ATP合成酶β亞基在製備免疫保護劑、疫苗或抗細菌感染劑上的應用的製作方法
2023-07-01 12:50:06
ATP合成酶β亞基在製備免疫保護劑、疫苗或抗細菌感染劑上的應用的製作方法
【專利摘要】本發明屬於醫藥【技術領域】，具體涉及ATP合成酶β亞基在製備免疫保護劑、疫苗或抗細菌感染劑上的應用。更具體地說，涉及大腸埃希菌ATP合成酶β亞基在製備免疫保護劑、疫苗或抗細菌感染劑上的應用。本發明通過主動免疫和被動免疫試驗發現大腸埃希菌ATP合成酶β亞基蛋白能夠提高動物抵抗細菌，尤其是耐藥細菌的能力，從而克服動物對細菌感染的問題。本發明所提供的蛋白質，比現有的主要使用抗生素作為抗細菌藥物的應用上，具有更高的安全性和操作性，並保證良好的效果。
【專利說明】ATP合成酶β亞基在製備免疫保護劑、疫苗或抗細菌感染劑上的應用
【技術領域】
[0001]本發明屬於醫藥【技術領域】，具體涉及ATP合成酶β亞基在製備免疫保護劑、疫苗或抗細菌感染劑上的應用，更具體地，涉及大腸埃希菌ATP合成酶β亞基(ATP synthasesubunit beta, AtpB)在製備免疫保護劑、疫苗或抗細菌感染劑上的應用。
【背景技術】
[0002]近年來 細菌耐藥日趨嚴峻，成為醫藥界倍受關注的問題。由於抗生素濫用造成細菌耐藥性問題尤為突出。我國臨床分離的一些細菌對某些藥物的耐藥性已居世界首位。除耐青黴素的肺炎鏈球菌、耐甲氧西林的金黃色葡萄球菌、腸球菌、真菌等多種耐藥菌外，進入我國僅20多年的喹諾酮類抗生素的耐藥率已經達60%~70%。由於在抗生素使用與病原菌耐藥水平之間存在著一種宏觀的量化關係，即一定範圍內的抗生素使用可以導致病原菌整體耐藥水平以及耐藥菌感染率的變化。由此，人和動物的腸道正常菌群暴露於抗生素而普遍產生耐藥性，並通過糞便直接汙染環境、水、食品，導致耐藥菌不斷增加，也使人體接觸耐藥菌的機會不斷增加。因此耐藥菌的種類非常廣泛。這樣一來，人體如果再獲得耐藥菌的感染治療起來就比較困難。因此，控制目前已經廣泛存在的耐藥菌已成為一個重要的社會和科學問題。
[0003]耐藥菌的防治尚不能完全寄托在新抗生素的發現和發明，因為抗生素的生產與發展伴隨著細菌耐藥性的不斷發展，一種新的抗生素投入使用後，很快就發現有相應的抗性菌株出現。在細菌中普遍存在的抗藥性是對抗菌藥物的生產開發及對細菌性疾病防治的一個巨大挑戰，直接危害食品安全和人類健康。目前尚無發現利用小分子物質提高動物對耐藥菌抵抗能力的報導。
【發明內容】
[0004]本發明要解決的技術問題是為了克服現有技術的不足，提供一種小分子物質在製備免疫保護劑、疫苗或抗細菌感染劑上的應用。
[0005]本發明是通過以下技術方案予以實現的:
本發明通過主動免疫和被動免疫試驗發現ATP合成酶β亞基蛋白能夠提高動物抵抗細菌，尤其是耐藥細菌的能力，從而克服動物對細菌感染的問題。所以，本發明公開了 ATP合成酶β亞基基因在製備免疫保護劑、疫苗或抗細菌感染劑上的應用，所述ATP合成酶β亞基基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
[0006]本發明公開了 ATP合成酶β亞基蛋白在製備免疫保護劑、疫苗或抗細菌感染劑上的應用，所述ATP合成酶β亞基蛋白的胺基酸序列如SEQ ID Ν0:2所示。
[0007]本發明公開了 ATP合成酶β亞基的抗體在製備免疫保護劑、疫苗或抗細菌感染劑上的應用。所述的ATP合成酶β亞基的抗體為ATP合成酶β亞基單克隆抗體、ATP合成酶β亞基多克隆抗體或ATP合成酶β亞基基因工程抗體。優選地，所述ATP合成酶β亞基多克隆抗體的製備方法包括如下步驟:S1.抗原的製備:將ATP合成酶β亞基蛋白(AtpB)溶解於水中，加入弗氏完全佐劑後，超聲處理即的抗原；所述的ATP合成酶β亞基蛋白的終濃度為Mg~lmg。S2.抗體的製備:將步驟SI製備得到的抗原注射免疫動物後，取血，析出血清後，離心，取上清液即得AtpB抗血清，AtpB抗血清中含有ATP合成酶β亞基多克隆抗體。更優選地，所述抗原分三次免疫動物，首次免疫採用高劑量(80~Il(^g)的抗原，後兩次採用低濃度(40~6(^g)的抗原注射。每次注射間隔12~16天。[0008]ATP合成酶β亞基單克隆抗體和ATP合成酶β亞基基因工程抗體的製備方法可以參考本【技術領域】的常規方法進行製備得到。
[0009]作為優選方案，如上所述ATP合成酶β亞基為大腸埃希菌ATP合成酶β亞基。
[0010]作為優選方案，本發明所述的抗細菌感染劑為抗抗生素耐藥細菌感染劑；所述的抗生素包括丁胺卡那、氨苄青黴素、巴洛沙星、頭孢他啶、鹽酸克林黴素、慶大黴素、四環素和/或羅紅黴素。
[0011]作為優選方案，本發明所述的免疫保護劑為提高動物對耐藥菌抵抗能力的免疫保護劑。
[0012]與現有技術相比，本發明具有以下有益效果:
本發明通過大腸埃希菌ATP合成酶β亞基蛋白主動或被動免疫動物，以提高機體的免疫力，而不是使用化學療法殺滅病原菌，因此，本發明消除了使用抗生素存在的潛在危害。本發明更不是通過加大抗生素的使用量來殺滅耐藥菌，從而消除了使用大量抗生素存在的潛在危害。總之本發明為防治耐藥菌提供了一條完全創新、安全的途徑。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0013]圖1為AtpB基因PCR擴增產物的瓊脂糖凝膠電泳分析結果，其中M為DNA分子量標準。
[0014]圖2為重組AtpB基因雙酶切鑑定結果，其中M為DNA分子量標準。
[0015]圖3為AtpB表達的聚丙烯醯胺凝膠電泳檢測結果，其中M為蛋白質分子量標準。
[0016]圖4為AtpB純化產物的聚丙烯醯胺凝膠電泳檢測結果，其中M為蛋白質分子量標準。
[0017]圖5為AtpB蛋白免疫後從第一天到第14天昆明鼠的死亡情況。
【具體實施方式】
[0018]下面結合說明書附圖和具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用於說明本發明而不用於限制本發明的範圍。下列實施例中未註明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件，例如Sambrook等分子克隆實驗室手冊(2001 by Cold Spring HarborLaboratory Press)中所述的條件,或按照製造廠商所建議的條件。
[0019]實施例1:大腸埃希菌ATP合成酶β亞基蛋白的製備和純化
首先擴增得到大腸埃希菌ATP合成酶β亞基基因全長，然後將全長的ATP合成酶β亞基基因編碼序列構建入大腸埃希菌原核表達系統中，以表達和提純目的蛋白。大腸埃希菌ATP合成酶β亞基AtpB基因編碼序列如SEQ ID NO:1所示，大腸埃希菌ATP合成酶β亞基蛋白的胺基酸序列如SEQ ID Ν0:2所示。具體步驟如下:S1.大腸埃希菌ATP合成酶β亞基基因的擴增
根據NCBI公布的大腸埃希菌的全基因組序列，設計一對引物:
正向引物 F: 5』 -GGCAAGCTTATGGCTACTGGAAAGATT-3』(如 SEQ ID NO: 3 );
反向引物 R:5』-GCGCTCGAGTTAAAGTTTTTTGGCT-3』(如 SEQ ID Ν0:4)。
[0020]為便於克隆和表達載體的構建，在引物上分別引入限制性內切酶位點歷和通01。引物由英濰捷基(上海)貿易有限公司合成。
[0021]以熱變性法獲得的大腸埃希菌的全基因組為模板，進行PCR反應，反應體系如下:
【權利要求】
1.ATP合成酶β亞基基因在製備免疫保護劑、疫苗或抗細菌感染劑上的應用，所述ATP合成酶β亞基基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
2.ATP合成酶β亞基蛋白在製備免疫保護劑、疫苗或抗細菌感染劑上的應用，所述ATP合成酶β亞基蛋白的胺基酸序列如SEQ ID Ν0:2所示。
3.ATP合成酶β亞基的抗體在製備免疫保護劑、疫苗或抗細菌感染劑上的應用。
4.根據權利要求1至3任一項所述應用，其特徵在於，所述ATP合成酶β亞基為大腸埃希菌ATP合成酶β亞基。
5.根據權利要求3所述應用，其特徵在於，所述ATP合成酶β亞基的抗體為ATP合成酶β亞基單克隆抗體、ATP合成酶β亞基多克隆抗體或ATP合成酶β亞基基因工程抗體。
6.根據權利要求1至3任一項所述應用，其特徵在於，所述的抗細菌感染劑為抗抗生素耐藥細菌感染劑；所述的 抗生素包括丁胺卡那、氨苄青黴素、巴洛沙星、頭孢他啶、鹽酸克林黴素、慶大黴素、四環素和/或羅紅黴素。
7.根據權利要求1至3任一項所述應用，其特徵在於，所述的免疫保護劑為提高動物對耐藥菌抵抗能力的免疫保護劑。
【文檔編號】A61K38/43GK103690938SQ201310696629
【公開日】2014年4月2日 申請日期:2013年12月18日 優先權日:2013年12月18日
【發明者】彭宣憲, 李惠, 程志學 申請人:中山大學