一種白色念珠菌熱休克蛋白90表位與噬菌體外殼蛋白的雜合蛋白及其用途的製作方法

2023-07-01 15:30:46

專利名稱：一種白色念珠菌熱休克蛋白90表位與噬菌體外殼蛋白的雜合蛋白及其用途的製作方法
技術領域：
本專利屬於生物工程中的DNA重組技術領域。
背景技術：
白色念珠菌是一種最常見的條件致病菌，其深層(系統)感染，即系統性白色念珠菌感染危及病人的生命，在使用抗真菌藥物進行治療的情況下，死亡率仍很高。白色念珠菌感染近二十多年來一直處於臨床真菌感染的第一位。研究報導表明，愛滋病、癌症、肝病晚期和大量應用抗菌素的患者均易感染白色念珠菌，是被稱為免疫系統薄弱病人的一個共同致死原因之一。目前，由於缺乏有效的診斷試劑和治療藥物，系統性白色念珠菌感染仍然威脅著人類的健康。
系統性白色念珠菌感染沒有明顯的臨床特徵，使臨床醫生無法在早期發現。目前，主要的診斷方法是利用血培養，這種方法不僅費時，操作繁瑣，而且靈敏性低。在治療方面，主要採用抗真菌藥物治療，抗真菌藥物不僅價錢貴，而且具有很大的副作用，如容易引起腎功能衰竭等。免疫療法被認為是治療真菌感染的有效途徑。

發明內容
本發明的目的是確立一種能夠用於製備系統白色念珠菌感染臨床檢測，治療和預防的藥物的生物製品。
採用噬菌體展示技術，將一種白色念珠菌熱休克蛋白90的抗原表位基因重組到一種整合有噬菌體主要外殼蛋白基因的表達質粒中，形成重組載體。利用CaCl2法將重組載體導入大腸桿菌TG1宿主細胞中。外源基因在宿主細胞內表達，與噬菌體外殼蛋白一起組裝而形成一種雜合蛋白，並隨噬菌體分泌到細胞外。利用生物化學方法提取和純化展示有表位的雜合蛋白。
本發明的雜合蛋白是含有白色念珠菌熱休克蛋白90表位(LKVIRK)的絲狀噬菌體基因8雜合外殼蛋白。這種雜合蛋白基因的核苷酸序列為atg aaa aag tct tta gtc ctc aaa gcc tcc gta gcc gtt gct acc ctc48
gtt ccg atg ctg tct ttc gcc gcg gag ggt ctg aaa gtt atc aga aaa96tcg aac gat cct gca aaa gcg gcc ttt gac tcc ctg caa gcc tca gcg144acc gaa tat atc ggt tat gcg tgg gcg atg gtt gtt gtc att gtc ggc192gca act atc ggt atc aag ctg ttt aag aaa ttc acc tcg aaa gca agc240這種雜合蛋白的胺基酸序列為Met Lys Lys Ser Leu Val Leu Lys Ala Ser Val Ala Val Ala Thr Leu1 5 10 15Val Pro Met Leu Ser Phe Ala Ala Glu Gly Leu Lys Val Ile Arg Lys20 25 30Ser Asn Asp Pro Ala Lys Ala Ala Phe Asp Ser Leu Gln Ala Ser Ala35 40 45Thr Glu Tyr Ile Gly Tyr Ala Trp Ala Met Val Val Val Ile Val Gly50 55 60Ala Thr Ile Gly Ile Lys Leu Phe Lys Lys Phe Thr Ser Lys Ala Ser65 70 75 80這種雜合蛋白的製備包括以下步驟第一步，合成表位基因該基因為編碼白色念珠菌熱休克蛋白90的一種表位(IKVIRK)的基因。可以利用商業公司的DNA合成儀進行合成。
第二步，構建重組載體原始質粒為已公開質粒pfd8SHS(一種整合有絲狀噬菌體主要外殼蛋白基因的表達性載體)[分子科學學報，200016(3)184-186]。用兩種限制性內切酶處理原始質粒，然後將人工合成的寡核苷酸片段插入到經酶處理的質粒載體，獲得重組載體pfd8C。
第三步，將重組載體轉入宿主細胞。宿主細胞為帶有F因子的大腸菌株TG1菌株。獲得的轉化體為新的工程菌株，TG1C。
第四步，製備雜合蛋白。培養工程菌株，經過離心、沉澱等步驟可獲得該發明的雜合蛋白。
1.作為製備檢測系統性白色念珠菌感染的新生物製品酶聯免疫檢測表明，雜合蛋白可以作為一種抗原與患系統性白色念珠菌感染者血清中的抗體產生免疫應答。檢測陽性率達到90％以上。
2.作為製備治療和預防系統性白色念珠菌感染藥物的新生物製品，用於系統性白色念珠菌感染的免疫治療。
雜合蛋白在小鼠體產生了較好的體液免疫和細胞免疫1]用ELISA和Western blot方法檢測了免疫後小鼠血清中抗體的變化和特異性。結果表明雜合蛋白刺激小鼠產生了抗白色念珠菌熱休克蛋白90表位的特異性抗體。
2]用3H-TdR摻入法和流式細胞儀檢測表明雜合蛋白免疫小鼠體內的細胞免疫變化。結果表明，NK細胞的殺傷活性、胸腺細胞自然增生能力和淋巴細胞轉化能力均得到明顯增強，並增強了胸腺、脾和外周血中CD3+、CD4+和CD8+淋巴細胞的表達。
3]雜合蛋白在白色念珠菌模型鼠的免疫預防和治療試驗中表現出較好的作用實驗表明雜合蛋白能夠推遲感染的發生時間，推遲時間達5-7天。提高了小鼠的存活率，存活率提高了約30％
具體實施例方式1.表位基因的合成利用商業生物公司的DNA合成儀進行表位基因片段。該基因的核苷酸序列為5』-CTG AAA GTT ATC AGA AAA-3』2.重組載體的構建利用質粒pfd8SHS為原始質粒，進行重組載體的構建。
1)利用限制性內切酶處理原始質粒pfd8SHS。
2)將酶切後的載體與人工合成的外源DNA片段按摩爾濃度1∶3混合。
3)10μL混合液加入0.5μL T4DNA連接酶和1μL緩衝液。在15-20℃條件下過夜，獲得重組載體(pfd8C)。
3.製備感受態細胞將TG1細胞培養於LB培養基上，37℃培養16-20小時。挑選單菌落接種於2ml LB液培養基中，37℃培養過夜。培養液轉入100ml新鮮LB培養液中，37℃培養5小時。5000rpm離心15分鐘，放入42-43℃水浴中90秒，然後迅速轉入冰水浴中10分鐘。用8ml預冷的0.1mol/L CaCl2懸浮沉澱，獲感受態細胞。
4.重組載體轉化宿主細胞取濃度約為150μg/mL的重組載體DNA溶液1.25μL；加入100μl的感受態細胞，置於碎冰中15分鐘；加入600μl LB培養液，置於37℃恆溫條件培養1小時；10000rpm離心5分鐘；棄上清，將剩餘部分塗於含氨苄青黴素的LB培養基表面，37℃恆溫箱中培養過夜。選在培養平面生長的單菌落，進行擴大培養和低溫保存(-70℃)。
5.雜合蛋白的製備取凍存的轉化細胞在LB平板上劃線培養，過夜；選單菌落接種於含氨苄青黴素的3mlLB培養液中，37℃培養過夜；將培養液轉入80-100ml LB培養液中繼續培養，37℃培養30分鐘；離心10分鐘；沉澱用培養液重新懸浮，37℃培養數小時；離心20分鐘，棄上清，用TE液懸浮沉澱；離心20分鐘，取上清，並加入20％聚乙二醇和2.5mol/L氯化鈉。冷環境中放置數小時，離心10分鐘；棄上清，用TE液懸浮沉澱，獲得有外源多肽展示的絲狀噬菌體雜合外殼蛋白。
7.製備的雜合蛋白的檢測採用SDS-聚丙稀醯胺凝膠電泳法進行蛋白的純度檢測將待測蛋白樣品在沸水中處理3-5分鐘。按常規方法進行電泳。電泳後，用硝酸銀染色法對膠板進行染色。如果雜合蛋白表達成功，膠板上出現兩條帶。上方帶為雜合蛋白帶，下方為野生型絲狀噬菌體外殼蛋白帶。
8.免疫學實驗1〕抗體檢測試驗利用酶聯免疫方法，以雜合蛋白作為抗原進行患系統性白色念珠菌感染者血清中的抗體的檢測。
酶標板以每孔0.5-1ug包被抗原。酶標二抗使用辣根過氧化物酶標記的羊抗人IgG。按常規方法進行抗體檢測。
2〕動物體的體液免疫和細胞免疫試驗選擇18-20克C57BL/6J小鼠數十隻，雌雄各半，隨機分組(實驗組及對照組)，進行腹腔注射給藥(雜合蛋白)。各組均免疫三次，第一次和第二次免疫間隔時間為14天，第二次和第三次免疫間隔時間為10天，分別在第一次免疫後的2、4、6、8周進行尾部採血，用ELISA方法檢測小鼠體內抗體的變化。另一部分實驗是在免疫小鼠4周後處死小鼠，利用3H-TdR摻入法和流式細胞儀檢測進行各項免疫指標的測定。
3〕動物免疫預防試驗用雜合蛋白免疫小鼠後，於右後肢外側皮下接種白色念珠菌細胞。在接種後的第10天開始觀察，並且每隔3天測量腫瘤體積，計算存活率。
4)動物免疫治療試驗於右後肢外側皮下接種白色念珠菌細胞，用雜合蛋白免疫小鼠，共3次。觀測各組小鼠的存活率。
權利要求
1.一種白色念珠菌熱休克蛋白90表位與噬菌體外殼蛋白的雜合蛋白，其特徵在於將白色念珠菌熱休克蛋白90表位(LKVIRK)展示於絲狀噬菌體主要外殼蛋白表面，形成的雜合蛋白，此蛋白的胺基酸結構序列為Met Lys Lys Ser Leu Val Leu Lys Ala Ser Val Ala Val Ala Thr Leu1 5 10 15Val Pro Met Leu Ser Phe Ala Ala Glu Gly Leu Lys Val Ile Arg Lys20 25 30Ser Asn Asp Pro Ala Lys Ala Ala Phe Asp Ser Leu Gln Ala Ser Ala35 40 45Thr Glu Tyr Ile Gly Tyr Ala Trp Ala Met Val Val Val Ile Val Gly50 55 60Ala Thr Ile Gly Ile Lys Leu Phe Lys Lys Phe Thr Ser Lys Ala Ser65 70 75 80
2.如權利要求1所述的白色念珠菌熱休克蛋白90表位與噬菌體外殼蛋白的雜合蛋白，其特徵是這種雜合蛋白的核苷酸序列為atg aaa aag tct tta gtc ctc aaa gcc tcc gta gcc gtt gct acc ctc 48gtt ccg atg ctg tct ttc gcc gcg gag ggt ctg aaa gtt atc aga aaa 96tcg aac gat cct gca aaa gcg gcc ttt gac tcc ctg caa gcc tca gcg144acc gaa tat atc ggt tat gcg tgg gcg atg gtt gtt gtc att gtc ggc192gca act atc ggt atc aag ctg ttt aag aaa ttc acc tcg aaa gca agc240
3.白色念珠菌熱休克蛋白90表位與噬菌體外殼蛋白的雜合蛋白作為製備檢測系統性白色念珠菌感染的待檢者血清中抗體的藥品中的用途。
4.白色念珠菌熱休克蛋白90表位與噬菌體外殼蛋白的雜合蛋白作為製備治療和預防系統性白色念珠菌感染的藥品中的用途。
全文摘要
本發明屬於生物工程中的DNA重組技術領域。利用基因工程技術，將白色念珠菌熱休克蛋白90表位基因片段(LKVIRK)插入到整合有絲狀噬菌體主要外殼蛋白基因的載體中，構建成新的重組載體。在宿主菌中，表位基因產物被分泌到細胞外，並組裝於噬菌體外殼蛋白中，形成雜合蛋白。1〕雜合蛋白可以作為一種抗原與患系統性白色念珠菌感染者血清中的抗體產生免疫應答。2〕雜合蛋白在小鼠體產生了較好的體液免疫和細胞免疫。3〕雜合蛋白在白色念珠菌感染模型鼠的免疫保護和預防實驗中表現出保護作用。所以，這種雜合蛋白可以用來製備診斷、預防和治療系統性白色念珠菌感染的藥品。
文檔編號C07K19/00GK1570104SQ20041004421
公開日2005年1月26日 申請日期2004年5月13日 優先權日2003年9月19日
發明者王麗 申請人:東北師範大學