一種靈芝孢子油製劑中靈芝孢子油含量的檢測方法
2023-07-01 09:19:51
專利名稱：一種靈芝孢子油製劑中靈芝孢子油含量的檢測方法
技術領域：
本發明涉及藥品檢測方法領域，特別是涉及一種靈芝孢子油製劑中靈芝孢子油含量的檢測方法。
背景技術：
靈芝孢子(Ganoderma lucidiumspore)是靈芝生長成熟期從菌蓋彈射出來極其細小的孢子，為靈芝的生殖細胞，具有靈芝的全部遺傳活性物質。靈芝孢子的藥理作用主要有抗腫瘤、免疫調節、調節血脂以及對神經、心血管和呼吸系統有調節改善作用。靈芝孢子油為靈芝孢子通過破壁後採用超臨界萃取或有機溶劑提取等方法獲得的油質狀提取物。靈芝孢子油的化學成分複雜，主要含油脂類、脂肪酸類、 甾醇類和三萜類等成分。現代藥理研究表明靈芝孢子油是靈芝孢子抗腫瘤、免疫調節、調節血脂的的主力。而三萜類成分特別是靈芝酸類成分為靈芝、靈芝孢子中活性最強的成分。
現有的檢測靈芝孢子油製劑中靈芝孢子油含量的方法是採用可見分光光度法檢測藥物中總三萜(以熊果酸計)的含量，其標準為總三萜含量15～24.9％以上。因該方法在總三萜化合物的測定過程中，採用了熊果酸作為對照品，但在靈芝、靈芝孢子粉、靈芝孢子油的三萜成分的研究結果中，未發現有熊果酸存在，在測定過程中應採用其三萜中的代表成分作為對照品更為妥當；而且該方法在總三萜化合物的測定過程中，採用了以高氯酸氧化顯色、用可見分光光度法比色測定，在測定過程中，隨著顯色的時間、顯色的溫度、測定的時間等不同而測定結果的差異較大，測定結果的重現性差，測定結果不穩定；又因該方法在總三萜化合物的測定過程中，沒有對總三萜進行分離，直接採用了靈芝孢子油以高氯酸氧化顯色，而靈芝孢子油中存在的大量的長鏈脂肪烴類成分亦能被高氯酸氧化顯色，從而使測定出現假陽性結果，應用該方法測定其它食用植物油也能測出較高含量，無法與藥物中靈芝孢子油三萜成分的含量形成一一對應的關係，因此，以靈芝孢子油直接用高氯酸氧化顯色，來檢測靈芝孢子油製劑中靈芝孢子油三萜成分的含量容易受到靈芝孢子油其它成分的幹擾，不利於在生產中控制和監測藥品的質量。
發明內容
本發明的口的在於克服現有靈芝孢子油含量檢測方法上存在的不足，提供一種檢測質量穩定，容易控制的靈芝孢子油含量的檢測方法。
為了實現上述目的，本發明採用如下技術方案1、靈芝孢子油製劑中靈芝酸E的含量測定對照品溶液的製備精密稱取經五氧化二磷乾燥過夜的靈芝酸E對照品，加甲醇製成每1ml含0.001～0.100mg的溶液，即得對照品溶液；供試品溶液的製備精密稱定靈芝孢子油製劑5.0～15.0g，加石油醚50～150ml溶解，加入已處理好的矽膠柱(10g，18mm×400mm)上，加入100～200ml乙酸乙酯∶石油醚(60～90℃)＝65～75∶35～25的混合溶液洗脫，棄去洗脫液，矽膠柱繼續加入100～200ml乙酸乙酯∶甲醇＝80～90∶20～10的混合溶液洗脫，收集洗脫液，回收溶劑至幹，殘渣加甲醇溶解，轉移至2ml量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，即得供試品溶液；用高效液相色譜法測定用十八烷基矽烷鍵合矽膠為填充劑；乙腈-0.1％甲酸或乙酸溶液28～45∶72～55為流動相；檢測波長為252nm；理論板數按靈芝酸E峰計算，不低於1500；測定結果分別精密吸取對照品溶液與供試品溶液各10μl，注入高效液相色譜儀，測定，計算；檢測標準為每1.0g靈芝孢子油製劑中靈芝酸E的含量在0.001mg～0.050mg之間，即靈芝酸E的含量應在0.010％～0.50％之間。
上述的靈芝孢子油製劑為膠囊(包括靈芝孢子油軟膠囊、自乳化靈芝孢子油軟膠囊、靈芝孢子油充液膠囊)、乳劑、顆粒劑、針劑、滴丸、膜劑或氣霧劑等臨床可接受的劑型。
當靈芝孢子油製劑為靈芝孢子油軟膠囊、自乳化靈芝孢子油軟膠囊或靈芝孢子油充液膠囊時，靈芝酸E的含量測定方法還可採用如下方法色譜條件用十八烷基矽烷鍵合矽膠為填充劑；乙腈-0.1％甲酸溶液31∶69為流動相；檢測波長為252nm；理論板數按靈芝酸E峰計算，不低於1500；對照品溶液的製備精密稱取經五氧化二磷乾燥過夜的靈芝酸E對照品，加甲醇製成每1ml含0.010mg的溶液，即得對照品溶液；供試品溶液的製備取靈芝孢子油軟膠囊或自乳化靈芝孢子油軟膠囊或靈芝孢子油充液膠囊樣品30粒，剪開，傾出內容物，混勻，精密稱取10.0g，加石油醚100ml溶解，加入已處理好的矽膠柱(10g，18mm×400mm)上，加入150ml乙酸乙酯∶石油醚(60～90℃)＝70∶30的混合溶液洗脫，棄去洗脫液，矽膠柱繼續加入150ml乙酸乙酯∶甲醇＝85∶15的混合溶液洗脫，收集洗脫液，回收溶劑至幹，殘渣加甲醇溶解，轉移至2ml量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，即得供試品溶液；測定結果分別精密吸取對照品溶液與供試品溶液各10μl，注入高效液相色譜儀，測定，計算；檢測標準為每1.0g靈芝孢子油製劑中靈芝酸E的含量在0.001mg～0.050mg之間，即靈芝酸E的含量應在0.010％～0.50％之間。
2、靈芝孢子油製劑中總靈芝酸含量測定對照品溶液的製備精密稱取經五氧化二磷乾燥過夜的靈芝酸E對照品2.5～7.5mg，置於25ml量瓶中，加飽和NaHCO3溶液溶解，並稀釋至刻度，搖勻，每1ml中含靈芝酸E為0.1～0.3mg；標準曲線的製備精密量取對照品溶液0.5ml、2.5ml、5.0ml、7.5ml、10.0ml，分別置10ml量瓶中，加飽和NaHCO3溶液至刻度，搖勻；以相應的飽和NaHCO3溶液為空白，照紫外-分光光度法，在262nm波長處測定吸收度，以吸收度為縱坐標、濃度為橫坐標，繪製標準曲線；測定法取靈芝孢子油製劑1～5g，精密稱定，加石油醚10～50ml溶解，加入已處理好的矽膠柱(8g，18mm×400mm)上，加入100～150ml乙酸乙酯∶石油醚(60～90℃)＝10～25∶75～90的混合溶液洗脫，棄去洗脫液，矽膠柱繼續加入100～150ml乙酸乙酯∶甲醇＝80～95∶5～20的混合溶液洗脫，收集洗脫液，回收溶劑至幹，殘渣加氯仿20ml，超聲2min溶解，轉移置分液漏鬥中，用飽和NaHCO3萃取4次，每次20ml，合併萃取液，置100ml量瓶中，加飽和NaHCO3溶液稀釋至刻度，搖勻，作為供試品溶液。照分光光度法，在262nm波長處測定吸收度，從標準曲線上讀出供試品溶液中靈芝酸E的重量，計算，即得；檢測標準為每1.0g靈芝孢子油製劑中含總靈芝酸以靈芝酸E計，應不少於1.0mg。
上述的靈芝孢子油製劑為膠囊(包括靈芝孢子油軟膠囊、自乳化靈芝孢子油軟膠囊、靈芝孢子油充液膠囊)、乳劑、顆粒劑、針劑、滴丸、膜劑或氣霧劑等臨床可接受的劑型。
當靈芝孢子油製劑為靈芝孢子油軟膠囊、自乳化靈芝孢子油軟膠囊或靈芝孢子油充液膠囊時，總靈芝酸的含量測定方法還可採用如下方法對照品溶液的製備精密稱取經五氧化二磷乾燥過夜的靈芝酸E對照品5.0mg，置於25ml量瓶中，加飽和NaHCO3溶液溶解，並稀釋至刻度，搖勻，每1ml中含靈芝酸E為0.2mg；標準曲線的製備精密量取對照品溶液0.5ml、2.5ml、5.0ml、7.5ml、10.0ml，分別置10ml量瓶中，加飽和NaHCO3溶液至刻度，搖勻；以相應的飽和NaHCO3溶液為空白，照紫外-分光光度法，在262nm波長處測定吸收度，以吸收度為縱坐標、濃度為橫坐標，繪製標準曲線；測定法靈芝孢子油軟膠囊或自乳化靈芝孢子油軟膠囊或靈芝孢子油充液膠囊樣品20粒，剪開，傾出內容物，混勻，精密稱取3.0g，加石油醚50ml溶解，加入已處理好的矽膠柱(8g，18mm×400mm)上，加入120ml乙酸乙酯∶石油醚(60～90℃)＝25∶75的混合溶液洗脫，棄去洗脫液，矽膠柱繼續加入120ml乙酸乙酯∶甲醇＝85∶15的混合溶液洗脫，收集洗脫液，回收溶劑至幹，加氯仿20ml，超聲2min溶解，轉移置分液漏鬥中，用飽和NaHCO3萃取4次，每次20ml，合併萃取液，置100ml量瓶中，加飽和NaHCO3溶液稀釋至刻度，搖勻，作為供試品溶液。照分光光度法，在262nm波長處測定吸收度，從標準曲線上讀出供試品溶液中靈芝酸E的重量，計算，即得；檢測標準為每1.0g靈芝孢子油製劑中含總靈芝酸以靈芝酸E計，應不少於1.0mg。
與現有技術相比，本發明具有如下有益效果靈芝孢子油中三萜類化學成分為靈芝孢子油中活性很高的成分，而三萜酸類成分為靈芝孢子油中三萜類成分的主成分，且含量與靈芝孢子油含量在一定條件下成線性關係。故在用比色法測定總靈芝酸含量的基礎上，將靈芝孢子油中靈芝酸類成分之一靈芝酸E的含量進行測定，以此來檢測靈芝孢子油製劑中靈芝孢子油的含量，從而使靈芝孢子油製劑中靈芝孢子油含量質量標準得以完善、提高，切實做到靈芝孢子油製劑質量的穩定、可控。
本發明對靈芝孢子油製劑中的總靈芝酸進行先分離，以總靈芝酸中的靈芝酸E為標準，用紫外分光光度法進行的含量測定，此法成熟、準確可靠。為了進一步地控制靈芝孢子油製劑的質量，本發明對靈芝孢子油製劑中靈芝酸E的含量首次用高效液相色譜法進行了測定，此法準確、穩定、重現性好、回收率高，測定無幹擾。
圖1為靈芝酸E對照品紫外吸收光譜圖；圖2為靈芝孢子油供試品紫外吸收光譜圖。
具體實施例方式
實施例1 靈芝孢子油中靈芝酸E含量的測定(1)儀器與試藥高效液相色譜儀，包括Waters1525泵，2487雙通道紫外檢測器，Waters柱溫箱，Breeze液相色譜工作站，Brasson超聲清洗儀。靈芝酸E對照品(靈芝孢子中提取分離獲得，經mp、IR、UV、MS、1H-NMR等鑑定為靈芝酸E，HPLC歸一化法測定測得純度為99.6％)，乙腈為美國Tedia色譜純，水為超純水，其它試劑均為分析純。待測藥物樣品為靈芝孢子油軟膠囊(批號051114、051217、060123)。
(2)色譜條件色譜柱Kromasil C18，4.6mm×250mm，5μm；柱溫30℃；流動相乙腈-0.1％甲酸溶液(31∶69)；檢測波長252nm；流速1.0ml/min。
(3)檢測波長的選擇取靈芝酸E對照品溶液，在200～400nm範圍內掃描，結果在252nm處有最大吸收，故選擇252nm作為檢測波長。
(4)對照品溶液的製備精密稱取經五氧化二磷乾燥過夜的靈芝酸E對照品2.675mg，置25ml的量瓶中，加甲醇溶解並稀釋至刻度，搖勻，即得對照品溶液。其濃度為每1ml含0.107mg。
(5)供試品溶液的製備取靈芝孢子油軟膠囊30粒，剪開，傾出內容物，混勻，精密稱取10.0g，加石油醚100ml溶解，加入已處理好的矽膠柱(10g，18mm×400mm)上，加入150ml乙酸乙酯∶石油醚(60～90℃)＝70∶30的混合溶液洗脫，棄去洗脫液，矽膠柱繼續加入150ml乙酸乙酯∶甲醇＝85∶15的混合溶液洗脫，收集洗脫液，回收溶劑至幹，殘渣加甲醇溶解，轉移至2ml量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，即得供試品溶液；(6)供試品溶液製備中洗脫溶劑的選擇分別以石油醚→石油醚∶乙酸乙酯(90∶10)→石油醚∶乙酸乙酯(80∶20)→石油醚∶乙酸乙酯(70∶30)→石油醚∶乙酸乙酯(60∶40)→石油醚∶乙酸乙酯(50∶50)→石油醚∶乙酸乙酯(40∶60)→石油醚∶乙酸乙酯(35∶65)→石油醚∶乙酸乙酯(25∶75)→石油醚∶乙酸乙酯(10∶90)→乙酸乙酯→乙酸乙酯∶甲醇(90∶10)→乙酸乙酯∶甲醇(80∶20)的順序進行洗脫，收集每→段的洗脫液，濃縮後進行含量測定分析，結果發現，在石油醚∶乙酸乙酯(25∶75)以前的洗脫段和乙酸乙酯∶甲醇(8∶2)的洗脫段中均未發現靈芝酸E，顯示靈芝酸E的最佳洗脫順序為以石油醚∶乙酸乙酯(25∶75)以前的洗脫段洗脫雜質，以乙酸乙酯∶甲醇(90∶10)以後的洗脫段洗脫靈芝酸E。
(7)供試品溶液製備中洗脫溶劑用量的選擇分別以石油醚∶乙酸乙酯(40∶60)150ml→乙酸乙酯(30∶70)150ml→乙酸乙酯∶甲醇(85∶15)150ml→乙酸乙酯∶甲醇(80∶20)150ml依次洗脫，收集各部分洗脫液，分別蒸乾，並加甲醇定容到2ml。然後分別進樣10μl進行含量測定，結果在乙酸乙酯(40∶60)洗脫部分含大量脂肪油，在石油醚∶乙酸乙酯(30∶70)和乙酸乙酯∶甲醇(80∶20)部分均未發現靈芝酸E的色譜峰，在乙酸乙酯∶甲醇(85∶15)部分發現靈芝酸E的色譜峰，說明洗脫溶劑的用量為150ml既可以有效的除去雜質，又能將靈芝酸E充分的洗脫下來。
(8)高效液相色譜流動相考察靈芝酸E在Kromasil C18柱，不同流動相中的各參數，結果以乙腈-1％甲酸或乙酸水溶液(31∶69)、甲醇-1％甲酸或乙酸水溶液(48∶52)條件下靈芝酸E的峰形良好，分離度大於1.5，均可作為流動相。
(9)線性關係考察分別精密量取靈芝酸E對照品溶液(0.107mg/ml)5μl、10μl、15μl、20μl、25μl的溶液，分別注入液相色譜儀，以進樣量(μg)為橫坐標，以峰面積為縱坐標，繪製標準曲線。結果見表1。
表1、線性關係實驗數據(n＝5)
Y＝631929.1X-23648.2，R＝0.9999。
以上結果表明靈芝酸E在0.535μg～2.675μg範圍內，呈良好的線性關係。
(10)精密度試驗精密吸取靈芝酸E對照品溶液(0.107mg/ml)10μl，重複進樣5次，靈芝酸E峰面積值的RSD＜2％，結果見表2。
表2 精密度試驗數據(n＝5)
試驗證明，精密度良好。
(10)穩定性試驗取樣品供試液(批號051114)分別於0小時，2小時，4小時，8小時，16小時，24小時，分別進樣10μl，測得樣品中靈芝酸E峰面積的RSD＜2％，結果見表3。
表3 穩定性試驗數據
試驗結果表明，樣品供試液在24小時內穩定性良好。
(11)重現性試驗照含量測定項下操作，對同一批樣品(批號051114)5份進行測定，求得相對標準偏差RSD為1.077％。
表4 重現性試驗數據
表4試驗結果表明，靈芝酸E測定重現性良好。
(12)回收率試驗用加樣回收，精密稱取已知含量的樣品(批號051114，0.01416mg/g)的樣品10.0g，分別精密加入靈芝酸E對照品溶液(0.04276mg/ml)5ml，照含量測定項下操作，按下式計算回收率，結果見表5。
表5 靈芝酸E回收率試驗結果
試驗結果表明加樣回收率良好。
照上述含量測定的方法操作，測定了6批靈芝孢子油製劑中靈芝酸E的含量，結果見表6。
表6 樣品中靈芝酸E的含量測定結果(n＝2)
測得每1g靈芝孢子油中靈芝酸E的含量在0.00252～0.04618mg之間。
測得每1.0g靈芝孢子油製劑(相當於生藥5g)靈芝酸E含量在0.00252～0.04618mg之間，考慮到工業放大中的損耗誤差，在此基礎上，行上下浮動，因此得到的檢測標準為每1.0g靈芝孢子油製劑(相當於生藥5g)靈芝酸E含量在0.001～0.050mg之間(即靈芝酸E含量在0.01％～0.50％之間)。
實施例2靈芝孢子油中總靈芝酸含量的測定(1)儀器與試藥UV Agilent8453紫外-可見分光光度計(美國安捷倫科技有限公司)。待測藥物樣品為靈芝孢子油軟膠囊(批號051114、051217、060123)，靈芝酸E對照品(自製，純度為99.6％)；所用試劑均為分析純。
(2)對照品溶液的配製精密稱取靈芝酸E對照品5.36mg，置25ml量瓶中，加飽和NaHCO3溶液溶解，並稀釋至刻度，作為對照品溶液。
(3)供試品溶液製備取供試品內容物3g，精密稱定，加石油醚50ml溶解，加入已處理好的矽膠柱(8g，18mm×400mm)上，加入150ml乙酸乙酯∶石油醚(60～90℃)＝25∶75的混合溶液洗脫，棄去洗脫液，矽膠柱繼續加入150ml乙酸乙酯∶甲醇＝90∶10的混合溶液洗脫，收集洗脫液，回收溶劑至幹，殘渣加氯仿20ml，超聲2min溶解，轉移置分液漏鬥中，用飽和NaHCO3萃取4次，每次20ml，合併萃取液，置100ml量瓶中，加飽和NaHCO3溶液稀釋至刻度，作為靈芝孢子油供試品溶液。
(4)方法可行性考察分別取上述靈芝酸E對照品溶液、供試品溶液，以飽和NaHCO3溶液稀釋一倍，在200～400nm波長範圍內進行紫外掃描，記錄紫外掃描圖，見圖1，結果靈芝酸E對照品、靈芝孢子油的紫外光譜圖基本一致，且均在262nm波長處有最大吸收。故確定以飽和NaHCO3溶液為溶劑，測定波長確定為262nm。
(5)標準曲線製備分別精密吸取靈芝酸E對照品溶液(0.2144mg·ml-1)0.5、2.5、5.0、7.5、10.0ml，置10ml量瓶中，加飽和NaHCO3溶液稀釋至刻度，在262nm波長處測定吸收值，以濃度為橫坐標，吸收度為縱坐標，計算標準曲線，結果靈芝酸E在0.01072～0.2144 mg·ml-1範圍內呈良好的線性關係；回歸方程為Y＝9.671X+0.0866，r＝0.9995。
(6)穩定性試驗取供試品(批號051114)內容物，照(3)項下方法製備靈芝孢子油供試品溶液，分別在0、0.5、1、2、4、8、12、24 h，於262nm波長處測定吸收值，結果表明，24h內吸收值無明顯變化，RSD為1.57％。
(7)重複性試驗取供試品(批號051114)內容物5份，分別照(3)項下方法製備供試品溶液，在262nm波長處測定吸收值，計算各瓶樣品中總靈芝酸的含量(以靈芝酸E計)。結果R S D為1.84％(n＝5)。
(8)回收率測定精密稱取供試品(批號051114)內容物2.0g，共5份，分別精密加入靈芝酸E對照品氯仿溶液(0.502mg·ml-1)3.0ml，照(3)項下方法製備供試品溶液，在262nm波長處測定吸收值，計算，結果平均回收率為99.42％，RSD為0.57％，結果見表7。
表7回收率試驗結果
試驗結果表明加樣回收率良好。
照上述靈芝孢子油製劑中總靈芝酸的含量測定的方法操作，測定了6批靈芝孢子油製劑中總靈芝酸的含量，結果見表8。
表8 樣品中總靈芝酸的含量測定結果(n＝2)
權利要求
1.一種靈芝孢子油製劑中靈芝孢子油含量的檢測方法，其特徵是通過測定靈芝孢子油製劑中靈芝酸E的含量，包括如下步驟(1)對照品溶液的製備取經乾燥的靈芝酸E對照品，加甲醇製成每1ml含0.001～0.100mg的溶液，即得對照品溶液；(2)供試品溶液的製備取靈芝孢子油製劑，加石油醚溶解，加入矽膠柱上，加入60～90℃的乙酸乙酯∶石油醚＝65～75∶35～25的混合溶液洗脫，棄去洗脫液，矽膠柱繼續加入乙酸乙酯∶甲醇＝80～90∶20～10的混合溶液洗脫，收集洗脫液，回收溶劑至幹，殘渣加甲醇溶解，搖勻，即得供試品溶液；(3)用高效液相色譜法測定用十八烷基矽烷鍵合矽膠為填充劑；乙腈-0.1％甲酸或乙酸溶液28～45∶72～55為流動相；檢測波長為252nm；分別吸取對照品溶液與供試品溶液，注入高效液相色譜儀，測定，計算靈芝酸E的含量；每克靈芝孢子油製劑中靈芝酸E的含量應在0.001～0.050毫克之間。
2.根據權利要求1所述的檢測方法，其特徵在於步驟(2)所述供試品溶液的製備為取靈芝孢子油製劑5.0～15.0g，加石油醚50～150ml溶解，加入矽膠柱上，加入100～200ml、60～90℃的乙酸乙酯∶石油醚＝65～75∶35～25的混合溶液洗脫，棄去洗脫液，矽膠柱繼續加入100～200ml乙酸乙酯∶甲醇＝80～90∶20～10的混合溶液洗脫，收集洗脫液，回收溶劑至於，殘渣加甲醇溶解，轉移至2ml量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，即得供試品溶液；
3.根據權利要求1所述的檢測方法，其特徵在於包括如下步驟(1)對照品溶液的製備取經乾燥的靈芝酸E對照品，加甲醇製成每1ml含0.010mg的溶液，即得對照品溶液；(2)供試品溶液的製備取靈芝孢子油軟膠囊或自乳化靈芝孢子油軟膠囊或靈芝孢子油充液膠囊樣品，剪開，傾出內容物，混勻，取樣品，加石油醚溶解，加入矽膠柱上，加入60～90℃的乙酸乙酯∶石油醚＝70∶30的混合溶液洗脫，棄去洗脫液，矽膠柱繼續加入乙酸乙酯∶甲醇＝85∶15的混合溶液洗脫，收集洗脫液，回收溶劑至幹，殘渣加甲醇溶解，搖勻，即得供試品溶液；(3)用高效液相色譜法測定用十八烷基矽烷鍵合矽膠為填充劑；乙腈-0.1％甲酸溶液31∶69為流動相；檢測波長為252nm；分別吸取對照品溶液與供試品溶液，注入高效液相色譜儀，測定，計算靈芝酸E的含量。
4.根據權利要求1所述的檢測方法，其特徵是通過測定靈芝孢子油製劑中總靈芝酸含量，包括如下步驟(1)對照品溶液的製備取經乾燥的靈芝酸E對照品，加飽和NaHCO3溶液溶解，搖勻，每1ml中含靈芝酸E為0.1～0.3mg；(2)標準曲線的製備量取對照品溶液0.5ml、2.5ml、5.0ml、7.5ml、10.0ml，分別置10ml量瓶中，加飽和NaHCO3溶液至刻度，搖勻；以相應的飽和NaHCO3溶液為空白，照紫外-分光光度法，在262nm波長處測定吸收度，以吸收度為縱坐標、濃度為橫坐標，繪製標準曲線；(3)供試品溶液的製備取靈芝孢子油製劑，加石油醚溶解，加入矽膠柱上，加入60～90℃的乙酸乙酯∶石油醚＝10～25∶75～90的混合溶液洗脫，棄去洗脫液，矽膠柱繼續加入乙酸乙酯∶甲醇＝80～95.5～20的混合溶液洗脫，收集洗脫液，回收溶劑至幹，殘渣加氯仿，超聲溶解，轉移置分液漏鬥中，用飽和NaHCO3萃取，合併萃取液，加飽和NaHCO3溶液稀釋，搖勻，作為供試品溶液；(4)照分光光度法，在262nm波長處測定吸收度，從標準曲線上讀出供試品溶液中靈芝酸E的重量，計算得到以靈芝酸E計的總靈芝酸含量；每克靈芝孢子油製劑中含總靈芝酸以靈芝酸E計，應少於1毫克。
5.根據權利要求4所述的檢測方法，其特徵在於步驟(3)所述供試品溶液的製備為取靈芝孢子油製劑1～5g，加石油醚10～50ml溶解，加入矽膠柱上，加入100～150ml、60～90℃的乙酸乙酯∶石油醚＝10～25∶75～90的混合溶液洗脫，棄去洗脫液，矽膠柱繼續加入100～150ml乙酸乙酯∶甲醇＝80～95∶5～20的混合溶液洗脫，收集洗脫液，回收溶劑至幹，殘渣加氯仿20ml，超聲2min溶解，轉移置分液漏鬥中，用飽和NaHCO3萃取4次，每次20ml，合併萃取液，至100ml量瓶中，加飽和NaHCO3溶液稀釋至刻度，搖勻，作為供試品溶液。
6.根據權利要求4所述的檢測方法，其特徵在於包括如下步驟(1)對照品溶液的製備取經乾燥的靈芝酸E對照品，加飽和NaHCO3溶液溶解，搖勻，每1ml中含靈芝酸E為0.2mg；(2)標準曲線的製備量取對照品溶液0.5ml、2.5ml、5.0ml、7.5ml、10.0ml，分別置10ml量瓶中，加飽和NaHCO3溶液至刻度，搖勻；以相應的飽和NaHCO3溶液為空白，照紫外-分光光度法，在262nm波長處測定吸收度，以吸收度為縱坐標、濃度為橫坐標，繪製標準曲線；(3)供試品溶液的製備取靈芝孢子油軟膠囊或自乳化靈芝孢子油軟膠囊或靈芝孢子油充液膠囊樣品，剪開，傾出內容物，混勻，取樣品加石油醚溶解，加入矽膠柱上，加入60～90℃乙酸乙酯∶石油醚＝25∶75的混合溶液洗脫，棄去洗脫液，矽膠柱繼續加入乙酸乙酯∶甲醇＝85∶15的混合溶液洗脫，收集洗脫液，回收溶劑至幹，加氯仿，超聲溶解，轉移置分液漏鬥中，用飽和NaHCO3萃取，合併萃取液，加飽和NaHCO3溶液稀釋，搖勻，作為供試品溶液；(4)照分光光度法，在262nm波長處測定吸收度，從標準曲線上讀出供試品溶液中靈芝酸E的重量，計算得到以靈芝酸E計的總靈芝酸含量。
7.根據權利要求1或4所述的檢測方法，其特徵是採用五氧化二磷乾燥靈芝酸E對照品。
8.根據權利要求1～6任一項所述的檢測方法，其特徵在於所述靈芝孢子油製劑為膠囊、乳劑、顆粒劑、針劑、滴丸、膜劑或氣霧劑。
9.根據權利要求3或6所述的檢測方法，其特徵在於所述靈芝孢子油製劑為膠囊製劑，該膠囊製劑為靈芝孢子油軟膠囊、自乳化靈芝孢子油軟膠囊或靈芝孢子油充液膠囊。
全文摘要
本發明公開了一種靈芝孢子油製劑中靈芝孢子油含量的檢測方法。本發明的測定方法是通過靈芝孢子油製劑中總靈芝酸、靈芝酸E含量測定實現；其中其檢測標準為每1.0g靈芝孢子油製劑(相當於生藥靈芝孢子5g)中含總靈芝酸以靈芝酸E(C
文檔編號G01N30/86GK1987448SQ20061012258
公開日2007年6月27日 申請日期2006年9月30日 優先權日2006年9月30日
發明者吳敏, 李穎, 黃光華 申請人:吳敏, 李穎, 黃光華