6H20 1. 61g/L, CuSO4 · 5H20 1. 57g/L, (NH4)6Mo7O24 · 4H201. 10g/L，FeSO4 · 7H20 4. 99g/L，其餘為水。二、篩選衣藻放氫突變體的方法1材料培養用TAP 固體培養基培養萊茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii) CC425，配製 TAP 液體培養液，121°C高壓滅菌20分鐘，待培養液溫度降到室溫後，用接種針從固體培養基上挑取萊茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii) CC425單克隆到液體TAP培養液中，置於恆溫光照培養箱中的搖床上連續光照培養(25°C，60rpm，200 μ EiT1nT2)，懸浮培養細胞。固體培養時，將單克隆轉到TAP固體培養基上劃線培養。2突變體庫的構建實驗採用萊茵衣藻CC425作為遺傳背景，它是一種細胞壁缺失的突變體，其基因組中的arg (精醯琥珀酸裂解酶基因)因紫外線照射而發生點突變，因此在缺少精氨酸的環境中無法正常生長直至死亡。本實驗中的突變體均以CC425為遺傳背景，採用PJD67質粒線性化隨機插入法獲得，由於插入CC425的線性質粒片段帶有arg基因，故能正常培養環境中(無精氨酸)生長的藻株均為插入突變體。具體轉基因方法如下所述1)在添加質量百分含量為0. 1 % (終濃度)的精氨酸的正常TAP培養液中接種 CC425。收集15ml對數生長期的CC425，3000rpm，25°C，離心^iin收集細胞。2)用30ml正常TAP培養液(無精氨酸)懸浮細胞，3000rpm, 25°C，離心％iin，30ml 正常TAP培養液漂洗細胞。重複一次。3)用600 μ 1的正常TAP培養液懸浮細胞，將懸浮液加到盛有0. Ig玻璃珠的 1. 5mlEpendorf管中，每管100 μ 1 ；再加入pJD67質粒(用KpnI線性化處理)，每管5 μ g。 置於漩渦振蕩器(產品型號BS14-V0TEX3000，購自克勒格瓦尼(上海)分析儀器有限公司)振蕩15s。4)將轉化後的細胞分別裝入20ml的正常TAP培養液中，過夜恢復培養。5)將恢復培養的細胞3000rpm，25°C，離心％iin，取上清。Iml正常TAP培養液懸浮細胞，取200ul塗到不加精氨酸的正常TAP固體平板上。6)長出的單克隆為T-DNA隨機插入突變體，挑取單克隆保存到固體培養基保種。上述方法平均每個正常TAP固體平板上長出100個單克隆，共20個平板，轉化效率大約為400單克隆/ (ug質粒)(轉化效率=產生每個平板單克隆數/每個平板轉化用質粒DNA的總量，在本步驟中為100/(5ug/20) = 400個單克隆/ug)。3衣藻放氫突變體篩選1)澱粉突變體的初步篩選用牙籤將突變體庫中的400株單克隆由平板上挑到正常TAP培養液(無精氨酸) 中培養，設對照組CC425(由於CC425本身不能合成精氨酸，因此正常TAP培養液中需加入最終質量百分含量為0. 1 %的精氨酸)。培養至對數生長期時，細胞密度為1-5 X IO6個細胞/ml時，取500 μ 1懸浮培養的細胞置於96孔板中，滴加Iogus碘液(碘lg，碘化鉀2g， 蒸餾水300mL。先將碘化鉀溶於3 5ml蒸餾水中，然後加碘，搖勻，使碘完全溶解後，再加蒸餾水至足量。裝入棕色試劑瓶。)100 μ 1，蓋上培養板蓋，振蕩混勻，放置IOmin後，觀察顏色變化，顏色變化明顯的為潛在的澱粉突變體，共獲得64株潛在的澱粉突變體。2)突變體澱粉含量的測定
選取1)中64株潛在的澱粉突變體進行澱粉含量的測定。培養材料至對數生長期即OD7m達到1. 0左右時，可進行澱粉含量指標測定，具體步驟如下①測OD75tl值，計算細胞密度。取15ml左右的培養物至50ml離心管中，5000rpm離心5min,棄上清。②加1ml H2O將沉澱重懸，再加9ml的95%乙醇，vortex使之充分重懸混勻。將懸浮液5000rpm離心5min，棄上清。重複②步驟1次。③用:3ml H2O將沉澱懸浮起來，轉入玻璃試管中。在沸水中將樣品煮沸15min。④取1. 5ml煮沸後的上清液於EP管中，2000g離心lOmin，棄沉澱，取上清。⑤另取EP管，分別加入0. 25ml、0. 375ml、0. 5ml的離心後的上清液，再加入 0. 125mllogus 碘液，用 H2O 定容至 1. 25ml (空白對照即 0. 125ml Iogus 碘液+1. 25mlH20)。⑥測定OD625處的光吸收值，做相應的記錄。
⑦根據標準曲線計算測定樣品中的澱粉濃度。⑧數據處理。初步篩選到的1)中64株潛在的澱粉突變體澱粉含量定量測定結果表明，共有34 株澱粉含量差異突變體，其中有21株澱粉含量高於對照3倍以上，8株突變體澱粉含量明顯小於對照，另有5株澱粉含量極微幾乎無法測出。部分數據如圖1(突變體澱粉含量與對照CC425澱粉含量的比值，其中CC425澱粉含量為53. 52ug/107個細胞)所示圖1為篩選的衣藻突變體澱粉含量檢測結果.每一個突變體編號的數值代表突變體澱粉含量與對照 CC425澱粉含量的比值。比值大於1，表示突變體澱粉含量高於對照；比值小於1，表示突變體澱粉含量低於對照。比值越大，澱粉含量越高；比值越小，澱粉含量越小。3)澱粉突變體放氫量測定①液體培養將步驟2)篩選得到的澱粉含量提高的衣藻突變體接到盛150ml正常TAP 培養液的三角瓶中，當OD75tl值達到1. 0-1. 5時，再將其轉到已加入磁轉子的500ml培養液中。②待OD75tl值達到1. 5左右時，25°C，2500rpm,離心5分鐘。③倒掉上清，用缺硫TAP培養液漂洗細胞兩次。④將漂洗過的細胞用20ml左右缺硫培養液重懸細胞。⑤取20 μ 1懸浮細胞，加入980 μ 1缺硫培養液，再加入4ml丙酮，混勻，5000rpm，5分鐘。⑥取離心後的上清，測定663nm和645nm處的吸光值，根據下面的公式計算總葉綠
素含量Chl (a+b) = 8. 02 X 0D663+20. 21 X OD645⑦採用khott培養瓶做放氫瓶，培養體系為270ml，計算最終葉綠素濃度達到 20μ g/ml所需的④步驟中的細胞原液體積，加入細胞，用缺硫TAP培養液補足到270ml。⑧用石蠟封住瓶口，以防止氣體外漏。⑨將培養瓶置於25°C，200 μ EiT1nT2培養箱中的磁力攪拌器上連續光照培養，分別取不同的時間點測定放氫量。採用SHIMADZU GC-2014氣相色譜測定氫氣含量，載氣為氮氣。 測定時用Iml注射器吸取放氫瓶氣體部分500 μ 1，注入進樣孔，甲烷外標法計算氣體體積。結果表明，CC425放氫量為每小時85umol氫氣/mg葉綠素，即每小時3. 57umol氫氣/IO7個細胞，在澱粉含量提高的21株突變體中，有8株放氫量高於對照兩倍以上，其中有4株放氫量為對照的5倍以上，其餘的部分突變體雖然澱粉含量高於對照，但放氫量並未明顯升高，對澱粉含量比對照低的藻株進行放氫量測定，發現其放氫量均低於對照。部分峰圖如圖2所示，圖2為篩選的衣藻突變體放氫量的測定結果.藍色線為CC425峰譜圖，其餘為突變體峰譜圖。用壓和CH4的峰面積比值，計算出H2的體積。在澱粉突變體中篩到數十個產氫變化明顯的藻株，其中部分突變體澱粉含量與放氫量對照圖如圖3所示，圖3為篩選的衣藻突變體與對照CC425澱粉和放氫量的比值。圖 3所示，雖然澱粉含量的變化和放氫量並沒有直接的線性關係，但是大部分澱粉變化明顯的的突變體(如SA-1，SA-2，SA-5，SA-6，SA-9，SA-10等)其放氫量與對照CC425相比，也發生了明顯的變化。因此用澱粉含量的變化篩選放氫相關突變體是一種有效的高通量的方法。將上述放氫量最高的突變株命名為萊茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii) CrSA-3，於2010年7月6日保藏於中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱 CGMCC，地址為北京市朝陽區北辰西路1號院3號，中國科學院微生物研究所)，保藏登記號分別為 CGMCC Na . 3983。採用本方法中3 (2) ,3(3)步驟分別測定對照組和CrSA_3的澱粉含量和放氫量，發現CrSA-3澱粉含量是對照的4. 5倍，但放氫量可達到對照的10倍。
權利要求
1.一種篩選衣藻放氫突變體的方法，包括下述步驟1)將PJD67質粒導入萊茵衣藻(Chlamydomonasreinhardtii) CC425中，將轉化子在無精氨酸的培養基上培養篩選能生長的轉化子，即為插入PJD67質粒的突變體；2)在插入PJD67質粒的突變體中篩選獲得放氫量提高的轉基因衣藻突變體。
2.根據權利要求1所述的方法，其特徵在於所述篩選獲得放氫量提高的轉基因衣藻突變體，是將插入PJD67質粒的突變體進行培養，篩選細胞澱粉含量提高的突變體，然後在無硫培養基中培養，篩選放氫量提高的衣藻突變體。
3.根據權利要求1所述的方法，其特徵在於所述方法中，培養插入PJD67質粒的突變體的培養液為由 NH4ClO. 4g/L ；MgSO4 ·7Η20 0. lg/L ；CaCl2 ·2Η20 0. 05g/L ；K2HPO4O. 108g/L ； KH2PO4O. 056g/L ；Trisbase 2. 423g/L ；Hutner's trace element lml/L，冰乙酸 lml/L 和水組成，其中，Hutner' s trace element 由 H3BO4Il. 4g/L, ZnSO4 · 7H20 22. Og/L, MnCl2 · 4H20 5. 06g/L, CoCl2 · 6H20 1. 61g/L, CuSO4 · 5H201. 57g/L, (NH4) 6Mo7024 · 4H20 1. lOg/L, FeSO4 · 7H20 4. 99g/L 和水組成；培養萊茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii) CC425 的培養基為培養突變體的培養液中添加精氨酸至終質量百分濃度為0. 的培養基；所述無硫培養基是將上述培養插入PJD67質粒的突變體的培養液中的硫化物以等摩爾換成相應的氯化物獲得的培養基。
4.萊茵衣藻(Chlamydomonasreinhardtii)CrSA_3，其保藏編號為 CGMCC Ns . 3983。
全文摘要
本發明公開了一種篩選衣藻放氫突變體的方法。該方法，包括下述步驟1)將pJD67質粒導入萊茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)CC425中，將轉化子在無精氨酸的培養基上培養篩選能生長的轉化子，即為插入pJD67質粒的突變體；2)在插入pJD67質粒的突變體中篩選獲得放氫量提高的轉基因衣藻突變體。該方法，減少直接測量產氫量的工作量，提高了篩選衣藻放氫突變體的效率。這也為提高微藻光合產氫機理研究奠定了重要基礎，同時為將來的大規模產氫技術改進提供依據。
文檔編號C12N1/13GK102337216SQ201010233108
公開日2012年2月1日 申請日期2010年7月16日 優先權日2010年7月16日
發明者孫永樂, 趙磊, 陳梅, 黃芳 申請人:中國科學院植物研究所