一種應用於檢測線粒體dnaa1555g、c1494t突變的混合液及試劑盒和檢測系統的製作方法
2023-07-01 10:03:06 1
專利名稱：一種應用於檢測線粒體 dna a1555g、c1494t 突變的混合液及試劑盒和檢測系統的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種檢測母系遺傳性耳聾線粒體DNAA1555G和C1494T突變情況的試劑盒及其使用方法；特別是一種應用於檢測線粒體DNAA1555G、C1494T突變的混合液及試劑盒和檢測系統。
背景技術：
線粒體DNA (MitochondriaDNA, mtRNA)突變是引起感音神經性耳聾的重要原因之一，這些突變主要是位於線粒體12SrRNA、tRNA基因上，位於12SrRNA基因的同質性A1555G和C1494T突變與氨基糖苷類抗導致的非症候群型耳聾相關。自1962年發現世界上首例線粒體疾病患者以來，人類已經發現了很多種由於線粒體功能障礙而導致的疾病。近十年來已經明確了幾個與耳聾有關的線粒體突變。由於人類線粒體的唯一功能是通過氧化磷酸化參與人體化學能量的產生，因此線粒體突變幹擾能量的產生進而導致全身神經肌肉功能障礙就不足為奇了，引起聽力損害也只是它的特徵之一。然而，令人驚奇的是遺傳的線粒體突變被發現也是非症候群性耳聾的原因之一，獲得性·線粒體突變已被提出是老年性聾的原因之一。氨基糖甙類抗生素耳毒性是後天獲得性耳聾最常見的原因。不但大劑量、長時間的用藥可引起耳蝸一前庭損害，有時小劑量的用藥也可造成耳聾，提示存在遺傳易感性的可能。Konigsmark等在1976年對大多數已發現的具氨基糖式類耳毒性聾的家族的資料進行了總結，得出結論對氨基糖甙類抗生素耳毒性易感性遺傳可能是伴不完全外顯率的常染色體顯性遺傳。同時，他們也注意到此遺傳具非父系遺傳特性，由此得出結論此遺傳可能是多因素作用而產生的。1989年Higashi回顧了有關文獻後提出，對所觀察到的母系遺傳最可能的解釋是線粒體DNA缺陷。1993年，Prezant等報導了三個中國家系，數個成員在使用氨基糖甙類抗生素後發生耳毒性聾，三個家系中均證實有呈母系遺傳的mtDNA 12SrRNA基因1555鹼基A —G突變。隨後，非洲、西班牙、日本、蒙古、南美、以色列也有家系報導。在中國、日本、蒙古還有一些散發病例的報導，這些散發病例無家族史，都有耳毒性聾和mtDNA1555A — G突變。同一線粒體DNA突變和耳聾存在於核基因很不相同的遺傳學背景更肯定了該突變的致病性。線粒體DNA (mtDNA) 12SrRNA是氨基糖甙類抗生素導致的非症候群型聽力損失的主要突變熱點區域。在這些突變位點中，位於12SrRNA高度保守的解碼區的同質性的A1555G和C1494T突變與耳聾相關，這兩個突變導致很多患者的氨基糖甙類抗生素中毒性耳聾。A1555G突變和C1494T突變會在12SrRNA的高度保守的A位形成新的1494C-G1555或1494U-A1555鹼基對。這些改變使得12SrRNA在二級結構上與細菌的16SrRNA的相應區域的二級結構更加容易，這就是為何攜帶這些突變的人在接觸了氨基糖甙類抗生素時會出現或加重耳聾的原因。攜帶A1555G突變和C1494T突變的細胞的生化特徵是線粒體蛋白質合成的異常並隨之引起細胞的呼吸功能異常。而且當用含高濃度的巴龍黴素或新黴素的DMEM培養基來培養攜帶這兩個突變的細胞系時，可以觀察到這些細胞與對照細胞系相比會出現生長缺陷和線粒體內蛋白的翻譯異常。這些觀察為以下結論提供了直接的遺傳和生化方面的證據，即A1555G突變和C1494T突變是導致氨基糖甙類抗生素誘導的非症候群型耳聾的致病性的mtDNA突變。自1993年以來，國內外檢測線粒體DNA A1555G和C1494T突變的方法，有PCR直接測序、PCR-限制性片段長度多態性(PCR-RFLP)技術、單位點螢光染料PCR進行測定；測序很難做到臨床推廣；酶切技術雖然成本低，但是臨床操作較麻煩且很難做到防止汙染，因為其技術在PCR擴增結束後要再次開蓋進行後續的酶切和跑膠；還有以生物晶片技術檢測該突變的技術，生物晶片試劑盒是為快速、高通量篩查已知遺傳突變位點專門設計的，但生物晶片試劑盒檢測涉及特殊儀器及大批數據處理分析對實驗室設備、環境和操作人員要求較高，且費用昂貴，難以在一般醫院或實驗室推廣使用；螢光染料PCR法檢測，只能檢測一個突變位點；還有高解析度溶解曲線法，用溶解曲線檢測的特異性很難做到保證，且要求軟體分析程序複雜，需專人操作；因此迫切需要一種可以在很多醫院現有設備上即能檢測，並操作簡便、快速、準確性高、特異性強的母系遺傳性耳聾線粒體DNA突變檢測方法及試劑盒，以滿足對線粒體DNA A1555G和C1494T突變進行廣泛篩查的需要。
發明內容
本發明是要提供一種螢光探針PCR檢測線粒體DNA A1555G、C1494T突變的方法及試劑盒；其做到了僅用兩條引物和四條LNA探針，應用多重螢光探針PCR在一個反應體系裡同時檢測出兩個突變位點的突變情況，避免了螢光發光基團的螢光信號相互幹 擾；檢測時間短，直接用提取好的模版檢測一般用時I個小時即可一管出兩個位點的結果，不需要後期開蓋，可在擴增過程中直接讀取位點的突變情況。本發明的技術方案之一一種應用於檢測線粒體DNA A1555G、C1494T突變的混合液包括弓丨物Fl、R1和四條探針NI、N2、Ml、M2的混合液；第一條引物序列Fl是有意義鏈，為上遊通用引物，第二條引物序列Rl是反義鏈，為下遊通用引物；四條探針分別為以人體線粒體DNA為模板在線粒體DNA Al555位點設計的野生型探針一條和突變型探針一條，另在線粒體DNA C1494位點處設計的野生型探針一條和突變
型探針一條。優選所述一對引物是依據已公開的人類線粒體DNA序列設計的；第一條引物序列Fl是有意義鏈，為上遊通用引物，位於線粒體DNA的核苷酸序列1445-1465bp之間，其序列為序列表中的SEQ ID NO: I ;第二條引物序列Rl是反義鏈，為下遊通用引物，位於線粒體DNA的核苷酸序列1589-1608bp之間，其序列為序列表中的SEQ ID N0:2，也包括這兩條引物的互補鏈。四條探針之間不能存在相互幹擾四條探針的四種螢光發光猝滅基團不能相互抑制或抵消，以便發出四種不同波長的螢光信號能區分兩個位點的四種表現。所述四條探針是包括應用TaqMan-LNA、TaqMan-MGB> TaqMan-AllGlo技術標記設計的探針。第一條探針NI的序列，在線粒體DNA C1494T的突變型位點附近設計，是有意義鏈，也包括其互補鏈，位於線粒體DNA的核苷酸序列1484-1497bp之間，其序列為序列表中的SEQ ID NO: 3 ;第二條探針N2的序列，在線粒體DNA 1494的野生型位點附近設計，是有意義鏈，也包括其互補鏈，位於線粒體DNA的核苷酸序列1483-1498bp之間，其序列為序列表中的SEQ ID NO:4 ;第三條探針Ml的序列，在線粒體DNA A1555G的突變型位點附近設計，是反義鏈，也包括其互補鏈，位於線粒體DNA的核苷酸序列1548-1563bp之間，其序列為序列表中的SEQ ID NO:5 ;第四條探針M2的序列，在線粒體DNA 1555的野生型位點附近設計，是反義鏈，也包括其互補鏈，位於線粒體DNA的核苷酸序列1548-1562bp之間，其序列為序列表中的SEQ ID NO:6。所述四條探針採用TaqMan-LNA技術標記設計的探針，採用TaqMan-LNA技術標記設計的探針分別帶有以下發光猝滅螢光基團及LNA鹼基；第一條探針NI為線粒體DNAC1494T的突變型LNA探針，其5'末端標記的是CY5螢光報告基團，3'末端標記的是BHQl螢光猝滅基團，加LNA鹼基；第二條探針N2為線粒體DNA 1494的野生型LNA探針，其5'末端標記的是ROX螢光報告基團，3'末端標記的是BHQl螢光猝滅基團，加LNA鹼基；第三條探針Ml為線粒體DNAA1555G的突變型LNA探針，其5'末端標記的是HEX螢光報告基團，3'末端標記的是BHQl螢光猝滅基團，加LNA鹼基；第四條探針M2為線粒體DNA 1555的野生型LNA探針，其5'末端標記的是FAM螢光報告基團，3'末端標記的是BHQl螢光猝滅基團，加LNA鹼基。各引物是·引物Fl:5' GAGTGCTTAGTTGAACAGGGC 3'；引物Rl:5' CACTCTGGTTCGTCCAAGTG 3'；探針的具體序列探針 NI :5' CY5-CGCC+C+GTCA+CTCTC - BHQ13'，+ 為 LNA 鹼基；探針N2:5' R0X-CCGCCCGTCACCCTCC-BHQ13'；探針Ml :5' HEX-ACGACTTGCCT+C+CT+CT - BHQ13'，+ 為 LNA 鹼基；探針M2 :5' FAM-CGA+CTTGTCT+C+CT+CT - BHQl3'，+ 為 LNA 鹼基。本發明的技術方案之二一種試劑盒包含以上所述的一種應用於檢測線粒體DNAA1555G、C1494T突變的混合液，還包括提取基因組DNA試劑、一管陰性對照DNA、一管陽性對照DNA和PCR反應混合液。優選它包括(I)提取人體基因組DNA試劑；(2)引物F1、R1和探針NI、N2、Ml、M2的混合液；(3)—管陰性對照DNA ;—管同時攜帶線粒體A1555G和C1494T突變位點的陽性對照 DNA ；(4)PCR 反應混合液包括Tag DNA 聚合酶、MgCl2、10 XPCR 緩衝液、dNTP 和 ddH20。本發明的技術方案之三一種使用多重實時螢光探針PCR檢測線粒體DNA A1555G、C1494T突變的檢測系統包括能夠檢測四色螢光的螢光探針PCR儀和PCR管；所述PCR管中裝有權利要求1-6所述的混合液、PCR反應混合液。優選引物F1、R1和探針NI、N2、Ml、M2是在線粒體DNA設計一對引物，在線粒體DNA 1555位點設計野生型探針M2 —條和突變型探針Ml —條，另在線粒體DNA1494位點處設計野生型探針N2 —條和突變型探針NI —條，以人體線粒體DNA為模板，在一個反應體系裡應用多重實時螢光探針PCR檢測線粒體DNA A1555G、C1494T的突變。
本發明的技術方案之四檢測系統的檢測方法為將提取好的人體DNA模板、引物F1、R1和探針N1、N2、M1、M2的混合液、PCR反應混合液等一起加入一個PCR管裡，再分別設立陽性對照組和陰性對照組，應用能以檢測四色螢光的多重實時螢光探針PCR儀，設置好反應條件，即根據不同波長的螢光信號得到線粒體DNA1555和1494位點的突變情況。優選PCR擴增一段靶序列即用實時螢光探針PCR檢測此靶序列中的兩個或多個位點的單核苷酸多態性SNP，即利用一對引物和四條或多條螢光探針同時實時檢測兩個或多個突變位點；在利用這一對上下遊引物在擴增延伸過程中，利用taq DNA聚合酶的5『_3』外切酶活性分別對與其靶序列相結合的探針降解，即一次循環上遊引物延伸時能檢測到一條探針的螢光信號，下遊引物延伸時也能檢測到一條探針的螢光信號，以便一個反應管裡發出四種不同波長的螢光信號能區分兩個位點的四種表現。本發明具有以下特點
(I)本發明的試劑盒中所用的引物和探針均經過大量實驗仔細設計，做到了僅用兩條引物和四條LNA探針，應用多重螢光探針PCR在一個反應體系裡同時檢測出兩個突變位點的突變情況，經過嚴格試驗調試避免了螢光發光基團的螢光信號相互幹擾。(2)理論上，樣本基因組DNA經一次PCR反應，即在反應體系中僅加入了針對突變型位點(A1555G、C1494T)的探針NI、MI就可檢測出突變位點，但同時我們還使用了野生型位點(1555、1494 )的探針N2、M2，對未突變的位點進行驗證結果，同時確認了此位點的突變情況。也就是說，同一個樣本基因組DNA同一個位點經過突變型和野生型兩個探針同時驗證，從而使結果更加準確、可信。(3)本發明檢測突變位點應用螢光探針檢測有其他方法無可比擬的優勢，檢測時間短，直接用提取好的模版檢測一般用時I個小時即可一管出兩個位點的結果，不需要後期開蓋，可在擴增過程中直接讀取位點的突變情況。(4)應用本發明檢測線粒體DNA A1555G/C1494T突變位點比測序法、限制性酶切法、溶解曲線法等，靈敏度高、特異性好、準確性高、線性穩定、可控汙染性低、操作流程簡單、結果判定直觀；現在一般醫院都有實時螢光定量PCR儀，無需再另置設備即可實現全面推廣；所以本試劑盒可適合一般醫院、分子生物學實驗室推廣，便於在全國範圍內施行母系遺傳藥物耳聾線粒體DNAA155G、C1494T突變的大規模篩查和預防性檢查，從而可有效減少氨基糖甙類抗生素敏感人群發生藥物性耳聾機會。
圖I是攜帶線粒體DNAA1555G突變型的樣本PCR擴增曲線圖。圖2是線粒體DNA 1555野生型的樣本PCR擴增曲線圖。圖3是攜帶線粒體DNAC1494T突變型的樣本PCR擴增曲線圖。圖4是線粒體DNA 1494野生型的樣本PCR擴增曲線圖。
具體實施例方式以下是結合實例說明本發明線粒體DNA1555、1494位點突變四色實時螢光PCR檢測方法和試劑盒，以使使用者更好的理解本發明在實際應用中的特點。
I、引物和探針設計應用Primer5. O軟體協助設計引物和探針，以已公開的人類線粒體DNA( 12SrRNA)參考序列(NCBI資料庫序列NC 01920)為模板，進行引物和探針設計，設計方案如下(I)針對線粒體DNA 1555和1494兩個位點放在一對引物之間進行有效擴增，上遊引物Fl的3'末端要在位點1494以前，下遊引物Rl的3'末端要在位點1555以後；上遊引物Fl :5' GAGTGCTTAGTTGAACAGGGC 3' (SEQ ID NO: I)，長 21bp，位於線粒體DNA核酸序列1445-1465bp之間。下遊引物Rl :5' CACTCTGGTTCGTCCAAGTG 3' (SEQ ID NO: 2)，長 20bp，是位於線粒體DNA核酸序列1589-1608bp之間的反義鏈。
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(2)針對線粒體DNAC1494T位點突變型和野生型設計兩條和上遊引物同向的探針，並在其5'末端分別標記不同的螢光發光基團、3'末端BHQl猝滅基團和中間加上LNA
喊基;線粒體DNA C1494T 突變型探針 NI :5' CY5-CGCC+C+GTCA+CTCTC - BHQ13' (SEQID NO: 3)，長14bp，位於線粒體DNA核酸序列1484_1497bp之間，+為LNA鹼基。線粒體DNA 1494 野生型探針 N2 :5' ROX-CCGCCCGTCACCCTCC - BHQ13' (SEQ IDNO: 4),長16bp,位於線粒體DNA核酸序列1483_1498bp之間。(3)針對線粒體DNAA1555G位點突變型和野生型設計兩條和上遊引物同向的探針，並在其5'末端分別標記不同的螢光發光基團、3'末端BHQl猝滅基團和中間加上LNA
喊基;線粒體DNAA1555G 突變型探針 Ml :5' HEX-ACGACTTGCCT+C+CT+CT - BHQl3; (SEQIDN0:5)，長16bp，位於線粒體DNA核酸序列1548_1563bp之間，+為LNA鹼基。線粒體DNA 1555 野生型探針 M2 :5' FAM-CGA+CTTGTCT+C+CT+CT - BHQl3; (SEQID NO:6)，長15bp，位於線粒體DNA核酸序列1548_1562bp之間，+為LNA鹼基。2、線粒體DNAA1555G、C1494T位點突變四色實時螢光PCR檢測試劑盒的組成(50人份/盒)(I)提取基因組DNA試劑(2)引物(F1、R1)和探針(N1、N2、M1、M2)的混合液(3 ) I管陰性對照DNA，濃度20ng/uI，IOOuI ; I管陽性對照DNA，濃度20ng/uI，IOOul ；(4) PCR 反應混合液包括=TagDNA 聚合酶、MgCl2、10XPCR 緩衝液、dNTP 和 ddH20。3、檢測樣本選擇攜帶線粒體DNAA1555G突變的母系遺傳藥物性耳聾患者5個和攜帶線粒體DNA C1494T突變的母系遺傳藥物性耳聾患者3個作為受檢者，再選擇5個正常人作為受檢者，共計受檢人數13人。4、基因組DNA提取分別抽取13個受檢者的靜脈抗凝全血O. 5-5ml，各取O. 5ml抗凝全血到I. 5mlEP管中，分別加入IOOOml紅細胞裂解液(20mmol/L Tris-HCL, pH7. 6)室溫靜置5分鐘，充分裂解紅細胞，12000rpm離心I分鐘，收集白細胞沉澱；再向此EP管中加入700ul的紅細胞裂解液和5ul的蛋白酶K溶液，充分混合均勻，65°C水浴消化15分鐘，待消化液降至室溫，加入250ul預冷的醋酸鉀溶液,充分混合均勻,此時可見明顯的蛋白沉澱，12000rpm低溫離心10分鐘，取上清約800ul置另一乾淨的I. 5ml的EP管中，再加入700ul異丙醇，上下顛倒混合10次混勻，靜置10分鐘沉澱DNA，12000rpm離心5分鐘，小心棄去上清，加750ul75%乙醇洗滌DNA，12000rpm離心2分鐘，棄去上清，重複洗滌一次；開蓋揮發乾燥5分鐘，用TE緩衝液溶解後_20°C保存備用。5、提取好的樣本DNA用可檢測四色波長的多通道實時螢光PCR儀擴增檢測；將上述設計好的一對引物和四條探針序列，通過人工合成並標記(委託生物公司)，以上述提取好的樣本DNA為模板，加入引物(F1、R1)和探針(N1、N2、M1、M2)的混合液、PCR反應混合液；再同時設立陽性對照DNA組、陰性對照DNA組、無模板對照組。表I 一個PCR擴增反應體系
權利要求
1.一種應用於檢測線粒體DNA A1555G、C1494T突變的混合液，其特徵在於所述混合液包括引物F1、R1和四條探針NI、N2、Ml、M2的混合液； 第一條引物序列Fl是有意義鏈，為上遊通用引物，第二條引物序列Rl是反義鏈，為下遊通用引物； 四條探針分別為以人體線粒體DNA為模板在線粒體DNA A1555位點設計的野生型探針一條和突變型探針一條，另在線粒體DNA C1494位點處設計的野生型探針一條和突變型探針一條。
2.如權利要求I所述的一種應用於檢測線粒體DNAA1555G、C1494T突變的混合液，其特徵在於所述一對引物是依據已公開的人類線粒體DNA序列設計的；第一條引物序列Fl是有意義鏈，為上遊通用引物，位於線粒體DNA的核苷酸序列1445-1465bp之間，其序列為序列表中的SEQ ID NO: I ;第二條引物序列Rl是反義鏈，為下遊通用引物，位於線粒體DNA的核苷酸序列1589-1608bp之間，其序列為序列表中的SEQ ID NO:2，也包括這兩條引物的互補鏈。
3.如權利要求I或2所述的一種應用於檢測線粒體DNAA1555G、C1494T突變的混合液，其特徵在於四條探針之間不能存在相互幹擾四條探針的四種螢光發光猝滅基團不能相互抑制或抵消，以便發出四種不同波長的螢光信號能區分兩個位點的四種表現。
4.如權利要求1-3任一項所述的一種應用於檢測線粒體DNAA1555G、C1494T突變的混合液，其特徵在於所述四條探針是包括應用TaqMan-LNA、TaqMan-MGB, TaqMan-AllGlo技術標記設計的探針。
5.如權利要求1-4任一項所述的一種應用於檢測線粒體DNAA1555G、C1494T突變的混合液，其特徵在於第一條探針NI的序列，在線粒體DNA C1494T的突變型位點附近設計，是有意義鏈，也包括其互補鏈，位於線粒體DNA的核苷酸序列1484-1497bp之間，其序列為序列表中的SEQ ID NO: 3 ;第二條探針N2的序列，在線粒體DNA 1494的野生型位點附近設計，是有意義鏈，也包括其互補鏈，位於線粒體DNA的核苷酸序列1483-1498bp之間，其序列為序列表中的SEQ ID N0:4 ;第三條探針Ml的序列，在線粒體DNAA1555G的突變型位點附近設計，是反義鏈，也包括其互補鏈，位於線粒體DNA的核苷酸序列1548-1563bp之間，其序列為序列表中的SEQ ID NO: 5 ;第四條探針M2的序列，在線粒體DNA 1555的野生型位點附近設計，是反義鏈，也包括其互補鏈，位於線粒體DNA的核苷酸序列1548-1562bp之間，其序列為序列表中的SEQ ID N0:6。
6.如權利要求1-5任一項所述的一種應用於檢測線粒體DNAA1555G、C1494T突變的混合液，其特徵在於所述四條探針採用TaqMan-LNA技術標記設計的探針，採用TaqMan-LNA技術標記設計的探針分別帶有以下發光猝滅螢光基團及LNA鹼基；第一條探針NI為線粒體DNA C1494T的突變型LNA探針，其5'末端標記的是CY5螢光報告基團，3'末端標記的是BHQl螢光猝滅基團，加LNA鹼基；第二條探針N2為線粒體DNA1494的野生型LNA探針，其5'末端標記的是ROX螢光報告基團，3'末端標記的是BHQl螢光猝滅基團，加LNA鹼基；第三條探針Ml為線粒體DNAA1555G的突變型LNA探針，其5'末端標記的是HEX螢光報告基團，3'末端標記的是BHQl螢光猝滅基團，加LNA鹼基；第四條探針M2為線粒體DNA 1555的野生型LNA探針，其5'末端標記的是FAM螢光報告基團，3'末端標記的是BHQl螢光猝滅基團，加LNA鹼基。
7.如權利要求1-6任一項所述的一種應用於檢測線粒體DNAA1555G、C1494T突變的混合液，其特徵在於； 各引物是引物 FI : 5' GAGTGCTTAGTTGAACAGGGC 3'； 引物 Rl:5' CACTCTGGTTCGTCCAAGTG 3'； 探針的具體序列 探針 NI :5' CY5-CGCC+C+GTCA+CTCTC - BHQ13'，+ 為 LNA 鹼基；探針 N2 :5' ROX-CCGCCCGTCACCCTCC - BHQ13'； 探針 Ml :5' HEX-ACGACTTGCCT+C+CT+CT - BHQ13'，+ 為 LNA 鹼基；探針 M2 :5' FAM-CGA+CTTGTCT+C+CT+CT - BHQl3'，+ 為 LNA 鹼基。
8.一種試劑盒，其特徵在於包含如權利要求1-7任一項所述的一種應用於檢測線粒體DNAA1555G、C1494T突變的混合液，還包括提取基因組DNA試劑、一管陰性對照DNA、一管陽性對照DNA和PCR反應混合液。
9.如權利要求8所述的一種試劑盒，其特徵在於它包括 (1)提取人體基因組DNA試劑； (2)引物Fl、Rl和探針NI、N2、Ml、M2的混合液； (3)一管陰性對照DNA ;—管同時攜帶線粒體A1555G和C1494T突變位點的陽性對照DNA ； (4)PCR反應混合液包括Tag DNA聚合酶、MgCl2UOXPCR緩衝液、dNTP和ddH20。
10.一種使用多重實時螢光探針PCR檢測線粒體DNA A1555G、C1494T突變的檢測系統，其特徵在於包括能夠檢測四色螢光的螢光探針PCR儀和PCR管；所述PCR管中裝有權利要求1-6所述的混合液、PCR反應混合液。
11.根據權利要求10所述的一種使用多重實時螢光探針PCR檢測線粒體DNAA1555G、C1494T突變的檢測系統，其特徵是引物F1、R1和探針N1、N2、M1、M2是在線粒體DNA設計一對引物，在線粒體DNA 1555位點設計野生型探針M2 —條和突變型探針Ml —條，另在線粒體DNA 1494位點處設計野生型探針N2 —條和突變型探針NI —條，以人體線粒體DNA為模板，在一個反應體系裡應用多重實時螢光探針PCR檢測線粒體DNAA1555G、C1494T的突變。
12.如權利要求10或11所述的一種使用多重實時螢光探針PCR檢測線粒體DNAA1555G、C1494T突變的檢測系統，其特徵在於檢測系統的檢測方法為將提取好的人體DNA模板、引物FI、Rl和探針NI、N2、Ml、M2的混合液、PCR反應混合液等一起加入一個PCR管裡，再分別設立陽性對照組和陰性對照組，應用能以檢測四色螢光的多重實時螢光探針PCR儀，設置好反應條件，即根據不同波長的螢光信號得到線粒體DNA 1555和1494位點的突變情況。
13.如權利要求12所述的一種使用多重實時螢光探針PCR檢測線粒體DNAA1555G、C1494T突變的檢測系統，其特徵在於檢測系統的檢測方法為PCR擴增一段靶序列即用實時螢光探針PCR檢測此靶序列中的兩個或多個位點的單核苷酸多態性SNP，即利用一對引物和四條或多條螢光探針同時實時檢測兩個或多個突變位點；在利用這一對上下遊引物在擴增延伸過程中，利用taq DNA聚合酶的5 『_3』外切酶活性分別對與其靶序列相結合的探針降解，即一次循環上遊引物延伸時能檢測到一條探針的螢光信號，下遊引物延伸時也能檢測到一條探針的螢光信號，以便一個反應管裡發出四種不同波長的螢光信號能區分兩個位點的四種表現。
全文摘要
本發明公開了一種應用於檢測線粒體DNA A1555G、C1494T突變的混合液及試劑盒和檢測系統，是應用一對特異性引物、4條攜帶不同螢光基團的LNA探針在一個反應體系裡多重實時檢測線粒體DNA 1555位點、1494位點的野生型和突變型，該試劑盒包括人體基因組DNA提取試劑、引物和探針的混合液、PCR反應混合液、陰性對照DNA、陽性對照DNA。本發明提供了用本試劑盒可同時快速檢測母系遺傳藥物性耳聾相關的線粒體DNA A1555G、C1494T突變，該方法較單獨的線粒體DNA A1555G、C1494T突變檢測操作簡單、快速、結果直觀、準確可靠、特異性強、靈敏度高，利於推廣和應用。
文檔編號C12Q1/68GK102787169SQ201210300590
公開日2012年11月21日 申請日期2012年8月22日 優先權日2012年8月22日
發明者曹力, 郭麗敏 申請人:郭麗敏