p53蛋白激動多肽及其應用的製作方法
2023-07-01 12:55:36
本發明涉及藥物領域，具體涉及用於治療腫瘤的多肽。
背景技術：
p53蛋白是一種轉錄因子。在細胞處於應激狀態時，可被誘導表達，從而促進細胞進入細胞周期的停滯階段，繼而凋亡或者衰老。現在的研究認為，p53蛋白具有強有力腫瘤抑制功能。p53蛋白被p53基因編碼。p53基因是一種抑癌基因，p53基因是細胞生長周期中的負調節因子，與細胞周期的調控、DNA修復、細胞分化、細胞凋亡等重要的生物學功能有關。p53基因分為野生型和突變型兩種，其產物也有野生型和突變型。野生型p53蛋白極不穩定，半衰期僅數分鐘，並具有反式激活功能和廣譜的腫瘤抑制作用。p53基因的突變(缺失)是人類腫瘤的常見事件，與腫瘤的發生、發展有關。一般認為p53突變與腫瘤的轉移、復發及不良預後相關。在此基礎上，進一步的研究認為p53蛋白是介導細胞凋亡的一個重要因子，通過介導細胞凋亡來發揮抑癌作用的。p53蛋白也可以誘導細胞老化，這已經成為它發揮抑癌作用的一大主要機制。
從p53蛋白作用的分子機制研究中發現，p53蛋白具有上百個的靶基因。p53蛋白通過與這些基因內部或上遊的p53反應元件相結合的方式反式激活這些基因的轉錄。這些靶基因中有很多都與細胞凋亡或細胞周期調控過程有關，比如編碼細胞周期依賴性蛋白激酶抑制蛋白的p21基因和凋亡前體蛋白BAX的編碼基因等，促進細胞死亡或生長停滯。最近，人們又發現microRNA也是受到p53調控的底物之一，其中最重要的就是miR-34家族成員。與此同時，研究還發現p53蛋白也能起到抑制轉錄的作用。p53蛋白不僅對轉錄因子起作用，還對非轉錄因子起作用；不僅有胞內的作用，也有胞質中的作用。這些非轉錄因子作用中最值得一提的就是p53蛋白能夠與胞質中的Bcl2家族蛋白發生相互作用，從而介導凋亡途徑，使得線粒體外膜通透性增高，釋放出細胞色素C，使細胞發生凋亡。由此可見，p53蛋白可以通過多種不同的作用方式來達到抑制基因轉錄的目的。由於p53蛋白在人體腫瘤當中所具有的重要作用，它成為了癌症治療的新靶點。
技術實現要素：
：
本發明目的是針對現有腫瘤患者治療的藥物特點，設計一種p53蛋白激動多肽，能有效治療腫瘤。
技術方案
一種p53蛋白激動多肽，其序列為SEQ ID NO1。所述多肽的治療腫瘤的應用。其用途可通過多種給藥方式治療腫瘤，包括皮下或肌肉注射，靜脈注射或者靜脈滴注等實現。所述P53蛋白激動多肽用於促進p53蛋白活性。
有益結果：
本發明中的p53蛋白激動多肽序列SEQ ID NO1，可以靶向促進p53蛋白活性，促進p53蛋白產生的效應，從而抑制腫瘤的生長，達到治療腫瘤的效果。試驗結果表明：本發明能夠抑制體外的多種腫瘤細胞活性，以及腫瘤模型裸鼠的腫瘤的生長。同時，本發明能夠抑制微管蛋白聚合，促進腫瘤細胞中p53蛋白表達。達到治療腫瘤的效果。
具體實施方式
p53蛋白激動多肽由上海生工吉爾合成。
實施例1
p53蛋白激動多肽的體外細胞增殖活性測定
採用MTT比色法。將對數生長的U937細胞，以1.0×105加入96孔培養板中，培養24h，實驗孔、陽性藥物對照孔分別加入不同濃度的實驗藥物p53蛋白激動多肽；空白組加入相同體積的溶劑。每孔設五個復孔，培養48h，每孔加入MTT，作用4h後，加入DMSO，孵育30min，在酶標儀570nm處測定吸光度A值，按公式細胞生長增殖抑制率＝(實驗組吸光值/對照組吸光值-1)×100％。計算出實驗藥物的IC50為54.20nmol/L。
實施例2
P53蛋白激動多肽對肝瘤細胞HePG2細胞中P53蛋白表達的影響：將HEPG2細胞用含10％胎牛血清(FBS)的RPMI-1640培養基，在37℃、5％CO2的培養箱中培養至90％以上的匯合度時，用0.25％胰蛋白酶消化細胞，計數，3000rpm離心5min收集細胞；加入10％小牛血清的RPMI 1640培養液(5ml)懸浮細胞，細胞計數，調整細胞濃度為5*106個/ml，於6孔培養板中培養。實驗設空白對照組、P53蛋白激動多肽各劑量(5、10、20mg/ml)組。各組分別加入HEPG2細胞懸液600μl/孔後，空白對照組加入1640培養液600μl，P53蛋白激動多肽各劑量組在加入不同濃度的多肽。按20μl/1×105個細胞加入蛋白質提取液，吹吸打散細胞，4℃放置30min使細胞裂解，用於檢測細胞裂解液中P53蛋白表達量。
結果顯示，P53蛋白激動多肽處理的HEPG2細胞中P53蛋白表達明顯升高。HEPG2細胞細胞裂解液中中P53蛋白表達(29.71±16.87pg/(mg總蛋白)(p<0.05)，175.29±25.41pg/(mg總蛋白)(p<0.05)，45.62±20.32pg/(mg總蛋白)(p<0.05))，與HEPG2細胞對照組相比有顯著性差異。由此可見，P53蛋白激動多肽能促進HEPG2細胞中P53蛋白表達。
實施例3
用腫瘤模型檢測P53蛋白激動多肽的體內效應。
建立乳腺癌瘤腫瘤模型，將處於對數生長期的OVCAR-3T細胞用胰蛋白酶於37℃消化後，收集培養液，生理鹽水清洗2～3次。用生理鹽水將細胞濃度調整為2×107個/mL，接種於C57BL/6裸鼠右前肢腋部皮下，每隻0.1mL。1w～2w後裸鼠腫瘤體積長到100～200mm3，剖取其瘤組織在無菌條件下碾磨，製備成1×107個/mL細胞懸液，接種於C57BL/6裸鼠右前肢腋部皮下，每隻0.1mL。1w～2w後裸鼠腫瘤體積長到70～100mm3後，裸鼠隨機分成4組，每組10隻。(1)空白組；(2)P53蛋白激動多肽低劑量組；(3)P53蛋白激動多肽中劑量組；(4)P53蛋白激動多肽高劑量組。建立卵巢癌腫瘤模型，方案為：空白組加入相同體積的溶劑，實驗組P53蛋白激動多肽(上海生工吉爾合成)設3個劑量：20、40、80mg/Kg，在腫瘤周圍多點注射。連續給藥21天後，觀察裸鼠存活數量，計算存活率。結果顯示，P53蛋白激動多肽可有效地保護小白鼠，提高荷瘤裸鼠的生存率，生存率達到69.3％。建立乳腺癌瘤腫瘤模型，陽性對照藥物紫杉醇；空白組加入相同體積的溶劑，實驗組多肽(上海生工合成)設3個劑量：2、4、8mg/Kg。21天後，觀察裸鼠存活數量，計算存活率。結果顯示，P53蛋白激動多肽可有效地保護裸鼠，提高荷瘤裸鼠的生存率，80mg/Kg時的生存率達到49.3％。
實施例4
p53蛋白激動多肽對體外微管蛋白聚合與解聚的作用。
取新鮮牛腦組織，剝去腦膜和大的血管，剪碎，用冷MES緩衝液洗滌1-2次，以每克腦組織0.5-1ml的比例加入MES緩衝液，在4℃下，用電動勻漿器勻漿；4℃，105000g離心1h，取上清，加入等體積的微管聚合緩衝液，37℃水浴保溫30min。26℃，105000g離心1h，取沉澱，加入約1/10勻漿體積的冷MES緩衝液，輕輕攪拌或用勻漿器將沉澱碾碎；將懸液放冰浴30min，使沉澱完全溶解。用Lowry’s法測定蛋白含量(SDS聚醯胺凝膠電泳法)。微管蛋白用MES緩衝液稀釋至4-5mg/ml，置液氮中保存。取冷凍的微管蛋白溶液，快速用常溫水衝其壁，使之融化，放入冰浴，用MES緩衝液稀釋至所需濃度(2-3mg/ml)，加入ATP至1mmol/l。以從冰浴中馬上取出的微管蛋白溶液在分光光度計350nm處調定為「0」點。然後將比色杯在37℃溫度下測定微管蛋白溶液的OD值，連續20-30min，記錄溫度-吸光值曲線(T-OD曲線)，重複三次。抑制率計算：抑制率(％)＝(對照管OD值－加藥管OD值)/對照管OD值。
實驗組設3個劑量：0.75μM、3μM、24μM，陽性對照組長春新鹼劑量3μM，空白組加入等體積的溶劑DMSO；按上述操作測定吸光值。結果，隨p53蛋白激動多肽濃度增加，聚合抑制率逐漸下降，說明有聚合能力的微管蛋白隨藥物濃度的增加而不斷減少。
SEQUENCE LISTING
羅瑞雪
p53蛋白激動多肽及其應用
1
PatentIn version 3.5
1
49
PRT
人工序列
1
Cys Pro Val Gln Leu Trp Val Asp Ser Thr Pro Pro Pro Gly Thr Arg
1 5 10 15
Val Arg Ala Met Ala Ile Tyr Lys Gln Ser Gln His Met Thr Glu Val
20 25 30
Val Arg Arg Cys Pro His His Glu Arg Cys Ser Asp Ser Asp Gly Leu
35 40 45
Ala