一種培育高產水稻的方法及專用分子標記的製作方法

2023-07-01 18:17:06 2

專利名稱：一種培育高產水稻的方法及專用分子標記的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種培育高產水稻的方法及專用分子標記。
背景技術：
水稻是重要的糧食作物，近20年來，其在產量方面的潛力沒有取得大的突破。Rangel et al(Rangel PH，Guimaraes EP，Neves PCF.Base genetics DNA cultivatedde arroz(oryza sativa L.)irrigado do Brasil.Pesq Agropec Bras，1996，31349-357)和Tanksley(Tanksleys SD，McCouch SR.Seed banks and molecularmapsUnlocking genetic potential from the wild.Science，1997，2771063-1066)指出育種資源狹窄是造成這種局面的根本原因。因此當前作物育種亟待發掘一批新基因，以拓寬作物遺傳的基礎。而發掘新基因、利用分子標記技術對水稻產量性狀進行選擇正是國內外現在的研究熱點和難點。隨著水稻飽和分子連鎖圖的構建，利用分子標記定位了大量控制水稻產量性狀的數量性狀基因座(QTL)，然而利用分子標記技術對其產量性狀進行改良的報導甚少。
普通野生稻是栽培稻的祖先種，其遺傳多樣性大於栽培稻，野生稻在演化成栽培稻過程中，經過自然選擇和人工選擇，基因多樣性降低，等位基因數減少。據研究，栽培稻的等位基因數約為野生稻的60％(Sun CQ，Wang XK，Li ZC，Yoshimura A.Comparison of the genetic diversity of common wild rice(Oryza rufipogon Griff.)and cultivated rice(O.sativa L.)using RFLP markers.Theor Appl Genet，2001，102157-162)。從野生稻中發掘和利用在栽培稻中已丟失或削弱的優異基因，並把它們應用於水稻育種生產中具有十分重要的理論意義和實踐價值。已經克隆的高抗白葉枯病基因Xa21發現於長花葯野生稻(O.longistaminata)。章琦等(章琦，趙炳宇，趙開軍，王春連，楊文才，林世成，闕更生，周永力，李道遠，陳成斌，朱立煌.普通野生稻的抗水稻白葉枯病新基因Xa-23(t)的鑑定和分子標記定位.作物學報，2000，26(5)536-542)從廣西普通野生稻中找到一個全生育期廣譜高抗基因Xa23。Xiao等(Xiao J，Grandillo S，Ahn SN et al.Gene from wild rice improveyield.Nature，1996，384223-224)從低產的馬來西亞普通野生稻中找到可分別增產17％和18％的兩個QTL。Li等(Li DJ，Sun CQ，Fu YC，Chen L，Zhu ZF，Li C，Cai HW，Wang XK.Identification and mapping of genes for improvingyield from Chinese common wild rice(O.rufipogon Griff.)using advancedbackcross QTL analysis.Chinese Science Bulletin，2002，181533-1537)從我國江西東鄉野生稻中發現並定位了2個高產QTL。但對於水稻產量性狀的基因座(QTL)目前僅停留在定位的階段。
利用分子標記對水稻抗白葉枯病基因、稻瘟病基因的分子標記輔助選擇的技術國內外均有報導，但迄今為止，關於水稻產量性狀QTLs的分子標記選擇技術還未見報導。
野生稻是低產植物，但是存在高產基因，如何發掘野生稻中的高產基因，並且建立野生稻高產基因分子標記選擇技術是世界性的難題。我國野生稻資源豐富，從野生稻中發掘、定位高產基因，尋找與高產基因緊密連鎖的分子標記，建立高產基因分子標記選擇技術並獲得專利保護，不僅為培育超高產新品種提供新基因和新技術，而且對加強我國野生稻基因資源的保護，將資源優勢變成經濟優勢具有重要意義。

發明內容
本發明的目的是提供一種培育高產水稻的方法及專用分子標記。
本發明所提供的培育高產水稻的專用分子標記，是由下述引物對之一經PCR擴增得到1)由序列表中SEQ ID №1和SEQ ID №2組成的引物對，命名為lrk1；2)由序列表中SEQ ID №3和SEQ ID №4組成的引物對，命名為nPM4。
所述專用分子標記位於江西東鄉野生稻第2染色體短臂上的分子標記RM279和Indel12之間的209kb範圍內，並在此範圍內定位到一個可提高水稻產量的QTL，命名為qGY2-1，實驗證明帶有該QTL的滲入系比超高產品種桂朝2號還可增產5-12％。
本發明的第二個目的是提供一種培育高產水稻的方法。
本發明所提供的培育高產水稻的方法，是以具有權利要求1所述分子標記的QTL的品種作父本、需改良的品種作母本雜交，雜交種與需改良品種回交，從得到的回交種中篩選出含有所述QTL的單株，再與需改良品種回交至少2次，最後自交，得到高產的水稻品種；其中，從回交種中篩選出含有所述QTL的單株的方法，是以待測水稻基因組DNA為模板，用由序列表中SEQ ID №1和SEQ ID №2組成的引物對，進行PCR擴增，檢測擴增產物中是否有812bp大小的條帶，同時以待測水稻基因組DNA為模板，用由序列表中SEQ ID №3和SEQ ID №4組成的引物對，進行PCR擴增，檢測擴增產物中是否有1178bp大小的條帶。
用引物對lrk1和nPM4進行篩選時，如擴增產物中分別有812bp和1178bp大小的條帶，待測水稻中含有可提高水稻產量的基因。
PCR擴增的反應體系可為水稻基因組DNA模板20ng，Taq酶0.5U，2.0μl 10×PCR緩衝液(100mM Tris·Cl pH9.0，500mM KCl，15mM Mg2+，1％Triton X-100)，100μMdNTPs，正向引物0.2μM，反向引物0.2μM，用DEPC水補充反應體系至20μl。
PCR反應條件可為先94℃30sec，60℃30sec，72℃1min，共35個循環；再72℃10min。
可通過1％瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增產物中是否有812bp和1178bp大小的條帶。
本發明在江西東鄉野生稻QTL精細定位中開發的分子標記可用於鑑別普通野生稻、栽培稻中是否存在可提高水稻產量的基因，實現對高產水稻植株的選擇。用本發明的方法培育水稻高產新品種具有操作簡單，成本低廉，周期短的優點，適於推廣應用。且因不受其它基因效應和環境因素的影響，可在早代選擇，縮短育種年限，提高育種效率。本發明在水稻的品種改良中具有重要意義。
下面結合附圖及具體實施例對本發明做進一步說明。


圖1為東鄉野生稻和桂朝2號的基因組DNA為模板，分別在引物對lrk1和nPM4的引導下的PCR擴增產物(分子標記)的帶型圖2為在引物對nPM4引導下對一些品種的鑑定結果圖3為在引物對lrk1引導下對一些品種的鑑定結果圖4為超高產品種「桂朝2號」和轉育了QTL qGY2-1的單株的表型具體實施方式
下述實施例中所用方法如無特別說明均為常規方法。
實施例1、可提高水稻產量QTL qGY2-1的發現及定位首先將江西東鄉普通野生稻與超高產品種「桂朝2號」進行雜交和回交，分別構建了以桂朝2號為遺傳背景的高代回交群體和野生稻基因滲入系，再利用SSR標記採用Mapmanage QTX軟體在江西普通野生稻的第2染色體RM233A附近，發現1個能使桂朝2號產量提高的高產QTL(Li DJ，Sun CQ，Fu YC，Chen L，Zhu ZF，Li C，Cai HW，Wang XK.Ident ificat ion and mapping of genes for improving yieldfrom Chinese common wild rice(O.rufipogon Griff.)using advanced backcrossQTL analysis.Chinese Science Bulletin，2002，181533-1537)。在此基礎上，選擇含有該QTL區段的高產滲入系，與桂朝2號回交，構建針對該QTL區段的近等基因系，利用疊代定位方法，對該QTL進行精細定位，將其定位在江西東鄉野生稻第2染色體短臂上的分子標記RM279和Indel12之間的209kb範圍內，將該QTL命名為qGY2-1，田間栽培實驗證明攜帶該高產基因的植株比沒有該基因的植株增產幅度為5-30％，且帶有該QTL的滲入系比超高產品種桂朝2號還可增產5-12％。對該209kb的區間進行水稻基因組序列查詢，結果表明該區間含有8個類植物硫代激動素受體蛋白(LRR-Kinase)基因，這類基因在胡蘿蔔中已被證明具有促進細胞增生的功能(Yoshikatsu M.Mari O.Akiko M.Youji S.An LRR receptor kinase involved inperception of peptide plant hormone.Science，2002，2961470-1472)。
實施例2、可提高水稻產量QTL qGY2-1的篩選及應用1、引物設計及帶型分析根據實施例1獲得的QTL qGY2-1所在區域的日本晴基因組序列，利用DNAsist軟體設計PCR引物對lrk1(序列表中SEQ ID №1和SEQ ID №2)和nPM4(序列表中SEQ ID №3和SEQ ID №4)。
具體方法為以東鄉野生稻和桂朝2號的基因組DNA為模板，分別在引物對lrk1和nPM4的引導下，進行PCR擴增，PCR反應體系為水稻基因組DNA模板20ng，Taq酶0.5U，2.0μl 10×PCR緩衝液(100mM Tris·Cl pH9.0，500mM KCl，15mM Mg2+，1％Triton X-100)，100μM dNTPs，正向引物0.2μM，反向引物0.2μM，用DEPC水補充反應體系至20μl。PCR反應條件為先94℃30sec，60℃30sec，72℃1min，共35個循環；再72℃10min。反應結束，對PCR產物進行1％瓊脂糖凝膠電泳檢測，檢測結果如圖1所示，lrk1在東鄉野生稻中能擴增出812bp的片段，而這個片段在桂朝2號中缺失，nPM4在東鄉野生稻中能擴增出1178bp的片段，在桂朝2號中擴增出的片段只有609bp。結合基因型與表型分析，確認這兩標記與該QTL qGY2-1共分離。因此可依據用上述方法進行PCR擴增的產物中是否同時有812bp和1178bp大小的條帶對水稻品種進行篩選。
2、可提高水稻產量QTL qGY2-1的篩選及高產水稻的培育利用本發明的專用分子標記對所收集到的水稻品種進行QTL(qGY2-1)篩選，把篩選到的含有qGY2-1的品種作供體親本，與不含該QTL而需要改良的目標品種雜交後回交，利用本發明的專用分子標記進行輔助選擇，把該QTL轉育到需要改良的目標品種去。
具體步驟為首先利用本發明的專用分子標記，用步驟1的方法，對需改良的優良株型的品種和收集到的各種不同來源的水稻品種進行鑑定，結果所收集到的品種中含有而需改良的品種不含該QTL，表明可進行轉育改良。接下來，把篩選出的含有QTL(qGY2-1)的品種與需改良品種按生育期長短依次種植，調好花期。在抽穗開花期，以含有QTL(qGY2-1)的品種作父本、需改良的品種作母本雜交，所獲得的雜交種再與需改良品種回交，稱作BC1F1，利用本發明的分子標記在BC1F1群體中篩選出含有該QTL的單株再與需改良品種回交，如此循環幾次，最後自交一次，選擇出產量更高而其它農藝性狀與需改良品種相似的株系，該株系穩定後可推廣。
下面就上述方法利用具體實例來示範可提高水稻產量QTL qGY2-1的篩選及利用收集品種如下K17A，K17B，金23A，金23B，特青，明恢63，瀘恢17，東鄉野生稻，王南25，桂朝2號，E32，8015s，中作8923，中作123，中作9017，H2W44，Y22s，377-60，C418，粵泰A，勝泰1號、日本晴、診富11號，早昭005，鎮88，中粳83-D。
分別提取上述不同水稻品種的基因組DNA，用步驟1的方法，分別在引物對lrk1和nPM4的引導下，進行PCR擴增。反應結束，對PCR產物進行1％瓊脂糖凝膠電泳檢測，檢測結果如圖2和圖3所示(圖2中泳道A為K17A，泳道B為K17B，泳道C為金23A，泳道D為金23B，泳道E為特青，泳道F為明恢63，泳道G為瀘恢17，泳道H為東鄉野生稻，泳道I為王南25，泳道J為桂朝2號，泳道K為E32，泳道L為8015s，泳道M為中作8923，泳道N為中作123，泳道0為中作9017，泳道P為H2W44，泳道Q為Y22s，泳道R為377-60，泳道S為C418，泳道T為粵泰A，泳道U為勝泰1號，泳道V為日本晴；圖3中泳道A為診富11號，泳道B為早昭005，泳道C為鎮88，泳道D為中粳83-D，泳道E-V與圖2中品種相同)，恢復系特青、明恢63、瀘恢17和優良不育系8015s、Y22s及粵泰A在引物對lrk1和nPM4的引導下，可分別擴增出812bp和1178bp的片段，具有和東鄉野生稻相同的基因型，表明這些水稻品種中含有可提高水稻產量的QTL qGY2-1。
已知東鄉普通野生稻中含有而秈稻品種「桂朝2號」中不含QTL qGY2-1，把東鄉普通野生稻與「桂朝2號」進行雜交和回交，利用本發明的分子標記進行輔助選擇，在東鄉普通野生稻為供體的BC4F5群體中選擇到一個含有QTL qGY2-1而其它背景為「桂朝2號」的株系，該株系與「桂朝2號」的農藝性狀相似，但長勢更旺，產量更高，其表型如圖4所示。
序列表1604210121121212DNA213人工序列220
223
4001tcgaggttgg agatgctggt t21210221123212DNA213人工序列220
223
4002aaatgatctg aattggtgtt cgg 23210321123212DNA213人工序列220
223
4003atttcatcgt tggcttatca gtc 23210421122212DNA213人工序列220
223
4004aatcgttcta tgcgcaaagg tt 2權利要求
1.一種培育高產水稻的專用分子標記，是由下述引物對之一經PCR擴增得到1)由序列表中SEQ ID №1和SEQ ID №2組成的引物對；2)由序列表中SEQ ID №3和SEQ ID №4組成的引物對。
2.一種培育高產水稻的方法，是以具有權利要求1所述分子標記的QTL的品種作父本、需改良的品種作母本雜交，雜交種與需改良品種回交，從得到的回交種中篩選出含有所述QTL的單株，再與需改良品種回交至少2次，最後自交，得到高產的水稻品種；其中，從回交種中篩選出含有所述QTL的單株的方法，是以待測水稻基因組DNA為模板，用由序列表中SEQ ID №1和SEQ ID №2組成的引物對，進行PCR擴增，檢測擴增產物中是否有812bp大小的條帶，同時以待測水稻基因組DNA為模板，用由序列表中SEQ ID №3和SEQ ID №4組成的引物對，進行PCR擴增，檢測擴增產物中是否有1178bp大小的條帶。
3.根據權利要求2所述的方法，其特徵在於所述PCR擴增的反應體系為水稻基因組DNA模板20ng，Taq酶0.5U，2.0μl 10×PCR緩衝液，100μM dNTPs，正向引物0.2μM，反向引物0.2μM，用DEPC水補充反應體系至20μl。
4.根據權利要求2或3所述的方法，其特徵在於所述PCR反應條件為先94℃30sec，60℃ 30sec，72℃ 1min，共35個循環；再72℃ 10min。
5.根據權利要求2或3所述的方法，其特徵在於所述檢測擴增產物的方法為1％瓊脂糖凝膠電泳。
全文摘要
本發明公開了一種培育高產水稻的方法及專用分子標記。該分子標記是由下述引物對之一經PCR擴增得到1)由序列表中SEQ ID №1和SEQ ID №2組成的引物對；2)由序列表中SEQ ID №3和SEQ ID №4組成的引物對。用本發明的方法培育水稻高產新品種具有操作簡單，成本低廉，周期短的優點，適於推廣應用。且因不受其它基因效應和環境因素的影響，可在早代選擇，縮短育種年限，提高育種效率。本發明在水稻的品種改良中具有重要意義。
文檔編號A01H1/04GK1765915SQ20051010500
公開日2006年5月3日 申請日期2005年9月26日 優先權日2005年9月26日
發明者孫傳清, 羅小金, 田豐, 李德軍, 朱作峰, 付永彩, 何光明, 楊金水 申請人:中國農業大學