一種連續結晶生物製造丁二酸的裝置及方法

2023-07-01 13:12:06 3

專利名稱：一種連續結晶生物製造丁二酸的裝置及方法
技術領域：
本發明涉及丁二酸發酵與分離純化領域，具體地，本發明涉及一種連續結晶生物製造丁二酸的裝置及方法。
背景技術：
丁二酸(Succinic Acid 又名 Succinic Acid,Butanedioic Acid),被美國 FDA 認定為「一般認為安全」(GRAS)，因此可以用於多種用途。2004年美國能源部的一份報告指出，丁二酸是合成大宗日用品和重要化學品的平臺化學物質，有著巨大的經濟價值，隨著能源緊缺，利用生物發酵法製造丁二酸的前景非常廣闊。丁二酸成本主要由發酵過程和分離費用組成，其中分離純化的成本佔總生產成本的60%以上，如何降低發酵和分離成本是國內外的研究熱點，已經出現了一定數量的專利。目前專利及文獻中報導的丁二酸的分離純化方法主要有鈣鹽法(CN101643400、US5143834)、液液萃取法(US5, 773，653)、吸附法(CN101348428、CN101348429、CN101811953A)、電滲析法(CN101486637A)、膜分離(CN101748161A)等方法。這些分離純化的手段都會遇到副產物雜酸、雜質、碳源、蛋白和無機鹽的影響；並且將結晶操作作為最後的純化步驟以精製丁二酸。丁二酸分離純化的難度主要在於它與副產物有機羧酸的性質太類似。從理化性質上分析，這些短鏈的有機羧酸分子室溫下物理化學行為相似，增加了丁二酸分離的選擇性難題。目前在丁二酸的製備過程中，通常是先進行發酵，發酵完成進行膜過濾，結晶，再進行純化，對應每個過程的裝置也是單獨的、分開的，因此先發酵後放罐進行處理，而且在丁二酸發酵過程中，丁二酸的積累會抑制發酵過程，降低產物濃度，是阻礙丁二酸發酵產業化的重要因素；同時由於丁二酸的每部分裝置都是獨立的，造成了丁二酸的生產不能連續的進行。現有的微生物發酵法生產丁二酸的過程大都是間歇操作，即發酵完成後放罐，放罐料液進入下遊分離純化的化工單元操作，周期長，時間產率低；各個單元之間彼此孤立，通常一個單元超負荷運作同時，其它單位停車，生產效率很低。在製備丁二酸的過程中不可避免的會產生其它副產物有機酸、丁二酸根離子(丁二酸鹽)和蛋白，這些副產物的產生也會對丁二酸的發酵體系產生抑制，限制了丁二酸產業的發展。因此為解除產物的抑制作用，需要將發酵產物及時轉移，降低產物濃度，解除產物的抑制作用，推動發酵過程向丁二酸轉化，強化丁二酸發酵過程，提高底物轉化率。

發明內容
本發明的目的在於為了克服上述問題提供了一種連續結晶生物製造丁二酸的裝置。本發明的再一目的在於提供了一種連續結晶生物製造丁二酸的方法。為了克服上述問題本發明的連續結晶生物製造丁二酸的裝置包括生物反應器
I、錯流膜組件2和結晶分離罐3 ；
所述的錯流膜組件2的前端通過管路連通生物反應器I，錯流膜組件2的濾過端連通結晶分離罐3底部，結晶分離罐3的頂部連通反應器1，使該裝置形成迴路，實現了丁二酸的連續發酵、結晶；所述的生物反應器I和錯流膜組件2之間設置蠕動泵9 ；所述的錯流膜組件2後端和生物反應器I連通，實現了流穿發酵液在兩者之間的循環。作為上述方案的一種改進，所述的結晶分離罐3為若干個，該結晶分離罐3頂部通過一三通閥門分別連通生物反應器I、相鄰結晶分離罐3 ;所述的若干結晶分離罐3並聯後的管路上設置一蠕動泵9，通過該蠕動泵9連通一低位儲液罐5，用於母液的儲存。 作為上述方案的又一種改進，所述的結晶分離罐3的底部通過一三通閥門分別連通錯流膜組件2和相鄰結晶分離罐3 ;所述的若干結晶分離罐3並聯後的管路連通一低位儲液罐5，用於母液的儲存。作為上述方案的再一種改進，所述的生物反應器I的中部連通若干中位儲液罐7，兩者之間設置蠕動泵9 ;生物反應器I的上部連通若干高位儲液罐8，兩者之間設置蠕動泵9。作為上述方案的再一種改進，所述的生物反應器I的下部連通供氣源6，生物反應器I和供氣源6之間設置流量計11。作為上述方案的再一種改進，所述的錯流膜組件2的前端和生物反應器I之間的管路上以及錯流膜組件2的濾過端和結晶分離罐3之間的管路上分別設置閥門。作為上述方案的再一種改進，所述的連通錯流膜組件2後端和生物反應器I的管路上、連通結晶分離罐3的頂部和反應器I的管路上以及三通閥內部均設置壓力閥10。作為上述方案的還一種改進，所述裝置還包括一中央控制系統4，該中央控制系統4用於控制錯流膜組件2、結晶分離罐3、閥門、壓力閥10和流量計11的控制。本發明還提供了一種連續結晶生物製造丁二酸的方法，該方法通過將錯流膜組件2的前端連通至生物反應器1，錯流膜組件2的濾過端連通至結晶分離罐3底部，結晶分離罐3的頂部連通至反應器I形成迴路，並在生物反應器I和錯流膜組件2之間設置蠕動泵9，實現了丁二酸的連續發酵、結晶；所述方法包括以下步驟I) 丁二酸的發酵無菌條件下，在發酵液中加入種子液，接種量的體積百分比為5 7 %，攪拌，通入過濾除菌的二氧化碳氣體，進行發酵，隨發酵進行發酵液中酸度降低，中央控制系統控制酸度中和劑進入生物反應器I，使生物反應器I中酸度為中性，繼續發酵，得到丁二酸發酵液；2)步驟I)中發酵液中丁二酸濃度超過30g/L時，中央控制系統4啟動錯流膜過濾操作，實現發酵液在生物反應器I和錯流膜組件2之間的循環，生物細胞和培養基固形物被截留，循環匯入生物反應器1，部分含有丁二酸鹽的發酵液濾過膜組件進入結晶分離罐3 ;3)結晶分離罐3中的濾過液中丁二酸濃度超過30g/L時，中央控制系統4啟動結晶分離操作，調節結晶分離罐3中pH小於2. 0，降低結晶罐溫度至4°C，得到並收集丁二酸晶體沉澱，結晶分離罐3中清液循環進入生物反應器I中循環發酵。作為上述方案的一種改進,所述的步驟I)中攪拌速度為125 150rpm ;所述的步驟I)酸度中和劑為碳酸鎂、氫氧化鈉或氨水；所述的步驟I)通入二氧化碳氣體的氣體流速≥0. 25vvm ;所述的步驟I)發酵溫度為30 50°C。本發明的連續原位低溫結晶生物製造丁二酸裝置包含一個生物反應器I (發酵罐)，一個錯流微濾膜組件2，兩個並聯低溫結晶分離罐3，一個中央控制系統4，兩個低位儲液罐5，一個供氣源6，一個中位儲液罐7，兩個高位儲液罐8，五個蠕動9泵，六個壓力閥10，兩個流量計11，一個閥門以及全套設備相應管路。一個錯流微濾膜組件2前端通過一個二通閥門連接生物反應器I (發酵罐)；濾過端通過一個二通閥門連接兩個低溫結晶罐，濾過液進入低溫結晶罐進行丁二酸沉澱；後端通過一個二通閥門連接生物反應器I (發酵罐)，流穿液循環進入生物反應器I (發酵罐)與發酵培養基混合。兩個並聯的低溫結晶分離罐3的底部均開有循環液進口，低溫結晶分離罐3的頂部均開有循環液出口 ；循環液迴路的循環液總管路，在該總管路上帶有4個三通閥門、2個二通閥門；所述的在低溫結晶分離罐上部處的循環液總管路上的兩個三通閥門的三個埠，分別通過管路與所述低溫結晶分離罐頂部的循環液出口、與生物反應器I連通的一總管路、及連通該兩個三通閥門之間的管路相連通，且第一個並聯的低溫結晶分離罐3的循環液出口處管路上的三通閥門的一埠，與連通三通閥門的一埠的管路相連通，該三通閥門的一埠通過管路與生物反應器I (發酵罐)相連通；所述的中央控制系統通過在線測量丁二酸濃度，當丁二酸濃度超過30g/L時，啟動錯流膜過濾操作，實現發酵液在生物反應器I (發酵罐)和膜組件之間的循環。同時測量進入結晶罐中濾過液丁二酸濃度，調節pH和溫度，當丁二酸濃度超過30g/L時，啟動結晶罐。利用低溫結晶原位提取丁二酸的連續發酵裝置原位提取丁二酸的工藝所述如下無菌操作條件下，在發酵液中加入種子液，接種量的體積百分比為5 7%。此時丁二酸量為0，開啟攪拌，生物反應器攪拌槳的轉速為125rpm 150rpm，通入過濾除菌的二氧化碳氣體，氣體流速≥0. 25vvm,在37 39°C條件下發酵。發酵過程中丁二酸濃度逐漸累積，使得發酵液中酸度降低，中央控制系統控制酸度中和劑如碳酸鎂、氫氧化鈉、氨水等及時進入生物反應器I (發酵罐)發酵罐中酸度為中性，微生物發酵產生的丁二酸與酸度中和劑反應生成丁二酸鹽。當丁二酸濃度超過30g/L時，啟動錯流膜過濾操作，實現發酵液在生物反應器I (發酵罐)和膜組件之間的循環。當進入結晶罐中的濾過液中丁二酸濃度超過30g/L時，啟動結晶分離操作，即調節結晶罐中pH環境小於2. 0，逐漸降低結晶罐溫度為4°C，出現丁二酸晶體沉澱，收集丁二酸晶體沉澱，結晶罐中清液循環進入生物反應器I (發酵罐)中併入發酵液循環發酵。本發明的連續結晶生物製造丁二酸的方法在發酵過程中以NaOH為發酵過程的酸度中和劑，控制PH值近中性、溫度37°C左右的發酵條件下進行，發酵液的pH值遠高於丁二酸和副產物有機酸的的PKa (乙酸(Ka = 6.2X10_5)，甲酸(Ka = 2. I X 10_4)，乳酸(Ka =1.37X10—4)，丁二酸(Kal = 2. IXlO-4, Ka2 = 2. 3X 10_6))，所以，發酵液中這些酸幾乎都以酸根離子的形態存在於溶液中，因此消除了酸度過高對發酵體系的抑制，同時通過發酵、分離、結晶工藝的耦合，及時的將發酵後得到的丁二酸發酵液移除進行下一步工藝，因此成功的解決了發酵產物對發酵體系的抑制，並且實現了連續的生產。同時由於以酸根離子的形態存在的丁二酸、丁二酸一氫鈉、丁二酸二鈉的溶解度巨大差異，在4°C，pH I. 9，丁二酸的溶解度為29g/L左右，而其它副產物有機酸、丁二酸根離子(丁二酸鹽)和蛋白卻溶解在水溶液中，因此，可以採用降溫降PH的操作，當體系的酸度降至I. 9、溫度降至O 4°C之間時，過飽和的丁二酸晶體就會析出，直接結晶並回收丁二酸晶體，而其它有機酸則保留在水環境中，實現多種有機酸的分離；因此通過本發明的裝置和方法不僅解除了微生物所處發酵體系的產物抑制，強化了發酵過程，而且實現了多種有機酸的分離，極大降低了副產物的丁二酸生產中的影響。本發明的一種連續結晶生物製造丁二酸的裝置和方法，克服產物對丁二酸發酵的抑制，實現了連續發酵生產丁二酸的工藝，實現了丁二酸發酵和低溫結晶分離丁二酸的工藝的耦合。本發明的裝置是將低溫結晶罐與丁二酸生物反應器耦合，原位提取丁二酸結晶沉澱，利用錯流微濾膜分離組件實現了發酵液的固液分離，進入低溫結晶罐濾過液含有丁 二酸鹽，不含微生物細胞和培養基固形物並調節低溫結晶罐的溫度和PH環境，實現丁二酸鹽向丁二酸分子轉換，以及丁二酸原位分離，建立一個低溫結晶原位提取丁二酸發酵分離的耦合系統，滿足消毒滅菌和無汙染連續運轉。


圖I為本發明的連續結晶生物製造丁二酸的裝置示意圖；圖2為25°C時不同pH下丁二酸的溶解度分布示意圖；圖3為不同溫度下丁二酸的溶解度分布示意圖；圖4為不同溫度下丁二酸一鈉的溶解度分布示意圖；圖5為不同溫度下丁二酸二鈉的溶解度分布示意圖。附圖標識I、生物反應器 2、錯流微濾膜組件 3、結晶分離罐4、中央控制系統5、低位儲液罐 6、供氣源7、中位儲液罐8、高位儲液罐9、螺動泵10、壓力閥11、流量計
具體實施例方式下面結合圖I和實施例對本發明進一步說明。雖然下例實施例只列舉了連續低溫原位結晶生物製造丁二酸的過程工藝，但是因本發明可以廣泛應用於發酵過程中因產物濃度增加而產生抑制作用的酸性初級代謝物和次級代謝物的生產，以及利用結晶技術原位提取的工藝，所以本發明的權利要求並不限於下例實施例。如圖I所示，本發明的連續原位低溫結晶生物製造丁二酸設備包含一個生物反應器I (發酵罐)，一個錯流微濾膜組件2，兩個並聯低溫結晶分離罐3，一個中央控制系統4，兩個低位儲液罐5，一個供氣源6，一個中位儲液罐7，兩個高位儲液罐8，五個蠕動泵9，六個壓力閥10，兩個流量計11，一個閥門以及全套設備相應管路。本發明中錯流膜組件2的前端通過管路連通生物反應器I，錯流膜組件2的濾過端連通結晶分離罐3底部，結晶分離罐3的頂部連通反應器1，使該裝置形成迴路，實現了丁二酸的連續發酵、結晶；生物反應器I和錯流膜組件2之間設置蠕動泵9 ;錯流膜組件2後端和生物反應器I連通，實現了流穿發酵液在兩者之間的循環。
一個錯流微濾膜組件2前端通過一個二通閥門連接生物反應器I (發酵罐)；濾過端通過一個二通閥門連接兩個低溫結晶罐3，濾過液進入低溫結晶罐3進行丁二酸沉澱；後端通過一個二通閥門連接發酵罐，流穿液循環進入發酵罐與發酵培養基混合。兩個並聯的低溫結晶分離罐3的底部均開有循環液進口，低溫結晶分離罐的頂部均開有循環液出口 ；循環液迴路的循環液總管路，在該總管路上帶有4個三通閥門、2個二通閥門；所述的在低溫結晶分離罐3上部處的循環液總管路上的兩個三通閥門的三個埠，分別通過管路與所述低溫結晶分離罐頂部的循環液出口、與生物反應器連通的一總管路、及連通該兩個三通閥門之間的管路相連通，且第一個並聯的低溫結晶分離罐3的循環液出口處管路上的三通閥門的一埠，與連通三通閥門的一埠的管路相連通，該三通閥門的一埠通過管路與產物儲液罐和錯流微濾膜組件3相連通；所述的中央控制系統4通過在線測量丁二酸濃度，當丁二酸濃度超過30g/L時，啟動錯流膜過濾操作，實現發酵液在發酵罐和膜組件之間的循環。同時測量進入結晶罐中濾過液丁二酸濃度，調節PH和溫度，當丁二酸濃度超過30g/L時，啟動結晶罐。實施例I、如圖I所示生物反應器為自動控溫、調節pH、補料的發酵罐，發酵所選微生物採用丁二酸放線桿菌(Actinobacillus succinogenes),又名130ZT,保存於美國菌種保藏中心(ATCC)，編號ATCC55618。培養基的配製保存培養基和活化培養基為營養豐富的TSB培養基；種子培養基配方(單位g/L)葡萄糖10，酵母粉6，NaCl 1，MgCl22，CaCl2L 5，Na2HP042. 9，NaH2PO4 2. 2 ;種子培養基配方(單位g/L)葡萄糖30，酵母粉15，尿素2，KCl4，MgCl22, MnCl2O. 07，CaCl2L 5，Na2HP044. 4，NaH2P043. 3，調節 pH 值為 6. 4 6. 9，121。。滅菌30分鐘。無菌操作條件下，在發酵液中加入種子液，接種量的體積百分比為5 7%。此時丁二酸量為0，開啟攪拌，生物反應器攪拌槳的轉速為125rpm 150rpm，通入過濾除菌的二氧化碳氣體，氣體流速> 0. 2vvm,在37 39°C條件下發酵。表I產丁二酸放線桿菌分批發酵結果
權利要求
1.一種連續結晶生物製造丁二酸的裝置，所述的裝置包括生物反應器(I)、錯流膜組件(2)和結晶分離罐(3);其特徵在於， 所述的錯流膜組件(2)的前端通過管路連通生物反應器(I)，錯流膜組件(2)的濾過端連通結晶分離罐(3)底部，結晶分離罐(3)的頂部連通反應器(I)，使該裝置形成迴路，實現了丁二酸的連續發酵、結晶； 所述的生物反應器(I)和錯流膜組件(2)之間設置蠕動泵(9)； 所述的錯流膜組件(2)後端和生物反應器(I)連通，實現了流穿發酵液在兩者之間的循環。
2.根據權利要求I所述的連續結晶生物製造丁二酸的裝置，其特徵在於，所述的結晶分離罐(3)為若干個，該結晶分離罐(3)頂部通過一三通閥門分別連通生物反應器(I)、相鄰結晶分離罐(3);所述的若干結晶分離罐(3)並聯後的管路上設置一蠕動泵(9)，通過該蠕動泵(9)連通一低位儲液罐(5)，用於母液的儲存。
3.根據權利要求I所述的連續結晶生物製造丁二酸的裝置，其特徵在於，所述的結晶分離罐(3)的底部通過一三通閥門分別連通錯流膜組件(2)和相鄰結晶分離罐(3);所述的若干結晶分離罐(3)並聯後的管路連通一低位儲液罐(5)，用於母液的儲存。
4.根據權利要求I所述的連續結晶生物製造丁二酸的裝置，其特徵在於，所述的生物反應器(I)的中部連通若干中位儲液罐(7)，兩者之間設置蠕動泵(9);生物反應器(I)的上部連通若干高位儲液罐(8)，兩者之間設置蠕動泵(9)。
5.根據權利要求I所述的連續結晶生物製造丁二酸的裝置，其特徵在於，所述的錯流膜組件(2)的前端和生物反應器(I)之間的管路上以及錯流膜組件(2)的濾過端和結晶分離罐(3)之間的管路上分別設置閥門。
6.根據權利要求I所述的連續結晶生物製造丁二酸的裝置，其特徵在於，所述的生物反應器(I)的下部連通供氣源￠)，生物反應器(I)和供氣源(6)之間設置流量計(11)。
7.根據權利要求I或6所述的連續結晶生物製造丁二酸的裝置，其特徵在於，所述的連通錯流膜組件(2)後端和生物反應器(I)的管路上、連通結晶分離罐(3)的頂部和反應器(I)的管路上以及三通閥內部均設置壓力閥(10)。
8.根據權利要求7所述的連續結晶生物製造丁二酸的裝置，其特徵在於，所述裝置還包括一中央控制系統(4)，該中央控制系統(4)用於控制錯流膜組件(2)、結晶分離罐(3)、閥門、壓力閥(10)或流量計(11)的控制。
9.一種連續結晶生物製造丁二酸的方法，該方法通過將錯流膜組件(2)的前端連通至生物反應器(I)，錯流膜組件(2)的濾過端連通至結晶分離罐(3)底部，結晶分離罐(3)的頂部連通至反應器(I)形成迴路，並在生物反應器(I)和錯流膜組件(2)之間設置蠕動泵(9)，實現了丁二酸的連續發酵、結晶； 所述方法包括以下步驟 1)丁二酸的發酵無菌條件下，在發酵液中加入種子液，接種量的體積百分比為5 7 %，攪拌，通入過濾除菌的二氧化碳氣體，進行發酵，隨發酵進行發酵液中酸度降低，中央控制系統控制酸度中和劑進入生物反應器1，使生物反應器I中酸度為中性，繼續發酵，得到丁二酸發酵液； 2)步驟I)中發酵液中丁二酸濃度超過30g/L時，中央控制系統(4)啟動錯流膜過濾操作，實現發酵液在生物反應器(I)和錯流膜組件(2)之間的循環，生物細胞和培養基固形物被截留，循環匯入生物反應器(I)，部分含有丁二酸鹽的發酵液濾過膜組件進入結晶分離罐(3)； 3)結晶分離罐(3)中的濾過液中丁二酸濃度超過30g/L時，中央控制系統(4)啟動結晶分離操作，調節結晶分離罐(3)中pH小於2. O，降低結晶罐溫度至4°C，得到並收集丁二酸晶體沉澱，結晶分離罐(3)中清液循環進入生物反應器I中循環發酵。
10.根據權利要求9所述的連續結晶生物製造丁二酸的方法，其特徵在於，所述的步驟I)中攪拌速度為125 150rpm ;所述的步驟I)酸度中和劑為碳酸鎂、氫氧化鈉或氨水；所述的步驟I)通入二氧化碳氣體的氣體流速> 0. 25vvm ;所述的步驟I)發酵溫度為 30 50。。。
全文摘要
本發明涉及一種連續結晶生物製造丁二酸的裝置及方法，所述的裝置包括生物反應器(1)、錯流膜組件(2)和結晶分離罐(3)；所述的錯流膜組件(2)的前端通過管路連通生物反應器(1)，錯流膜組件(2)的濾過端連通結晶分離罐(3)底部，結晶分離罐(3)的頂部連通反應器(1)，使該裝置形成迴路，實現了丁二酸的連續發酵、結晶；所述的生物反應器(1)和錯流膜組件(2)之間設置蠕動泵(9)；所述的錯流膜組件(2)後端和生物反應器(1)連通，實現了流穿發酵液在兩者之間的循環。本發明的一種連續結晶生物製造丁二酸的裝置和方法，建立了一個低溫結晶原位提取丁二酸發酵分離的耦合系統，滿足消毒滅菌和無汙染運轉。
文檔編號C07C51/43GK102634442SQ201110035318
公開日2012年8月15日 申請日期2011年2月10日 優先權日2011年2月10日
發明者宋子煜, 張雲劍, 李強, 王丹, 邢建民 申請人:中國科學院過程工程研究所