重組人表皮生長因子生物學活性測定方法及其應用的製作方法
2023-05-28 01:27:51 1
專利名稱：重組人表皮生長因子生物學活性測定方法及其應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及細胞生長因子的生物學活性測定領域，更具體地說涉及重組人表皮生長因子(EGF)的生物學活性測定方法及其應用。
背景技術：
人表皮生長因子(EGF)是含53個胺基酸殘基的多肽，分子量是6045道爾頓。在體內和體外實驗中EGF通過細胞膜上的受體(表皮生長因子受體，EGFR)刺激上皮和間葉細胞殖。目前通用的重組人表皮生長因子生物學活性測定法採用細胞增殖法/MTT比色法 (《中國藥典》，2010年版三部，附錄第74頁)，該法依據重組人表皮生長因子對小鼠胚胎成纖維細胞(Balb/c 3T3細胞)的生長具有刺激作用，Balb/c 3T3細胞的生長狀況因重組人表皮生長因子生物學活性的不同而異，以此檢測重組人表皮生長因子的生物學活性。其測定法為Balb/c 3T3細胞株用完全培養液於37°C、5%二氧化碳培養，控制細胞濃度為每 Iml含1. OX IO5 5. OX IO5個細胞，傳代後M 36小時用於生物學活性測定。棄去培養瓶中的培養液，消化和收集細胞，用完全培養液配成每Iml含5. OX IO4 8. OX IO4個細胞的細胞懸液，接種於96孔細胞培養板中，每孔100μ 1。在37°C、5%二氧化碳條件下培養。 24小時後換成維持培養液，置37°C、5%二氧化碳條件下培養M小時。製備的細胞培養板棄去維持液，加入標準品溶液和供試品溶液，每孔ΙΟΟμΙ，置37°C、5%二氧化碳條件下培養64 72小時。每孔加入MTT溶液20 μ 1，於37°C、5%二氧化碳條件下培養5小時。以上操作在無菌條件下進行。棄去培養板中的液體後，向每孔中加入二甲基亞碸(DMSO)IOOy 1， 混勻後在酶標儀上，以630nm為參比波長，于波長570nm處測定吸光度，記錄測定結果。試驗數據採用電腦程式或四參數回歸計算法進行處理。早在1963年，Slater就發現了線粒體中的脫氫酶(如琥珀酸脫氫酶、心肌黃酶) 可將四甲基偶氮唑鹽(MTT)的唑環打開，生成藍色的產物甲藤(formazan) 0根據這個原理，Mosmann (Mosmann T. Rapid colorimetric assay for celluar growth and survival application to proliferation and cytotoxicity assays. J Immunol Methods,1983, 65 55)於1983年創立了 MTT檢測法，此法在測定細胞的存活和增殖方面非常有效，因為這種顏色的變化僅僅發生在活的細胞中，並且甲騰的形成量與活細胞數和功能狀態是成比例的。目前MTT測定法已經廣泛地應用於多種生長因子如表皮生長因子、腫瘤壞死因子、白細胞介素-2等的檢測工作中。MTT比色法受較多因素影響，如細胞數、MTT濃度及保留時間、溶解液用量，並有時存在敏感性偏低、有機溶劑產生蛋白質沉澱及產物的溶解度偏低等一些問題。MTT比色法從樣品加入開始，試驗周期至少為4天，試驗中需保持無菌環境。鑑於生物測定方法繁瑣、實驗周期長、準確度差、誤差大(劉蘭等，中國生物製品學雜誌，2002;15C3) :175-176)、耗費大量人力、物力，因此在今後藥品質量標準中生物測定將逐漸被先進的理化方法、或能保證臨床用藥安全有效的其它方法所取代，或只存在於生產研究階段。
發明內容
本發明在現有技術的基礎上，針對傳統的MTT比色法中存在的上述不足，開發出競爭性抑制的流式細胞方法，用來檢測表皮生長因子(EGF)與表皮生長因子受體(EGFR)的結合活性。除預先培養細胞外，從樣品加入開始，試驗周期僅為1天，試驗過程中無需無菌環境，下面是其試驗原理EGF和抗表皮生長因子受體的單克隆抗體可以競爭性結合EGFR，通過抗體阻斷 EGF和其受體的結合來間接測定EGF與EGFR結合的生物學活性。抗人表皮生長因子受體單克隆抗體流式細胞法生物學活性測定原理在檢測體系中加入螢光素標記的異硫氰酸的第二單抗，通過間接免疫螢光法來測定第二單抗-原單克隆抗體-EGFR結合物的螢光強度。螢光強度的高低反應了抗體濃度的變化，結果的計算可以通過四參數曲線分析(S形曲線)，求出半數有效結合濃度(EC5tl),與參考品比較計算抗體濃度相對生物學活性的百分比(根據《中國藥典》，2010年版，二部附錄生物檢定法中量反應平行線原理推定樣品和參考品的S形曲線具有相同的最大值、最小值和斜率)。基本條件Guava Easycyte Mini Flow Cytometer 流式細胞儀。採用 CytoSoft 4. 1軟體中的Guava ExpressPlus程序。選定特定細胞群(EGFR表達較好的細胞群)作為計數對象。試驗過程並不發生活體細胞的凋亡或增殖抑制，測定過程不需要無菌環境，與免疫螢光相比，可以進行定量測定(EC5tl)。根據上述單抗生物學活性測定原理，可以設計採用飽和濃度的抗人表皮生長因子受體的單克隆抗體與不同濃度的重組人表皮生長因子一起競爭性結合腫瘤細胞膜表面的 EGFR，然後加入一個螢光素標記的第二單抗與細胞膜表面上的上述單抗結合，在流式細胞儀上採用特定的程序和選擇特定的細胞區域獲得各個樣品的平均螢光強度值，試驗數據採用電腦程式GraphPad Prism軟體(四參數回歸)進行處理，分別獲得EGF標準品和樣品的半數有效抑制濃度(EC5tl),從而獲得EGF樣品相對於EGF標準品的相對生物學活性。根據EGF標準品的生物學活性(IU/mL)，可計算出EGF樣品的生物學活性。本發明與《中國藥典》中的重組人表皮生長因子生物學活性測定法相比，本發明的測定方法實施更方便(除預先培養細胞外，一天即可完成試驗，試驗過程中無需無菌環境； 藥典方法至少需要四天，且試驗過程需無菌環境)，質量更可控。本發明的目的是提供一種重組人表皮生長因子的生物學活性測定方法，採用抗人表皮生長因子受體單克隆抗體與不同濃度的重組人表皮生長因子的混合物競爭性結合特定腫瘤細胞系的細胞膜表面的表皮生長因子受體，在流式細胞儀上採用特定的程序和選擇特定的細胞區域獲得各個樣品的平均螢光強度值。本發明是通過下面的技術方案實現的一種重組人表皮生長因子的生物學活性測定方法，其步驟包括1)、在適合的條件下培養特定腫瘤細胞(檢測細胞)；2)、將EGF樣品和EGF標準品稀釋到飽和濃度的抗人表皮生長因子受體的單克隆抗體中，與1)中的特定腫瘤細胞反應；3)、離心倒掉上清液，重新懸浮細胞，加入一個螢光素標記的第二單抗，反應15-60 分鐘；4)、檢測細胞平均螢光強度，通過數據處理計算EGF樣品生物學活性。所述步驟1)中的特定腫瘤細胞為中度或高度表達表皮生長因子受體的人細胞， 所述特定腫瘤細胞用PBS調整後的懸濁液的濃度為7X106個/mL。所述的特定腫瘤細胞優選為人肺腺癌細胞H-125細胞系、A431、DiFi的任意一種； 更優選為人肺腺癌細胞H-125細胞系。所述步驟幻中的抗人表皮生長因子受體的單克隆抗體可以是尼妥珠單抗或西妥昔單抗；所採用的抗體濃度為50ug/mL，不同濃度的EGF稀釋液為25ug/mL向下倍比稀釋10 個稀釋度。所述步驟3)中的反應時間優選為30分鐘。所述步驟4)為離心倒掉上清液，重新懸浮細胞，加入一定量的1 %多聚甲醛PBS， 在流式細胞儀上採用特定的程序和選擇特定的細胞區域獲得各個樣品的平均螢光強度值， 試驗數據採用電腦程式GraphPad Prism軟體(四參數回歸)進行處理，分別獲得EGF標準品和樣品的半數有效抑制濃度(EC5tl)，從而獲得EGF樣品相對於EGF標準品的相對生物學活性。根據EGF標準品的生物學活性(IU/mL)，可獲得EGF樣品的生物學活性(IU/mL)。本發明同時提供了重組人表皮生長因子的生物學活性測定方法在重組人表皮生長因子或其衍生物質控中的應用。重組產品生物學活性是質控中重要的檢測指標，以確保產品具有穩定的生物活性。本發明是根據重組人表皮生長因子(EGF)可與抗人表皮生長因子受體的單克隆抗體競爭性結合EGFR，在具有飽和濃度的單抗的前提下，EGF競爭性抑制單抗與EGFR結合， 呈劑量依賴性(四參數回歸，反S形曲線)，根據半數有效抑制濃度(EC5tl)的比較，可以計算出EGF樣品相對於EGF標準品的生物學活性。本發明採用競爭抑制的流式細胞法測定重組人表皮生長因子的生物學活性具有步驟簡便、準確度高、質量更可控等優點。
圖1、EGF樣品與EGF標準品的量效曲線圖2、70% R-100% R-150% R流式細胞法驗證第一次試驗四參數曲線(尼妥珠單抗)圖3、EGF組分1與EGF組分2的量效曲線
具體實施例方式以下是本發明的非限定實施例，將有利於本領域的普通技術人員進一步理解本發明。實施例1重組人表皮生長因子活性測定方法採用人肺腺癌細胞H-125細胞系(來自古巴分子免疫學中心)測定EGF活性的方法包括如下步驟(1)細胞培養實驗室培養一定量的H-125細胞，細胞活力一般應不小於70 %。4°C、 IlOOrpm下離心5分鐘。小心倒掉上清液，利用剩餘的少量液體將細胞沉澱溶解，然後緩慢加入IOmL左右PBS，混勻。再次在4°C、1 IOOrpm下離心5分鐘，小心倒掉上清液，利用剩餘的少量液體將細胞沉澱溶解，緩慢加入IOmL左右PBS，混勻。4°C、1 IOOrpm下離心5分鐘後， 小心倒掉上清液，利用剩餘的少量液體將細胞沉澱溶解，用PBS調整H-125細胞系的細胞懸濁液至濃度為5X106 IOXlO6個/mL。(2)製備50 μ g/mL和100 μ g/mL的尼妥珠單抗溶液，用100 μ g/mL的尼妥珠單抗溶液將50 μ g/mL的EGF樣品或標準品稀釋至25 μ g/mL EGF (含50ug/mL尼妥珠單抗)，然後用50ug/mL尼妥珠單抗溶液向下倍比稀釋10個稀釋度。(3)各離心管加入20 μ L相對應的樣品溶液50ug/mL尼妥珠單抗溶液、25 μ g/mL EGF(含50ug/mL尼妥珠單抗)以及其向下的10個倍比稀釋液。4°C、IlOOrpm下離心1分鐘，4°C下待用(待用時間小於4小時)。(4)向已有20μ L樣品溶液的離心管中加入25μ L細胞懸濁液，用槍頭重複吸取混勻。4 °C下保溫30分鐘。(5)向每個離心管中加入700 μ LPBS，4°C、IlOOrpm下離心4分鐘。(6)小心去除上清液，在旋渦振蕩器上輕輕振蕩。向每個離心管中加入20μ L抗人FITC(DAK0 F0056)稀釋溶液(稀釋比1 30)，用槍頭重複吸取混勻。4°C下保溫30分鐘。(7)向每個離心管中加入700 μ LPBS，4°C、IlOOrpm下離心4分鐘。(8)小心去除上清液，在旋渦振蕩器上輕輕振蕩。然後向每個管中加入500yL 多聚甲醛PBS。用H-125細胞系的特定程序(Guava Express Plus)讀取流式細胞儀中
樣品的數據(所選定區域的平均螢光強度)。(9)數據處理採用電腦程式(四參數回歸)進行處理，然後分別獲得EGF標準品和樣品的半數有效抑制濃度(EC5tl)，從而獲得EGF樣品相對於EGF標準品的相對生物學活性。其量效曲線見圖1。優選的是步驟(1)中細胞懸濁液的濃度為7xl06個/mL。進一步優選的是步驟(3)與EGF競爭抑制EGFR的初始飽和尼妥珠單抗濃度為 50 μ g/mL。進一步優選的是，步驟(9)中包括利用GraphPad Prism軟體(四參數回歸)進行處理，根據2010年版中國藥典二部附錄生物檢定法中量反應平行線原理推定EGF樣品與 EGF標準品具有相同的最大值、最小值和斜率，然後分別獲得EGF標準品和樣品的半數有效抑制濃度(EC5tl) (EC50與生物學活性成反比)，從而獲得EGF樣品相對於EGF標準品的相對生物學活性，根據EGF標準品的生物學活性(IU/mL)，可計算出EGF樣品的生物學活性(IU/ mL) ο實施例2流式細胞法測定表皮生長因子生物學活性的可重複性使用相同流式細胞法測定尼妥珠單抗相對生物學結合活性的方法學驗證中採用人肺腺癌細胞H-125細胞系(來自古巴分子免疫中心)測定尼妥珠單抗相對生物學活性的方法包括如下步驟
(1)製備50 μ g/mL尼妥珠單抗參考品稀釋液和樣品稀釋液，然後用單抗稀釋液向下稀釋8個稀釋度至0. 050 μ g/mL ；(2)各離心管加入20 μ L不同濃度的的參考品稀釋液和樣品稀釋液，後續步驟同實施例1 ；(3)數據處理採用電腦程式(四參數回歸)進行處理，然後分別獲得尼妥珠單抗參考品和樣品的半數有效結合濃度(EC5tl)，從而獲得尼妥珠單抗樣品相對於尼妥珠單抗參考品的相對生物學活性。在該流式細胞儀法測定生物學活性的方法學驗證中(1)準確性使用參考品自身為對照，測定70% RU50% R和100% R時相對於參考品R的生物學活性，相對誤差絕對值應不大於10%。
權利要求
1.一種重組人表皮生長因子生物學活性測定方法，採用抗人表皮生長因子受體單克隆抗體與重組人表皮生長因子一起競爭性結合特定細胞的細胞膜表面的表皮生長因子受體， 在流式細胞儀上採用特定的程序和選擇特定的細胞區域獲得各個樣品的平均螢光強度值， 其特徵在於，該方法包含如下步驟1)、在適合的條件下培養特定腫瘤細胞；2)、將EGF樣品和EGF標準品稀釋到飽和濃度的抗人表皮生長因子受體的單克隆抗體中，與1)中的細胞反應；3)、離心倒掉上清液，重新懸浮細胞，加入一個螢光素標記的第二單抗，反應15-60分鐘；4)、檢測細胞平均螢光強度，通過數據處理計算EGF樣品生物學活性。
2.根據權利要求1所述的重組人表皮生長因子生物學活性測定方法，其特徵在於，所述步驟1)中的特定腫瘤細胞為中度或高度表達表皮生長因子受體的人細胞；所述特定腫瘤細胞用PBS調整後的懸濁液的濃度為7X106個/mL。
3.根據權利要求2所述的重組人表皮生長因子的生物學活性測定方法，其特徵在於， 所述的特定腫瘤細胞優選為人肺腺癌細胞H-125細胞系、A431、DiFi的任意一種。
4.根據權利要求3所述的重組人表皮生長因子的生物學活性測定方法，其特徵在於， 所述的特定腫瘤細胞更優選為人肺腺癌細胞H-125細胞系。
5.根據權利要求1所述的重組人表皮生長因子的生物學活性測定方法，其特徵在於， 所述步驟幻中的抗人表皮生長因子受體的單克隆抗體可以是尼妥珠單抗或西妥昔單抗； 所採用的尼妥珠單抗抗體濃度優選為50ug/mL。
6.根據權利要求1所述的重組人表皮生長因子的生物學活性測定方法，其特徵在於， 所述步驟3)中的反應時間優選為30分鐘。
7.根據權利要求1所述的重組人表皮生長因子生物學活性測定方法，其特徵在於所述步驟4)為離心倒掉上清液，重新懸浮細胞，加入一定量的多聚甲醛PBS，在流式細胞儀上採用特定的程序和選擇特定的細胞區域獲得各個樣品的平均螢光強度值，試驗數據採用電腦程式GraphPad Prism軟體(四參數回歸)進行處理，分別獲得EGF標準品和樣品的半數有效濃度(EC5tl)，從而獲得EGF樣品相對於EGF標準品的相對生物學活性，根據EGF 標準品的生物學活性(IU/mL)，可獲得EGF樣品的生物學活性(IU/mL)。
8.權利要求1-7任一所述的重組人表皮生長因子的生物學活性測定方法在重組人表皮生長因子或其衍生物質控中的應用。
全文摘要
本發明公開了重組人表皮生長因子(rhEGF)的生物學活性測定方法及其應用。該方法採用競爭性抑制的流式細胞法，通過抗體阻斷EGF和其受體的結合來間接測定EGF與EGFR結合的生物學活性，採用電腦程式(四參數回歸)處理試驗數據，分別獲得EGF標準品和樣品的半數有效抑制濃度(EC50)，從而獲得EGF樣品的相對生物學活性，根據EGF標準品的生物學活性(IU/mL)，可計算出EGF樣品的生物學活性。本發明除預先培養細胞外，從樣品加入開始，試驗周期僅為1天，試驗過程中無需無菌環境，與《中國藥典》中的重組人表皮生長因子生物學活性測定方法相比，實施更方便，質量更可控。
文檔編號G01N33/577GK102262155SQ20111009060
公開日2011年11月30日 申請日期2011年4月12日 優先權日2011年4月12日
發明者何偉, 喻志愛, 李先鍾, 林峰, 白先宏 申請人:百泰生物藥業有限公司