用於自動檢測蛋白質的生物兼容支架材料的製作方法

2023-07-01 07:44:11

專利名稱：用於自動檢測蛋白質的生物兼容支架材料的製作方法
技術領域：
本發明一般涉及生物傳感器，更具體地說，涉及一種生物兼容納米絲 (nanowire)支架材料，該支架材料適用於檢測生物分析物中的一種或多種蛋白 並可用於支撐細胞生長。
背景技術：
在生物支架材料的微米大小的孔中，某些蛋白(像生長激素GH)的活性 對於組織再生來說是至關重要的[l]，這些組織包括神經細胞組織[2]和骨組織 [3， 4]。然而，監測和檢測生物支架材料內的蛋白活性仍然面臨挑戰。要發展 一種可以接受該挑戰的簡單經濟的電化學蛋白傳感器，蛋白和固體電極表面之 間快速的電子轉移是必要條件。然而，基於多肽-和/或聚合物的生物支架材料 通常電導率較低。
氧化還原蛋白，如血紅素蛋白，自帶有電化學活性，並因此能夠直接與 工作電極交換電子以產生電化學信號。這使得無需介導方法(如通過酶介導反 應)就可直接電化學檢測和定量。
通常，需要依靠實驗室分析技術來定量氧化還原蛋白，如通過連接到包 括在不同電位的一系列多孔電極的檢測器上的高性能液體色譜。雖然該系統是 非常精確的，但是實驗所需的空間和費用使得其不適合大規模的樣本檢測或國 內消費者使用。此外，生物樣品一般必須經過昂貴的預處理使其成為可以被 HPLC分析的形式。
這樣，用於定量氧化還原蛋白的生物傳感器件雖然不夠精確，發展一種 便於攜帶、 一次性的並且能夠分析最簡預處理後的生物樣品的生物傳感器件， 從而在多路實時且無需實驗室檢測蛋白的方面對現有技術進行改進，引起了人
7們的極大興趣。
因此，直到現在，上述缺陷和不足在本領域中仍然存在，並且需要解決。

發明內容
在一個方面，本發明涉及一種生物兼容支架材料。
在一個實施例中，所述生物兼容支架材料包括基體、在所述基體上形成的 含Ti02的納米絲或納米纖維導電層，在此所述含Ti02的納米絲或納米纖維導 電層是以孔結構形成的，且當所述生物兼容支架材料與生物分析物接觸時，所
述生物分析物的一種或多種蛋白將固定在所述含Ti02的納米絲或納米纖維導
電層的表面上，進而生成可測量的感應電流信號。
所述含Ti02的納米絲或納米纖維主要是Ti02-B相或鈦酸鹽相的，並且具 有的典型直徑範圍約為20-150nm。
在一個實施例中，所述孔結構的厚度範圍約為l-50pm。所述納米絲或納 米纖維結構可具有分層鈦酸鹽(Na2Tl307)結構，該結構在其夾層間具有對衝 陽離子(counter-cations) (Na+)。該基體由氧化銦錫(ITO)或金屬構成。
在一個實施例中，所述蛋白包括具有氧化還原活性中心的蛋白。所述氧化 還原活性血紅素蛋白包括細胞色素c。
所述基體可以是導體或是半導體。在一個實施例中，所述基體由氧化銦錫 (ITO)構成。
在另一方面中，本發明涉及生物兼容支架材料。在一個實施例中，該生物 兼容支架材料具有基體，以及在該基體上形成的納米絲或納米纖維層。
形成的納米絲或納米纖維層具有孔結構。該納米絲或納米纖維包括含氧化 物的納米絲或納米纖維。在一個具體實施例中，所述納米絲或納米纖維包括含 Ti02的納米絲或納米纖維。
在另一方面中，本發明涉及一直用於檢測生物分析物中一種或多種蛋白的 生物傳感器。在一個實施例中，該生物傳感器包括具有表面的基體，在所述基 體的表面上形成的納米絲或納米纖維層，在此形成的該納米絲或納米纖維層具 有孔結構，所述生物傳感器還包括與該基體通信的檢測器，在此當納米絲或納米纖維的層與生物分析物的一種或多種蛋白接觸時，將生成可測量信號並可由 該檢觀lj器檢測。
該生物傳感器進一步包括用於以約0.005-0.500V/s的掃描速率範圍將電壓 施加到生物分析物的器件。在一個實施例中，所述檢測器包括循環伏安掃描儀 (cyclic voltammetry)。當納米絲或納米纖維形成的層與生物分析物中的一種 或多種蛋白接觸時，生物分析物和基體之間的一種或多種電子轉移將產生感應 電流形式的可測量信號。
在一個實施例中，所述生物分析物中的一種或多種蛋白包含氧化還原活性 血紅素蛋白。所述氧化還原活性血紅素蛋白包括細胞色素c。該生物分析物包 括pH範圍約為6.2-9.0的緩衝溶液，這樣細胞色素c和納米絲或納米纖維分別 攜帶淨正電荷和淨負電荷。
所述納米絲或納米纖維是含氧化物的納米絲或納米纖維。在一個實施例 中，該納米絲或納米纖維是含Ti02的納米絲或納米纖維。在此，該含Ti02的 納米絲或納米纖維主要是Ti02-B相或鈦酸鹽相。在一個實施例中，所述納米 絲或納米管的典型直徑範圍約為20-150nm。
在一個實施例中，所述基體由氧化銦錫(ITO)構成。所述基體可以是導 體或半導體。
在另一方面中，本發明涉及用於檢測生物分析物中一種或多種蛋白的方 法。在一個實施例中，所述方法包括提供具有至少一個電極和由納米絲或納米 纖維構成的支架材料的生物傳感器的步驟，將所述生物分析物導入到所述支架 材料中的步驟，以及檢測生物分析物和所述支架材料的表面之間的電子轉移， 以檢測生物分析物中一種或多種蛋白的步驟。在一個實施例中，所述檢測步驟 由CV來完成。
所述方法進一步包括以約0.005-0.500V/s的掃描速率範圍將電壓施加到生 物分析物的步驟。
在一個實施例中，所述生物分析物包含氧化還原活性血紅素蛋白。所述氧 化還原活性血紅素蛋白包括細胞色素c。
該生物分析物包括pH範圍約為6.2-9.0的緩衝溶液，這樣細胞色素c和納米絲或納米纖維分別攜帶淨正電荷和淨負電荷。 '
通過以下的描述、具體實施例，再結合附圖，可以更深入地理解本發明的 各個方面。可對這些特徵和實施例進行各種改變或等效替換而不超出本發明的 保護範圍。


附圖例示了本發明的一個或多個實施例，並與相關描述一起說明了本發明 的原理。在任何可能的情況下，附圖中同一個附圖標記在各幅附圖中用於表示 一個實施例中相同的部件或功能相似的部件，其中
圖1示意性地示出了根據本發明的實施例的生物傳感器；
圖2分別示出了根據本發明的實施例在約180°C的溫度條件下耗時約三天 合成的鈦酸鹽納米絲(NW)支架材料的表徵圖，(a)鈦酸鹽NW支架材料的 SEM圖，(b)鈦酸鹽NW支架材料的TEM圖，(c)鈦酸鹽NW支架材料的XRD 圖，在此，i亥鈦酸鹽相為2e=9.8°(001), 11,2°(200), 24.4。(110)和29.7。(003) (JCPDScardNo.:47-0561)，以及(d) FT-IR光譜，在此，曲線210是固定到鈦酸 鹽-NW支架材料上的細胞色素c的FT-IR光譜，其中所述細胞色素c混合了 KBr，且曲線220是pH 6.8的緩衝溶液中的細胞色素c的FT-IR光譜；
圖3示出了圖2中示出的鈦酸鹽NW支架材料的表徵(陽極電流，ipa，以 及陰極電流ipe)， (a)覆蓋鈦酸鹽NW的ITO玻璃電極在pH6.8的緩衝溶液中的 CV曲線(曲線330a用於"，曲線330c用於ipe)以及在鈦酸鹽NW上固定有 450皮摩的細胞色素c的ITO玻璃電極在pH6.S的緩衝溶液中的CV曲線(曲 線340a用於ipa，曲線340c用於ipe),在此掃描速率約為0.2V/s; (b)各種濃度的 細胞色素c在pH6.8的緩衝溶液中的CV曲線，其中曲線351 a是45皮摩的ipa， 曲線352 a是122皮摩的ipa，曲線353 a是243皮摩的ipa,曲線354 a是347 皮摩的ipa，曲線355a是450皮摩的ipa，且在此掃描速率約為0.2V/s; (c)細 胞色素c濃度和陽極電流ipj勺線性關係；以及(d)在鈦酸鹽NW支架材料上 培養72小時後，在鈦酸鹽NW支架材料上生長的PC-12細胞的SEM圖4示出了圖2中示出的鈦酸鹽NW支架材料的表徵，(a)在鈦酸鹽NW支架材料上培養72小時後，在鈦酸鹽NW支架材料上生長的PC-12細胞的 SEM圖；以及(b)固定在鈦酸鹽NW支架材料上的細胞色素c在不同的電位掃
描速率和pH值的CV曲線；
圖5示出了根據本發明的一個實施例的NW支架材料的表徵；
圖6示出了根據本發明的一個實施例的NW支架材料的表徵。
具體實施例方式
在本發明的上下文中，在本發明中使用這些術語的特定上下文中，本說明 書中使用到的術語具有其在本領域中的通用含義。
以下或是在本說明書的其它位置，對某些用於描述本發明的術語進行了討 論，以便在對本發明的裝置和方法的描述中，以及對這些裝置和方法的製造和 使用中向技術人員提供附加的指導。為了便於閱讀，對某些術語進行了標記， 比如採用斜體和/或引號。這些標記的使用並不影響該術語的範圍和意義，該 術語的範圍和意義是相同的，在同一部分中，無論該術語是否被標記，其含義 是一樣的。應了解，同一事件可以有多種說法。因此，可將替換用語和同義詞 用於此處所討論的任意一個或多個術語，無論一個術語是製備的還是此處討論 過的，其並不具備任何特殊的含義。還提供了某些術語的同義詞。 一個或多個 同義詞的敘述並不排除其它同義詞的使用。在本發明中使用的實施例(包括任 何此處討論的術語的例子)，僅僅是用於示例性的，並不用於限制本發明的範 圍和含義或是任何例舉出的術語。同樣的，本發明並不限於說明書中給出的實 施例。此外，小標題可用於幫助說明書的讀者通讀整個說明書，然而小標題的 使用並不影響本發明的範圍。
如此處使用的，"大約"或"近似" 一般指給定值或範圍的20個百分點內， 優選10個百分點內，最佳是位於5個百分點以內。此處給出的數量是近似的， 意味著如果沒有清楚地表述，術語"大約"或"近似"可以進行推導。
如此處使用的，術語"等電位點"或其縮寫"pl"是指分子或表面不攜帶 淨電荷的pH。為了具有更靈敏的pl，分子(或表面)必須是兩性的，意指其 必須具有酸性和鹼性基團。蛋白和胺基酸是符合這一要求的常見分子。.'蛋白可通過已知的等電聚焦過程根據其等電位點進行分離。在低於pi的 pH，蛋白可攜帶淨正電荷。高於pl，其可攜帶淨負電荷。這意味著可跑電泳 凝膠。電泳凝膠的pH可由該凝膠使用的緩衝溶液來確定。如果該緩衝溶液的 pH高於蛋白的pI，該蛋白將移動到正極(負電荷將吸引到正極)。如果該緩衝 溶液的pH低於蛋白的pI,該蛋白將移動到負極(正電荷將吸引到負極)。如 果蛋白是在pH值等於其pi的緩衝溶液中跑電泳的，其將不會移動。
如此處使用的，術語"循環伏安法"或其縮寫"CV"是指一種類型的動 電位電化學測量法。為了獲得循環伏安，可測量溶液中的電壓變化和電流隨著 電壓變化而產生的變化。這是研究化學和界面結構的氧化還原性質的伏安法中 的一種特定類型。
在循環伏安實驗中，將電位施加到系統中，且測量感應電流響應(感應電 流是氧化還原反應產生的電流)。可測量一定電位範圍內的該電流響應(電位 窗口)，該電壓範圍起於一個起始值，並以線性方式變化到一個預定限值。在 這一電位(通常稱為切換電位(switchingpotential)),電位掃描的方向反轉， 且同時反向掃描同一電位窗口。這意指，例如在第一次(正向)掃描氧化形成 的元素將在第二次(反向)掃描時被還原。這一技術常常使用，因為其提供了 用於初始表徵氧化還原活性系統的快速且簡單的方法。其除了還可提供氧化還 原電位估計外，還可提供電極和分析物之間電子轉移的速率信息，以及分析物 在電解氧化狀態的穩定性(例如，如果其經歷任何化學反應)。
本發明的整體觀點
生物兼容支架材料對組織再生是很重要的[l]，如骨組織[3, 4]在蛋白如生 長激素的誘導下再生。為了檢測生物兼容支架材料中蛋白的活性，需要發展一 種電化學蛋白傳感器，其具有能夠在蛋白和傳感器電極之間實現快速電子轉移 的支架。然而，基於多肽-和/或聚合物的生物支架材料通常電導率較低。
固體納米絲(NW)被認為是可用於檢測單個病毒[5]。其中，基於Ti02 的NW製作成本低、生物兼容性高、化學和光化學性能穩定，且蛋白變性小， 因此被廣泛應用[6-8]。例如，血紅素蛋白可以被固定到Ti02納米顆粒和納米
12管上'(NT) [9-14]。
除此之外，本發明還公開了鈦酸鹽-NW生物兼容支架材料，其在氧化銦 錫(ITO)基體(電極)的表面上彼此纏繞。鈦酸鹽-支架材料用作生物傳感器， 或至少是生物傳感器的一部分，用於檢測預固定在鈦酸鹽-NW表面的細胞色 素c (cytc)的電化學氧化還原電位。另外，鈦酸鹽-NW支架材料可用於支持 嗜鉻細胞瘤細胞(PC-12)的生長。
將結合本發明的實施例和附圖l-6進行描述。根據本發明的目的，如在此 的具體和概括描述，在本發明的一個方面，涉及用於自動檢測生物分析物中的 蛋白以及支持和引導幹細胞生長的生物兼容支架材料。
所述生物兼容支架材料包括基體、在所述基體上形成的含Ti02的納米絲 或納米纖維導電層。該基體可以是導體或半導體。在一個實施例中，所述基體 由氧化銦錫(ITO)構成。在此所述含Ti02的納米絲或納米纖維導電層是以孔 結構形成的，該孔結構的厚度範圍為l-50pm。該孔結構可具有分層鈦酸鹽 (Na2Ti307)結構，該結構在其夾層間具有對衝陽離子(counter-cations) (Na+)。 所述含Ti02的NW主要是Ti02-B相或鈦酸鹽相的，並且具有的典型直徑範圍 約為20-150nm。
其它含層間陽離子的NW也可用於實現本發明。
當所述生物兼容支架材料與生物分析物接觸時，所述生物分析物的一種或 多種蛋白將固定在所述含Ti02的納米絲或納米纖維導電層的表面上，在此可 在生物分析物和含Ti02的納米絲或納米纖維導電層表面之間將出現電子轉移。 該電子轉移將生成可測量的感應電流信號。
該生物兼容支架材料可用於檢測生物分析物中的氧化還原活性血紅素蛋 白。細胞色素c (cytc)是氧化還原活性的血紅素蛋白，其具有104個胺基酸， 且作為電子傳送鏈中的電子載體位於線粒體的內膜空間。其為可溶性蛋白，且 能夠經受氧化和還原，但不能結合氧原子。在pH範圍約為6.2-9.0的緩衝溶液 中，細胞色素c攜帶淨正電荷，而納米絲或納米纖維攜帶淨負電荷。當細胞色 素c固定在含Ti02的NW支架材料的表面時，細胞色素c和NW支架材料之 間的一種或多種電子轉移將以感應電流的形式產生可測量信號。這可由循環伏
13安法(CV)檢測。也可採用其它的蛋白來實現本發明。參照圖1，示出了根據本發明的一個實施例的生物傳感器ioo，該生物傳感 器100使用NW支架材料120來檢測生物分析物中的一種或多種蛋白。生物傳感器100具有基體100，該基體100具有表面112，由NW在基體 100的表面112上形成的支架材料120，以及與所述基體110通信的檢測器未 示出(未示出)。在運行中，NW支架材料120與含氧化還原活性血紅素蛋白 130和緩衝溶液的生物分析物接觸。該緩衝溶液的pH範圍約為6.2-9.0。該氧 化還原活性血紅素蛋白，如cytcl30，固定在NW120的表面。cytc在NW支 架材料上的結合主要歸咎於負電荷NW表面和正電荷cyt c表面之間的靜電交 互。在pH6.2-9.0，由於其等電位點為6.2， NW表面是負電荷[21]，然而由於 其等電位點為10.0-10.5， cytc表面是正電荷。這樣，負NW表面示出對正cyt c的高吸引力。此外，cytc在水中的形狀是近似球形的((a*b*c=1.5nm* 1.7 nm* 1.7nm)[22])，這樣，cyt c可易於固定在NW支架材料的空處(直徑>500 nm)以在電化學氧化還原過程中進一步增強cytc的停留。另外生物傳感器100還可包括用於以約0.005-0.500V/s的掃描速率將電位 施加到生物分析物中的器件(未示出)。與基體110通信的檢測器可用於檢測 生物分析物和基體110的表面112之間的電子轉移。該檢測器包括CV。該電 子轉移可以感應電流ip的形式測得。生物分析物中是否有蛋白和/或其量可以 由感應電流ip確定。NW支架材料可用於支持細胞，如嗜鉻細胞瘤細胞(PC-12)的生長。在 一個實施例中。該NW支架材料至少部分覆蓋了大量生物分子，包括生長激 素。本發明的另一方面涉及用於檢測生物分析物中一種或多種蛋白的方法。在 一個實施例中，所述方法包括下列步驟，首先提供生物傳感器，該生物傳感器 具有電極和在該電極上由NW形成的支架材料。接著將所述生物分析物導入 到所述支架材料中。接著採用CV檢測生物分析物和所述基體表面之間的電子 轉移，該CV用來檢測生物分析物中是否有蛋白和/或其量。下面對本發明的這些和其它方面做進一步地說明。本發明的實現和實施例 、下面示出了根據本發明的實施例的典型方法和其相關結果，這些實施例並 不是用於限制本發明的範圍。應注意，在實施例中用到的標題或小標題都是為 了方便讀者，並不是以任何方式限制發明的範圍。此外，自此提到並公開了一 些理論，然而無論這些理論正確與否，都不是以任何方式限制本發明的範圍， 這樣可完全根據本發明的描述實施本發明而無需考慮任何特定的理論或動作 安排。實施例用於直接自動檢測蛋白的生物兼容支架材料在該典型實施例中，鈦酸鹽-NW纏繞在ITO基體的表面形成支架材料， 其可用於監測預固定在鈦酸鹽-NW表面的細胞色素c的電化學氧化還原電位。 該鈦酸鹽-NW在約24(TC的溫度條件下耗時約三天合成。圖2a和2b分別示出了鈦酸鹽-NW支架的掃描電鏡圖(SEM)和透射電 子顯微鏡圖(TEM)。圖2c中示出了鈦酸鹽-NW支架的粉末X射線衍射圖。 該X射線衍射清楚顯示了 NW的晶體結構屬於鈦酸鹽相(也就是，Na2Ti307)， 其由下列晶格參數表徵[26=9.8°(001), 11.2。(200), 24.4°(110)和29.7°(003) (JCPDScard No.:47-0561)]。該邊緣共享(edge-shared)的Ti06-八面體是形成 該負電荷分層鈦酸鹽結構的基本單元[15]，該分層鈦酸鹽結構具有位於內層空 間中的鈉對衝陽離子(Na+),這樣將導致根據陽離子的大小和水合度形成可變 的層間距。因此，該鈦酸鹽NW支架材料具有孔結構，如圖2a和2b所示。在 採用去離子蒸餾水(DDW接近pH接近7)洗滌以後，該鈉對衝陽離子可由質 子取代。通常，風乾的NW^支架材料的阻抗高於106011111，這並不適用於電化學自 動檢測。然而，NW表面上的羥基(-OH) [4]在pH6.2-9的緩衝溶液中將在水 -NW界面[16]處產生溼電子的效果，以在NW表面上形成用於快速ET的低-能量路徑，這將確保信號轉換能夠在生物傳感中跨越整個生物兼容的支架材料 進行。換句話說，在緩衝溶液中，鈦酸鹽NW的表面可以是負電荷的並形成 Ti-OH[4]。水和氧化金屬之間的界面可生成溼電子[16]，因此鈦酸鹽NW的導 電性得到改進。具有104個胺基酸，且作為電 子傳送鏈中的電子載體位於線粒體的內膜空間。為了檢驗在結合到負電荷表面以後，cytc在是否不再穩固[17-19]，可使用傅立葉轉換紅外光譜(FT-IR)以 表徵蛋白中對多肽構造敏感的氨基基團。通常，由於沿著蛋白主鏈的CO基 團的伸縮振動，所述氨基I信號主要在1600-1700cm"。圖2d示出了FT-IR光 譜，其中曲線210是混合KBr的細胞色素c-鈦酸鹽NW的FT-IR光譜，曲線 220是在pH6.8緩衝溶液中的細胞色素c的FT-IR光譜。該FT-IR光譜示出在 NW上固定的cyt c的氨基I的峰值為1648cm"，這與從pH6.8的緩衝溶液中 天然cyt c獲得的一樣[20]，示出了固定到鈦酸鹽-NW支架材料上的cyt c的殘 留二級結構(retained secondary structure )。鈦酸鹽NW支架材料..t結合的cyt c主要歸咎於負電荷NW表面和正電荷 cytc表面之間的靜電交互。在pH6.2-9.0，由於其等電位點為6.2， NW表面是 負電荷[21]，然而由於其等電位點為10.0-10.5， cytc表面是正電荷。這樣，負 NW表面示出對正cytc的高吸引力。此外，cytc在水中的形狀是近似球形的 (a*b*c= 1.5nm* 1.7 nm* 1.7nm)[22p，這樣，cyt c可易於固定在支架材料 的空處(直徑〉500nm)以在電化學氧化還原過程中進一步增強cyt c的停留。NW支架材料為cyt c提供了理想的環境以進行敏捷的電子轉移反應。在 該典型實施例中，可通過CV在不同的濃度下研究固定有細胞色素c的NW的 表面電化學特性，其指示出cytc的45皮摩(或10—12摩爾)的檢測限制。圖3a分別示出了從覆蓋有NW(信號330a用於陽極電流ipa，且信號330c 用於陰極電流ipe)和cyt c-NW的ITO玻璃電極在pH=6.8的磷酸鉀緩衝溶液 中的CV信號(信號340a用於陽極電流—，且信號340c用於陰極電流ipc)。 掃描速率約為0.2V/s。己經通過cyt c-NW電極記錄到了一對具有表觀峰值電 位(EQ)的可逆並且清晰的氧化還原峰。該E。值(0.03V)，從陽極峰電位值 和陰極峰電位值計算的均值，與Stellwagen [23]的報導接近。基於其結構和形 態，NW表現為導電"納米纜"[16]以便於電子轉移。作為掃描速率的感應電流的測量可用於診斷電極表面是否有由擴散控制 的氧化還原反應。該陽極和陰極峰值均與從O.Ol V/s到0.2 V/s的掃描速率線性相關，這意味著這樣一個電極具有典型的薄層電化學特徵[24]。 1pe和ipJ勺七匕例約為2.0，且氧化還原峰值的間隔約為58 mV(數據未示出)，這意味著cyt c-NW電極表面上的電化學過程可以是準可逆的[24]。如圖3b所示，在pH6.8的緩衝溶液中，該感應電流隨著支架材料中的cyt c的濃度線性增加，在此信號351a是45皮摩的"，信號352 a是122皮摩的 ipa，信號353 a是243皮摩的"，信號354 a是243皮摩的ipa，信號355a是 347皮摩的ipa，且在此掃描速率約為0.2V/s。該可逆的且清晰的CV信號可以 在3.0|iM和30.0的之間，或45到450皮摩之間的15pL的溶液中觀察到。 這些濃度可以與陽極電流完全線性相關(R=0.9887)的，如圖3c所示。其結果顯示這樣一種鈦酸鹽NW修飾的ITO電極可以用作多元自動檢測 平臺，用於發展穩健的、靈敏的、經濟的納米生物傳感器。另外，該NW支架材料也可用於支持和引導嗜鉻細胞瘤細胞(PC-12)的 生長，在此有利於細胞活性。圖3d和4a是在NW支架材料上培養約72小時 的PC-12細胞的SEM圖，示出了 PC-12細胞良好地附著在NW支架材料上並 且在該材料上形成細胞群。這些細胞在外形上表現為圓形，並維持其形態，這 意味著細胞和NW支架材料之間有良好的兼容性。附著在鈦酸鹽NW支架材 料上的PC-12細胞進一步意味著吸附的蛋白並沒有喪失任何活性。圖4b示出了固定在NW支架材料薄膜上的蛋白細胞色素c在不同電位掃 描速率和pH值的CV信號。在6.8-9.0的pH範圍內，可獲得45皮摩的細胞 色素c的可重複檢測下限，這顯示了在鈦酸鹽NW修飾的ITO電極上的細胞 色素c的直接電子轉移被大大增強。NW上的細胞色素c的均勻電位取決於pH 變化。其結果為在陶瓷納米絲表面上功能化製作基於NW吸引力-特定生物納 米傳感器提供了新的見解，並可產生用於發展穩健的、靈敏的、經濟的納米生 物傳感器的多元自動檢測平臺。圖5和6是根據本發明的其它實施例的NW支架材料的CV信號。簡而言之，本發明，除其它外，公開了一種生物兼容的鈦酸鹽NW支架 材料，以及一種基於鈦酸鹽NW支架材料的生物傳感器。該鈦酸鹽NW支架 材料增強了 ITO電極和cyt c之間的電子轉移。該基於鈦酸鹽NW支架材料的17生物傳感器可應用於在基於鈦酸鹽NW支架材料的受限環境中實時對固定的 氧化還原活性蛋白進行直接檢測，以及監測在幹細胞的生長過程中的生物化學 過程。
上述對本發明的優選實施例的描述的目的是為了舉例說明及描述。這些實 施例不是窮盡性的，也就是說本發明不受所公開的精確形式的限帶]，在本發明 的教導下或從本發明的實踐中可以獲得對這些實施例的多種修改和變化。
對實施例的選擇和描述是為了對本發明的原理及其實際應用做出解釋，以 使本領域的技術人員能夠在各種實施例中利用本發明、以及為配合特殊用途進 行各種修改。本領域技術人員清楚在不脫離本發明的原理和範圍內的替換實施 例。因此，本發明的範圍由本發明的權利要求及其等同限定的，而不是前面的 描述和此處描述的典型實施例。參考文獻. Murugan， R.; Ramakrishna, S. Hs艦五wg. 2006, 12， 435.
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權利要求
1、一種生物兼容支架材料，包括a.基體；以及b.在所述基體上形成的含TiO2的納米絲或納米纖維導電層，其特徵在於，所述含TiO2的納米絲或納米纖維導電層是以孔結構形成的，且當所述生物兼容支架材料與生物分析物接觸時，所述生物分析物的一種或多種蛋白將固定在所述含TiO2的納米絲或納米纖維導電層的表面上，進而生成可測量的感應電流信號。
2、 根據權利要求1所述的生物兼容支架材料，其特徵在於，所述蛋白包 括氧化還原活性血紅素蛋白。
3、 根據權利要求2所述的生物兼容支架材料，其特徵在於，所述氧化還 原活性血紅素蛋白包括細胞色素c。
4、 根據權利要求1所述的生物兼容支架材料，其特徵在於，所述孔結構 的厚度範圍約為l-50^im。
5、 根據權利要求1所述的生物兼容支架材料，其特徵在於，所述含Ti02 的納米絲或納米纖維主要是Ti02-B相或鈦酸鹽相。
6、 根據權利要求5所述的生物兼容支架材料，其特徵在於，所述含Ti02 的納米絲或納米纖維具有的典型直徑範圍約為20-150nm。
7、 根據權利要求5所述的生物兼容支架材料，其特徵在於，所述孔結構 包括分層鈦酸鹽結構(Na2Ti307)，其夾層間具有對衝陽離子(Na+)。
8、 根據權利要求1所述的生物兼容支架材料，其特徵在於，所述基體由 氧化銦錫(ITO)構成。
9、 根據權利要求1所述的生物兼容支架材料，其特徵在於，所述基體是 導體、半導體或絕緣體。
10、 一種生物兼容支架材料，其特徵在於，包括a. 基體；以及b. 在該基體上形成的納米絲或納米纖維層，其中，形成的納米絲或納米纖維層具有孔結構。
11、 根據權利要求10所述的生物兼容支架材料，其特徵在於，所述納米 絲或納米纖維包括含氧化物的納米絲或納米纖維。
12、 根據權利要求11所述的生物兼容支架材料，其特徵在於，所述納米絲或納米纖維包括含Ti02的納米絲或納米纖維。
13、 根據權利要求11所述的生物兼容支架材料，其特徵在於，所述納米 絲或納米纖維包括含ZnO的納米絲或納米纖維。
14、 用於檢測生物分析物中一種或多種蛋白的生物傳感器100，包括a. 具有表層112的基體110;b. 在所述基體110的表面112上形成的納米絲或納米纖維層120，在此形 成的所述納米絲或納米纖維層具有孔結構；以及c. 與所述基體110通信的檢測器140，當納米絲或納米纖維構成的層120 與生物分析物的一種或多種蛋白接觸時，將生成可測量信號並可由所述檢測器 140檢測。
15、 根據權利要求14所述的生物傳感器，其特徵在於，所述一種或多種 蛋白包括氧化還原活性血紅素蛋白。
16、 根據權利要求15所述的生物傳感器，其特徵在於，所述氧化還原活 性血紅素蛋白包括細胞色素c。
17、 根據權利要求16所述的生物傳感器，其特徵在於，所述生物分析物 包括pH範圍約為6.2-9.0的緩衝溶液，這樣細胞色素c和納米絲或納米纖維分 別攜帶淨正電荷和淨負電荷。
18、 根據權利要求14所述的生物傳感器，其特徵在於，所述納米絲或納 米纖維的典型直徑範圍約為20-150 nm。
19、 根據權利要求18所述的生物傳感器，其特徵在於，所述納米絲或納 米纖維包括含氧化物的納米絲或納米纖維。
20、 根據權利要求19所述的生物傳感器，其特徵在於，所述納米絲或納 米纖維包括含Ti02的納米絲或納米纖維。
21、 根據權利要求20所述的生物傳感器，其特徵在於，所述含Ti02的納米絲或納米纖維主要是Ti02-B相或鈦酸鹽相。
22、 根據權利要求19所述的生物傳感器，其特徵在於，所述納米絲或納 米纖維是含Zii-O的納米絲或納米纖維。
23、 根據權利要求14所述的生物傳感器，其特徵在於，基體由氧化銦錫 (ITO)構成。
24、 根據權利要求14所述的生物傳感器，其特徵在於，所述基體是導體、 半導體或絕緣體。
25、 根據權利要求14所述的生物傳感器，其特徵在於，所述生物傳感器 進一步包括用於以約0.005-0.500V/s的掃描速率範圍將電壓施加到生物分析物 的器件。
26、 根據權利要求25所述的生物傳感器，其特徵在於，所述檢測器包括 循環伏安掃描儀(CV)。
27、 根據權利要求26所述的生物傳感器，其特徵在於，當納米絲或納米 纖維形成的層120與生物分析物中的一種或多種蛋白接觸時，生物分析物和基 體之間的一種或多種電子轉移將產生感應電流形式的可測量信號。
28、 一種用於檢測生物分析物中一種或多種蛋白的方法，其特徵在於，所 述方法包括下列步驟a. 提供生物傳感器，所述生物傳感器具有電極和支架材料，所述支架材 料具有基體和在所述基體的表面形成的納米絲或納米纖維層；b. 將所述生物分析物導入到所述支架材料中；以及c. 檢測所述生物分析物和所述基體表面之間的電子轉移，進而檢測生物 分析物中的一種或多種蛋白。
29、 根據權利要求28所述方法，其特徵在於，所述生物分析物包括氧化 還原活性血紅素蛋白。
30、 根據權利要求29所述方法，其特徵在於，所述氧化還原活性血紅素 蛋白包括細胞色素c。
31、 根據權利要求30所述方法，其特徵在於，所述生物分析物包括pH 範圍約為6.2-9.0的緩衝溶液，這樣細胞色素c和納米絲或納米纖維分別攜帶淨正電荷和淨負電荷。
32、 根據權利要求28所述方法，其特徵在於，所述形成的納米絲或納米 纖維層具有孔結構。
33、 根據權利要求28所述方法，其特徵在於，所述納米絲或納米纖維層 是含Ti02的納米絲或納米纖維。
34、 根據權利要求28所述方法，其特徵在於，所述基體由氧化銦錫(ITO) 構成。
35、 根據權利要求28所述方法，其特徵在於，所述基體是導體、半導體 或絕緣體。
36、 根據權利要求28所述方法，其特徵在於，進一步包括以約 0.005-0.500V/s的掃描速率範圍將電壓施加到生物分析物的步驟。
37、 根據權利要求36所述方法，其特徵在於，所述測量步驟由循環伏安 法(CV)完成。
全文摘要
本發明涉及一種可電化學檢測化學製品和生物分子氧化還原活性的生物兼容支架材料。在一個實施例中，所述生物兼容支架材料，包括基體、在所述基體上形成的含TiO2的納米絲或納米纖維導電層，其中所述含TiO2的納米絲或納米纖維導電層是以孔結構形成的，且當所述生物兼容支架材料與生物分析物接觸時，所述生物分析物的一種或多種蛋白將固定在所述含TiO2的納米絲或納米纖維導電層的表面上，進而生成可測量的感應電流信號。
文檔編號A61F2/28GK101646401SQ200780049756
公開日2010年2月10日 申請日期2007年9月17日 優先權日2007年1月12日
發明者Z.·瑞恩·田 申請人:阿肯色州大學技術發展基金會