降解赤黴病菌毒素基因產物檢測的製作方法

2023-07-01 03:04:16

專利名稱：降解赤黴病菌毒素基因產物檢測的製作方法
技術領域：
本發明涉及生物醫藥技術領域，具體涉及一種降解赤黴病菌毒素基因產物檢測。
背景技術：
赤黴病(Fusaruim head blight or scab)是危害小麥(Triticum aestivum)、 大麥(Hordeum vulgare)、燕麥(Avena sativa L·)、玉米(Zea mays L.)、7jC禾S (Oryza sativa)、黑麥(Secale cereale L.)等多種禾穀類作物的一種流行性病害，廣泛分布於世界溫暖潮溼地區。1884年，英國首次發現小麥赤黴病。近年來，隨著全球氣候的逐漸變暖以及稻-麥、玉米-麥輪作或免耕等耕作制度和方式的變化，小麥赤黴病在全世界各小麥產區呈現擴展趨勢，赤黴病帶來的直接經濟損失也越來越嚴重(Bai G H, Shaner G.Scab of wheat :Prospects for control [J]. Plant Disease,1994, 78 :760-766 ；Parry D W, Nicholson P，Mcleod LFusarium ear blight (scba) in small grain cereals-a review[J]. Plant Pathology, 1995,44 :207-238 ；McMullen M，Jones R，Gallenberg D. FHB of wheat and barlye :Are_emerging disease of devastating impact [J]Plant Disease, 1997,81 :1340-1348.)。我國小麥赤黴病主要發生在長江中下遊諸省、直轄市以及華南冬麥區和東北春麥區東部，近年來在黃河流域及其附近區域也時有發生，逐漸向北擴展蔓延。小麥赤黴病的發生區域面積已達7 X 106hm2，約佔全國小麥種植總面積的1/4，是目前我國小麥生產中最主要的病害之一(姚金保，陸維忠.中國小麥抗赤黴病育種研究進展 [J].江蘇農業學報，2000，16 ) J42-M8 ；陸維忠，程順和，王裕中.小麥赤黴病研究[M], 北京科學技術出版社，2001. 2-39.)。赤黴病的發生與流行造成了嚴重的產量損失。長江中下遊麥區、華南麥區及東北春麥區，流行頻繁，危害嚴重，重災年穗發病率可達50-100%， 產量損失10-40% (李克昌.小麥赤黴病及其防治(第二版)[M].上海上海科技出版社，1982. 1-12.)。美國和加拿大每年損失約40億美元(Carol E W. Economic and Social Impacts of Fusarium Head Blight Changing Farms and Rurak Communities in the Northen Great Plains. Phytopathology. 2000,90 (1) :16-21 ；Perkowsky J, Kiecana I, Stachowiak J,Basinski T. Natural occurrence of scirpentriol in cereals infected by Fusarium species [J] · Food Addit Contam. 2003,20(6) :572-8.)。如果發生赤黴病的小麥被貯藏在溼度較高的倉庫內，還可造成二次侵染，造成更大的損失。小麥赤黴病由多種鐮刀菌引起。在世界上不同的地區，因生態地理環境的不同， 引起赤黴病的優勢致病菌種不同。1984年全國小麥赤黴病研究協作組從我國21個省市、 自治區採集小麥赤黴病穗M50份，分離鑑定出18個鐮刀菌種，主要是以下5種禾穀鐮刀 |if (Fusarium graminearum)(Fusarium culmorum)lif (Fusarium avenaceum)、梨孢鐮刀菌(Fusarium poae)、雪腐鐮刀菌(Microdochium nivale)，其中禾穀鐮刀菌在各地均佔優勢，佔94. 5% (全國小麥抗赤黴病研究協作組.小麥品種資源抗赤黴病鑑定研究[J].作物品種資源，1984,4:2-7.)。禾穀鐮刀菌屬於半知菌亞門鐮孢屬真菌。 其生命力強，寄主範圍廣，腐生性強，主要危害大麥、小麥、玉米等禾本科作物。侵染麥粒或玉米後，生出白色紅色絮狀或絨狀菌絲，菌株生長形態性狀不同，變化和變異較大。小麥赤黴病發生後，不僅造成產量損失，還因病麥粒中含有多種病菌產生的多種衍生真菌毒素及次生代謝物質而汙染糧食作物種子，影響小麥的品質和商用價值，嚴重時引起嘔吐、腹痛、頭昏等急性中毒現象，該毒素可在食物鏈中長期存留，還可能產生致癌物質，嚴重威脅著人和動物的健康(Placinta C M，D，Mello JPF, Macdonald A M C. A review of worldwide contamination of cereal grains and animal feed with Fusarium mycotoxins[J]. Anim Feed Sci Tech,1999, 78 :21-37 ；Windels C Ε.Economic and social impacts of Fusarium head blihgt Changing farms and rural communities in the Northern Great Plains [J]. PhytoPathology, 2000,90 :17-21 ；Cleveland T E, Dowd P F, Desjardins A E, Bhatnagar D, Cotty P J. United States Department of Agricultuer—Agricultural Research Service research on pre—harvest Prevention of mycotoxins and mycotoxigenic fungi in US crops[J]. Pest Manag Sci, 59 :629-642.)。 真菌毒素(Mycotoxin Deoxynivalenol)是一類由絲狀真菌在適宜的條件下產生的有毒次級代謝產物，可在作物收穫前和貯藏期間廣泛汙染禾穀類作物及其加工品。小麥赤黴病病麥粒中含有脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(deoxynivalenol，DON)、T_2毒素、3-乙醯脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(3-Ac-D0N)、15-乙醯脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(15-Ac-DON)、雪腐鐮刀菌烯醇 (Nivalenol, NIV)和玉米赤黴烯酮(karalenone，ZEN)等多種對人、畜有毒的單端孢黴烯族類真菌毒素及其它類型的真菌毒素。人、畜、禽誤食赤黴病麥粒或由其加工成的食品或飼料後，通常1 池內即可出現多種不同程度的中毒症狀人可出現頭痛、噁心、嘔吐、腹瀉等症狀，嚴重時會危及生命；畜、禽常出現精神萎靡、食欲不振或拒食、腹瀉等症狀(徐雍皋， 陳利鋒.小麥赤黴病防治理論與實踐[M].南京江蘇科學技術出版社，1993.)。為保障人民身體健康，各國政府均對商品小麥中毒素含量作出嚴格限制。我國政府明確規定「小麥赤黴病粒最大允許含量為4.0%」，DON含量不得超過lmg/kg(= lppm)(中華人民共和國國家標準-小麥 GB1351-2008.)。在發達國家，主要的真菌毒素花費是用於防治真菌毒素進入食物鏈而做的監測， 認證和管理上。每年美國用於真菌毒素的資金大概在10 15億美元之間。考慮到控制真菌毒素的花費，恐怕只有發達國家才能夠支付。因此，建立安全有效的去毒技術非常必要。儘管關於真菌毒素的生化、毒性和作用方式有很多的研究報導，但是仍舊沒有有效防治和根除這些毒素的可行性辦法。物理，化學和生物方法常被用來去除單端孢黴烯毒素的汙染，例如，熱處理，比重分選和清洗，但通常都沒有效果(Siapira R，Paster N. Mycotoxins in food detection and control· 2004·) 。 Mfiff 5 ]^ , Mi圭白勺月兌_ 方法是通過篩選微生物，在溫和條件下降解真菌毒素，無須使用有害化學試劑、不影響適口性且無營養價值的重大流失。植物具有真菌毒素的生物轉化和脫毒能力，如赭麴黴素 (Ruhland M，Engelhardt G，Wallnofer P R. Transformation of the mycotoxin chratoxin A in plants. 2. Time course and rates of degradation and metabolite production in cell-suspension cultures of different crop plants. MycopathoIogia,1996， 134(2) :97-102.)鐮孢菌酸。它會把原來的毒素轉為一些結構不明的產物和化合共軛物，例如玉米烯酮可以被轉化為玉米烯酮糖苷(Engelhardt G，Zill G, Wohner B， et al. Transformation of the Fusarium mycotoxin zearalenone in maize cell
5suspension cultures. Naturwissenschaften, 1988, 75 :309-310.)；微生物中如乳酸菌禾口 ftOpioni細菌的變種在一定條件下可以降解真菌毒素，達到生物脫毒作用(Pierides M， El-Nazemi H，Peltonen K，et al· Ability of dairy strains of lactic acid bacteria to bind aflatoxin Ml in a food model. J. Food. Protec, 2000,63 :645-650. ；Haskard C A，El-Nazemi H，Kankaanpaa P，et al. Surface binding ofaflatoxin Bl by lactic acid bacteria. Appl. Environ. Microbiol, 2001,67 :3086-3091. ；El-Nazemi H，Mykkanen H，Kankaanpaa P，et al. Ability of Lactobacillus and Propionibacterium strains to remove aflatoxin Bl from the chicken duodenum. J. Food Protec.，2000，63 M9-552.)，這類微生物降解避免了使用有害的化學物質，並保留了實物的營養價值和口味。細菌發酵法可能會降低真菌毒素的含量，但是應用範圍較小，發酵也有可能使毒素轉化為其他有害物質(Ryu D, Jackson L S, Bullerman L B. Effects of processing on zearalenone. Adv. Exp. Med. Biol.，2002，504 :205-216.)。利用自然細菌的基因嵌合和植物的基因改造有望有效的降低真菌毒素。真菌毒素不僅對動植物有毒性，對產毒菌本身也有毒性。因此，為避免受自產毒素的毒害，病菌必須將毒素轉化成無毒或低毒物質排出體外。研究表明TrilOl基因是編碼單端孢黴烯3-0-乙醯轉移酶(trichothecene 3-0-acetyltransferase)的一種結構基因，與鍵刀菌抵抗自身毒素有關(Kimura M, Kaneko I. Trichothecene 3-0-Acetyltransferase protests both the producing organism and transformed yeast from related mycotoxins [J] The Journal of Biological Chemistry, 1998, 273 (3) : 1654-1661.)。單端孢黴烯3-0-乙醯轉移酶使單端孢黴烯轉化為類似單端孢黴烯C-3羥基變種的乙醯基衍生物，從而降 氐其毒 生(Kimura M，Shingu Y，Yoneyama K，et al. Features of TrilOl，the trichothecene 3-0-acetyltransferase gene，related to the self-defense mechanism in Fusarium graminearum[J].Biosci Biotechnol Biochem，1998，62 (5) 1033-1036 ； Shima J，Takase S，Takahashi Y，et al. Novel detoxification of the trichotecene mycotoxin deoxinivalenol by a soil bacterium isolated by enrichment culture[J] Appl.Environ. Microbiol, 1997,63 :3825-3830.)。國外對TrilOl基因的結構、功能以及在酵母(Mccomick S P，AlexanderN J.Disruption of TrilOl, the Gene Encodin Trichothecene 3-0-Acety!transferase, from Fusarium sporptrichioid[J]. Applied and Environmental Microbiology, 1999,65(12) :5252-5256.)、菸草(Muhitch M J，McCormick S P, AlexanderN J， et al.Transgenic expression of the TRIlOl or PDR5 gene increases resistance of tobacco to the phytotoxic effects of the trichothecene 4， 15-diacetoxyscirpenol [J]Plant Science，2000，157 (2) :201-207.)、小麥(Okubara P A， Blechl A E，McCormick S P，et al. Engineering deoxynivalenol metabolism in wheat through the expression of a fungal trichothecene acetyltransferase gene[J]. Theoretical and Applied Genetics，2002，106 :74-83.)]禾口大麥(Manoharan M，Dahleen L S，Hohn T M，et al. Expression of 3-OH trichothecene acetyltransferase in barley(Hordeum vulgare L. ) and effects on deoxynivalenol[J]. Plant Science， 2006,171 :699-706.)中的成功表達已多有報導(Eriksen G S，Pettersson H，LundhT. Comparative cytotoxicity of deoxynivalenol, nivalenol, their acetylated derives and de-expoxy metabolites[J]. Food and Chemical Toxicology,2004,42 619-624.)。但至今還沒有禾穀鐮刀菌 Fg0623(Fusarium graminearium 0623) TrilOl 基因表達檢測方法的報導。

發明內容
本發明的目的是針對現有技術存在的不足，提供一種降解赤黴病菌毒素基因產物檢測。本發明的技術方案降解赤黴病毒素的TrilOl基因，來源於禾穀鐮刀菌 (Fusarium graminearum) Fg0623，GenBank 登陸號為 GQ907236，具有 SEQ ID NO. 1 所示的核苷酸序列，胺基酸序列如SEQ ID N0. 2所示。編碼的蛋白為單端孢黴烯3-0-乙醯轉化酶。 編碼451個胺基酸的多肽，推測分子量為49. 45kDa，等電點為5. 14 ；編碼451個胺基酸殘基，有其起始密碼子ATG和終止密碼子TAG。所用禾穀鐮刀菌(Fusarium graminearum)Fg0623，利用MEGA3. 1軟體對編碼單端孢酶烯3-0-乙醯轉移酶的TrilOl、Tri201和TAT基因的胺基酸序列建立系統進化樹， 分析結果表明，Fusarium graminearium 0623 與 Fusarium sporotrichioides 屬於同一進化枝且與Fusarium asiaticum有較近的親緣關係，而與F. oxysporum、F. moniliforme、 F. nygamai> F. nisikadoi 禾口 F. decemcellulare 的親緣關係較遠。將培養好的Fg0623按韓利剛等(韓利剛，袁毅，王罡.絲狀真菌組織DNA的提取 [J].生物技術，1999，9 (6) :38-41.)的方法收集菌體，依據RNAiso Plus說明書上方法提取菌體總RNA，進而反轉錄合成禾穀鐮刀菌Fg0623 cDNA。根據GenBank中已經登陸的其他鐮刀菌的TrilOl基因序列設計併合成引物。上遊引物 Bp-TrilOl-F 5' -GGATCCATGGCTTTCAAGATACAGCT-3『，引入 BamHI 酶切位點；下遊引物 Bp-TrilOl-R 5' -CTCGAGCTAACCAACGTACTGCGCAT-3』，引入 XhoI 酶切位點。利用上述一對引物和合成的cDNA為模板進行PCR擴增，將PCR產物經瓊脂糖凝膠電泳分析，得到特異性PCR條帶。再將目的片段與PMD19-T載體連接，並轉化大腸桿菌JM109 菌株，經篩選、鑑定得到插入目的片段的陽性克隆。最後對陽性克隆進行DNA序列測定，利用DNAclub軟體並通過NCBI網站的BLAST功能對所測定序列進行比較分析。本發明中的Fg0623 TrilOl基因含有一個完整的開放閱讀框，閱讀框架全長 135^3ρ。該基因在GenBank中的登陸號為GQ907236。它與Kimura報導的禾穀鐮刀菌iTri 101 SStIf1SIji^J (Kimura M, Shingu Y, Yoneyama K, et al. Features of TrilOl, the trichothecene 3-0-acetyltransferase gene,related to the self-defense mechanism in Fusarium graminearum[J]. Biosci Biotechnol Biochem,1998,62 (5) 1033-1036.) 同源性最高，為99. 78%，鹼基序列只在444位由A變異為G，在1 173位由T變異為C，從而引起TrilOl基因推導的胺基酸序列中第148位胺基酸由異亮氨酸(Ile)變異為纈氨酸 (Val)，第391位胺基酸由苯丙氨酸(Wie)變異為亮氨酸(Leu)，雖然核苷酸序列的830位也由T變異為C，但該變化沒有引起胺基酸的變化。該基因編碼451個胺基酸殘基，有其起始密碼子ATG和終止密碼子TAG。該基因的核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示，所編碼的胺基酸序列如SEQ ID N0. 2所示。
該基因編碼的蛋白為單端孢酶烯3-0-乙醯轉移酶，Blast資料庫分析結果表明， 其屬於轉移酶總科。對TrilOl基因編碼胺基酸序列的基本特徵進行分析，結果顯示該基因所預測的蛋白質分子量為49. 45kDa，等電點為5. 14，胺基酸組成中帶正電荷胺基酸 (Arg、Lys) 47個，佔10. 42%，帶負電荷胺基酸(Asp、Glu) 57個，佔12. 64%，疏水性胺基酸 217個，佔48. 12%，親水性胺基酸184個，佔40. 80%。利用Genedoc軟體，將Fg0623 TrilOl 基因推導的胺基酸序列進行同源比對，結果表明，它與Kimura報導的禾穀鐮刀菌TrilOl胺基酸序列同源性最高，為99. 56%，與其它13種鐮刀菌的TrilOl胺基酸序列的同源性分別為 97. 91% 75. 68%。本發明所提供降解赤黴病菌毒素的TrilOl基因表達產物的檢測方法，以製備的兔抗GST-Tri 101抗體作為一抗，羊抗兔IgG-HRP為二抗，與含有TrilOl蛋白的待檢測物進行Western blot分析。本發明優選的用於檢測感赤黴病小麥中TrilOl基因的表達。本發明通過SDS-PAGE檢測蛋白是否表達，待SDS-PAGE結束後，用250mM KCl染膠，就可見白色的蛋白條帶。割取含目的條帶的凝膠，回收GST-TrilOl融合蛋白。融合蛋白GST-TrilOl 分子量為75. 45kDa。然後，用純化的GST-TrilOl融合蛋白作為抗原，注射健康紐西蘭大白兔製備兔抗GST-TrilOl抗體，GST-TrilOl融合蛋白製備和鈍化的步驟如下(I)GST-TrilOl融合蛋白抗血清的製備①選取14-16周齡的健康紐西蘭大白兔，每次注射180 μ g左右純化的GST-Tri 101 融合蛋白抗原，在免疫前，從兔耳抽取血樣，作為陰性對照；②GST-Tri 101融合蛋白抗原500 μ L，加500 μ L福氏完全佐劑乳化，皮下多點注射免疫；③3周後，GST-TrilOl融合蛋白抗原500 μ L，加500 μ L福氏不完全佐劑乳化，腿部肌肉多點注射免疫；④2周後，500 μ L GST-TrilOl融合蛋白抗原免疫；⑤1周後，再次用ImL GST-TrilOl融合蛋白抗原加強免疫，同時，從兔耳抽血樣， 採用間接ELISA進行多抗血清效價測定；⑥1周後，殺兔收集血液，收集的血液置室溫下凝固；⑦將凝固的血液放入37°C溫箱內半小時，再置4°C冰箱過夜，使血塊收縮，抗血清析出；⑧吸出抗血清，3000rpm離心lOmin，吸上清液分裝，_70°C保存備用；(2) GST-Tri 101融合蛋白抗血清的純化步驟①用pH值為7. 4的PBS溶液將血清稀釋2倍；②攪拌下逐滴加入飽和硫酸銨溶液，其pH值為7. 4，使其飽和度達到50%，4°C靜置2小時以上；③在4°C條件下，以12000rpm(每分鐘轉速)離心20min，將其沉澱溶於2倍的PBS 溶液中；④加入飽和硫酸銨溶液，其pH值為7. 4至溶液飽和度達到33%，4°C靜置2小時以上；⑤在4°C條件下，以12000rpm離心20min，沉澱用少量的PBS溶液溶解；⑥在4°C條件下，在大於20倍體積的PBS溶液中透析M小時，中間更換(通常等
8時間段更換)透析液3次；⑦收集透析液，-20°C保存備用。兔抗GST-TrilOl抗體為多克隆抗體。兔抗GST-Tri 101抗體經ELISA法測定抗體效價為1 256000，製備的抗體與原核細胞體外表達的TrilOl蛋白可以特異性結合。TrilOl蛋白是pGEX_4T2/Tril01轉化大腸桿菌BL21 (DE3)，經IPTG誘導產生的約 75. 45kD的蛋白。羊抗兔IgG-HRP為辣根過氧化物酶標記的羊抗兔IgG酶標抗體。本發明多克隆抗體的Wfestern印跡分析參照Sambrook等(1989)方法，具體操作如下首先將蛋白從SDS-PAGE膠上轉移到PVDF膜上，然後用封閉液封閉2小時，接著用 PBST+5%脫脂奶粉+純化後抗體2 μ L，室溫反應1小時，用PBST洗3 6次，IOmin/次，加入PBST和辣根過氧化物酶標記的羊抗兔的二抗，室溫反應1小時，用PBS洗膜3次，IOmin/ 次；最後將PVDF膜置於含有DAB的顯色液中至條帶清晰，將膜放入蒸餾水終止顯色反應。 以上方法參照Sambrook等(1989)方法。所述檢測方法在含有或可能含有TrilOl蛋白的小麥、玉米等待檢測糧食作物和或其加工的產品的應用。本發明利用TrilOl抗體檢測TrilOl基因在感病小麥中的表達培養Fg0623菌株，收集孢子，配製分生孢子懸浮液，採用分生孢子單小花注滴法對大小相對一致的麥穗接種，以無菌水做對照。22天後，採集感病和對照小麥籽粒提取蛋白。進而以製備的兔抗 GST-TrilOl抗體作為一抗，羊抗兔IgG-HRP為二抗，與感赤黴病小麥籽粒中提取的蛋白進行Western blot分析。所製備的抗血清能特異性地識別在感病小麥中表達的TrilOl蛋白， 雜交顯示的條帶很專一。本發明將Fg0623的TrilOl基因在大腸桿菌中進行了高效表達，將純化的蛋白免疫紐西蘭白兔，得到特異性較好的抗體，並能與在BL21(DE3)中分泌表達的TrilOl蛋白發生免疫印跡反應，為轉入小麥和玉米中的TrilOl基因提供一種新的檢測方法，降低了檢測成本，並為進一步研究TrilOl基因及其蛋白的生物學功能、細胞定位以及在植物中的表達等奠定了基礎，有助於實現控制小麥、玉米毒素的代謝和降低小麥、玉米中毒素的含量，找到食物和飼料中真菌毒素，經濟、高效和安全的淨化方法，進而提高作物產量，食品安全和避免真菌毒素在公共健康方面的影響。


圖 1 為 iTri 101基因 RT-PCR擴增電泳結果，其中，Lane M :DNA Marker DL2000 ；Lane 1:PCR product ；圖2為重組質粒pMD19_T/Tril01酶切鑑定結果，其中，Lane M :DNA Marker DL15000 ；Lane 1 :recombinant plasmid pMD19-T/Tril01 ；圖3為TrilOl胺基酸組成；圖4為TrilOl蛋白質種類；圖5為重組質粒pGEX_4T2/Tril01酶切鑑定結果，其中，Lane M =DNA Marker DL15000 ；Lane 1 -recombinant plasmid pGEX_4T2/Tril01 ；
圖 6 為 pGEX-4T2/Tril01 原核表達產物的 SDS-PAGE 分析，其中，Lane M =Protein marker ；Lane 1 :pGEX_4T2/Tril01 induced with IPTG ；Lane 2 :pGEX_4T2 induced with IPTG ；Lane 3 :BL21 without induction ；圖7為不同IPTG濃度誘導的表達產物量的SDS-PAGE比較，其中，Lane Μ Protein marker ；Lane 1-5 :Proteins of pGEX_4T2/Tril01 induced by IPTG at 0. 4, 0.6,0.8,1. Oand 1. 2mM ；Lane 6 :pGEX-4T2 induced with IPTG ；Lane 7 :BL21 without induction ；圖8為兔抗GST-TrilOl多克隆抗體效價的ELISA檢測；圖 9 為 pGEX-4T2/Tril01 表達蛋白的 Western blot 分析，其中，Lane M =Protein marker ；Lanel :pGEX_4T2/Tril01 ；Lane2 :pGEX_4T2 ；Lane3 :BL21 ；圖10為感赤黴病小麥籽粒蛋白的Wfestern blot分析，其中，Lane M =Protein marker ；Lanel Protein of gibberella damaged kernels for wheat ；Lane2 Protein of health wheat grain。
具體實施例方式以下結合實施例對本發明做進一步闡述，但實施例並不對本發明做任何限定。下述實施例中所用方法，如無特別說明，均為常規方法。實施例一禾穀鐮刀菌降解毒素基因TrilOl的表達1、總RNA的提取和cDNA的合成將新鮮PDA斜面培養好的Fg0623孢子接種於液體培養基中，150rpm, 28°C，振蕩培養48h ；吸取ImL培養好的菌液於1. 5mL無菌EP管中，10 OOOrpm離心IOmin ；收集菌體， 依據RNAiso Plus說明書上方法提取菌體總RNA。以提取的總RNA為模板，合成cDNA。 RTl 體系RNase Free dH20 6. 5 μ L, dNTP-Mix (IOmM) 1 μ L, Oligo dT (50 μ Μ) 2 μ L，Total RNA 0. 5μ L於PCR儀上65°C反應5min，冰上急冷。RT2體系上述變性、退火後的反應液 10μ L,5XPrimeScript Buffer 4 μ L, RNase Inhibitor (40U/ μ L) 0. 5 μ L, PrimeScript RTase (200U/ μ L) 1 μ L, RNase Free dH20 4.5 yL。反應程序30 °C lOmin，42 °C 60min， 70°C 15min，後 4°C保持，得到 cDNA。2、引物設計根據GenBank中已經登陸的其他鐮刀菌的TrilOl基因序列設計併合成引物。上遊引物Bp-TrilOl-F:5' -GGATCCATGGCTTTCAAGATACAGCT-3『，引入了 BamHI 酶切位點；下遊引物Bp-TrilOl-R :5' -CTCGAGCTAACCAACGTACTGCGCAT-3』，引入了 XhoI 酶切位點。以上引物由北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司合成。3、PCR擴增及產物純化PCR 擴增體系(25 μ L)_10 X Buffer (Mg2+free)2. 5 μ LMgCl2 (25mM)2. 5 μ L
dNTP (IOmM)0. 4 μ LF primer (10 μ Μ)1 μ LR primer (10 μ Μ)1 μ LrTaq DNA 聚合酶(0· 5U/ μ L)0. 2 μ L
模板 cDNA (lOng/ μ L) 6 μ LddH2011. 4μ L_Total25 μ L_擴增條件94°C預變性:3min ；94°C變性lmin，55°C退火lmin，72°C延伸lmin，進行 30個循環；72°C延伸10min，l(TC保持。PCR產物用1 %的瓊脂糖凝膠電泳檢測。PCR產物經瓊脂糖凝膠電泳，採用U-gene公司DNA凝膠同收試劑盒回收1. 4kb 左右的目的片段。具體操作按照試劑盒說明書進行。純化產物_20°C保存備用。以Fg0623總RNA反轉錄後的cDNA為模板擴增的PCR產物，經瓊脂糖凝膠電泳分析，結果得到1 400bp左右的特異性PCR條帶(圖1)。4、PCR回收產物的連接和轉化將PCR回收產物與pMD19-T vector 16°C連接過夜，具體操作按試劑盒說明書進行。參照文獻(Sambrook J, Fritsch E F, Maniatis T. Molecular cloning :A laboratory manual,2nd Edition[M]. New York : Co Id Spring Harbor Laboratory Press, 1989.)用CaCl2法製備大腸桿菌感受態細胞，所用大腸桿菌為JM109菌株。熱擊轉化步驟如下(1)取出-70°C保存的大腸桿菌感受態細胞，置於冰上5min。(2)加入10 μ L連接產物，輕輕混勻，冰浴30min。(3) 42°C水浴熱擊90s，迅速置於冰上，冰浴5min。(4)加入790 μ L新鮮的LB液體培養基，37°C，150rpm,振蕩培養lh。(5)取出菌液，4°C，10 OOOrpm，離心 2min。(6)棄上清(約殘留200 μ L上清液)，重懸沉澱，將其全部均勻塗布於含X_gal、 IPTG 的 LB 平板(含 50mg/L Amp)上，37°C，培養約 14h。(7)將培養皿置於4°C (約l_2h)，進行顯色反應。5、質粒提取與重組質粒鑑定(1)隨機挑取陽性單克隆(白色菌落)，加入5mL LB (含50mg/L Amp)液體培養基， 37 0C，250rpm 震蕩培養至 0D_ 為 0. 4-0. 5 (12_16h)。(2)取3_5mL菌液，參照U-gene公司質粒提取試劑盒方法提取質粒，具體操作按照試劑盒說明書進行。-20°C保存備用。(3)用BamHI、XhoI雙酶切鑑定重組質粒pMD19_T/Tril01，按下表加入各試劑， 37°〇，溫浴211。_BamHI1 μ L
XhoIIOXT buffer(MH2O重組質粒_
1 μ L 1 μ L 3μ L 4μ LTotal_將目的片段與pMD19-T載體連接，用氯化鈣法轉化大腸桿菌JM109，在含有 Ampicilin、X-gal、IPTG的LB平板上根據藍白斑篩選陽性重組子，然後用BamHI和XhoI雙酶切鑑定重組克隆，酶切結果見圖2，質粒被切為約2. 7kb的載體片段和1. 4kb左右的插入片段。酶切結果表明，已得到插入目的片段的陽性克隆。實施例二禾穀鐮刀菌降解毒素基因TrilOl的序列分析經酶切鑑定成功的陽性克隆樣品送Sangon公司進行DNA序列測定。利用DNAclub 軟體並通過NCBI網站的BLAST功能對所測定序列進行比較分析。基因序列測定結果表明，Fg0623 TrilOl基因含有一個完整的開放閱讀框，閱讀框架全長1356bp。該基因已在GenBank中登陸，登陸號為GQ907236。它與Kimura報導的禾穀鐮刀菌iTrilOl基因核苷酸序列(Kimura M, Shingu Y, Yoneyama K,
et al. Features of TrilOl, the trichothecene 3-0-acetyltransferase gene, related to the self-defense mechanism in Fusarium graminearum[J] · Biosci Biotechnol
Biochem, 1998，62 (5) 1033-1036.)同源性最高，為99. 78 %，鹼基序列只在444位由A變異為G，在1 173位由T變異為C，從而引起TrilOl基因推導的胺基酸序列中第148位胺基酸由異亮氨酸(Ile)變異為纈氨酸(Val)，第391位胺基酸由苯丙氨酸(Wie)變異為亮氨酸 (Leu)，雖然核苷酸序列的830位也由T變異為C，但該變化沒有引起胺基酸的變化。該基因編碼451個胺基酸殘基，有其起始密碼子ATG和終止密碼子TAG。TrilOl基因的核苷酸序列及對應的胺基酸序列分別如SEQ ID NO. 1和SEQ ID N0. 2所示。實施例三TrilOl基因編碼胺基酸序列分析由 http//www. expasy. org/tools/#translate 網站提供的蛋白分析軟體對 TrilOl基因編碼胺基酸序列的基本特徵進行分析，結果顯示該基因所預測的蛋白質分子量為49. 45kDa，等電點為5. 14，胺基酸組成中帶正電荷胺基酸(Arg、Lys)47個，佔10. 42%, 帶負電荷胺基酸(Asp、Glu) 57個，佔12. 64%，疏水性胺基酸217個，佔48. 12%，親水性胺基酸184個，佔40. 80%，見表1和圖3。表1 TrilOl蛋白胺基酸含量
權利要求
1.一種降解赤黴病菌毒素的TrilOl基因表達產物的檢測方法，其特徵在於，以兔抗 GST-TrilOl抗體作為一抗，羊抗兔IgG-HRP為二抗，與含有TrilOl蛋白的待檢測物進行 Western blot分析；所述兔抗GST-TrilOl抗體的製備，是將純化的GST-TrilOl融合蛋白作為抗原，注射健康紐西蘭大白兔製備出兔抗GST-TrilOl抗體，其中，(1)GST-TrilOl融合蛋白抗血清的製備包括以下步驟①選取14-16周齡的健康紐西蘭大白兔，每次注射ISOyg左右純化的GST-TrilOl融合蛋白抗原，在免疫前，從兔耳抽取血樣，作為陰性對照；②GST-TrilOl融合蛋白抗原500μ L，加500 μ L福氏完全佐劑乳化，皮下多點注射免疫；③3周後，GST-TrilOl融合蛋白抗原500μ L，加500 μ L福氏不完全佐劑乳化，腿部肌肉多點注射免疫；④2周後，500μ L GST-1TrilOl融合蛋白抗原免疫；⑤1周後，再次用ImLGST-TrilOl融合蛋白抗原加強免疫，同時，從兔耳抽血樣，採用間接ELISA進行多抗血清效價測定；⑥1周後，殺兔收集血液，收集的血液置室溫下凝固；⑦將凝固的血液放入37°C溫箱內半小時，再置4°C冰箱過夜，使血塊收縮，抗血清析出；⑧吸出抗血清，3000rpm離心lOmin，吸上清液分裝，_70°C保存備用；(2)GST-Tril01融合蛋白抗血清的純化包括以下步驟①用PH值為7.4的PBS溶液將血清稀釋2倍；②攪拌下逐滴加入飽和硫酸銨溶液，其PH值為7.4，使其飽和度達到50%，4°C靜置2 小時以上；③在4°C條件下，以12000rpm離心20min，將其沉澱溶於2倍的PBS溶液中；④加入飽和硫酸銨溶液，其PH值為7.4至溶液飽和度達到33%，4°C靜置2小時以上；⑤在4°C條件下，以12000rpm離心20min，沉澱用少量的PBS溶液溶解；⑥在4°C條件下，在大於20倍體積的PBS溶液中透析M小時，中間更換透析液3次；⑦收集透析液，_20°C保存備用。
2.如權利要求1所述的檢測方法，其特徵在於，GST-TrilOl融合蛋白的製備過程中，通過SDS-PAGE檢測蛋白是否表達，待SDS-PAGE結束後，用250mM KCl染膠，就可見白色的蛋白條帶；割取含目的條帶的凝膠，回收GST-TrilOl融合蛋白。
3.如權利要求1所述的檢測方法，其特徵在於，用於檢測感赤黴病小麥中TrilOl基因的表達。
4.如權利要求1所述的檢測方法，其特徵在於，兔抗GST-TrilOl抗體為多克隆抗體。
5.如權利要求1或2所述的檢測方法，其特徵在於，兔抗GST-TrilOl抗體經ELISA法測定抗體效價為1 256000，製備的抗體與原核細胞體外表達的TrilOl蛋白可以特異性結I=I O
6.如權利要求3所述的檢測方法，其特徵在於，TrilOl蛋白是pGEX-4T2/Tril01轉化大腸桿菌BL21 (DE3)，經IPTG誘導產生的約75. 45kD的蛋白。
7.如權利要求1所述的檢測方法，其特徵在於，羊抗兔IgG-HRP為辣根過氧化物酶標記的羊抗兔IgG酶標抗體。
8.如權利要求1所述的檢測方法，其特徵在於，首先將蛋白從SDS-PAGE膠上轉移到 PVDF膜上，然後用封閉液封閉2小時，接著用PBST+5%脫脂奶粉+純化後抗體2 μ L，室溫反應1小時，用PBST洗3 6次，IOmin/次，加入PBST和辣根過氧化物酶標記的羊抗兔的二抗，室溫反應1小時，用PBS洗膜3次，IOmin/次；最後將PVDF膜置於含有DAB的顯色液中至條帶清晰，將膜放入蒸餾水終止顯色反應。
9.如權利要求1所述檢測方法在含有或可能含有TrilOl蛋白的小麥、玉米等待檢測糧食作物和或其加工的產品的應用。
全文摘要
本發明公開了一種降解赤黴病菌毒素基因產物檢測。以兔抗GST-Tri101抗體作為一抗，羊抗兔IgG-HRP為二抗，與含有Tri101蛋白的待檢測物進行Western blot分析。本發明的Tri101基因編碼單端孢黴烯3-O-乙醯轉化酶，在大腸桿菌中對其進行了高效表達，將純化的蛋白免疫紐西蘭白兔，得到特異性較好的抗體，並能與在BL21(DE3)中分泌表達的Tri101蛋白發生免疫印跡反應，為轉入小麥和玉米中的Tri101基因提供一種新的檢測方法，降低了檢測成本，並為進一步研究Tri101蛋白的生物學功能奠定了堅實的基礎。
文檔編號G01N33/531GK102156192SQ20101059322
公開日2011年8月17日 申請日期2010年12月17日 優先權日2010年12月17日
發明者何文蘭, 全鑫, 劉明源, 劉紅彥, 吳坤, 吳政卿, 孫虎, 宋玉立, 曹嶽恩, 楊麗榮, 武超, 王亞南, 王恆亮, 王愛平, 薛保國, 趙獻林, 郭松景, 閆海霞, 雷振生, 馬雪皎, 魯傳濤 申請人:河南省農業科學院