一種基於一維碳納米材料的親和性分離透射電鏡支持膜的製作方法

2023-07-01 08:21:56 2

專利名稱：一種基於一維碳納米材料的親和性分離透射電鏡支持膜的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種應用於蛋白質分離領域的具有親和性分離功能的透射電鏡支持膜
背景技術：
人類基因組測序的完成並不足以使人們解釋及推測細胞的各種生命現象，細胞的活性及功能是蛋白質之間的相互作用完成的。蛋白質之間通過相互作用形成蛋白質複合 物，從而決定生物體的複雜功能。從分子水平揭示蛋白質複合物的三維結構是蛋白質相互作用研究中的核心方向，這對於理解生物調控機制等生命活動規律至關重要，為探討重大疾病的機制、疾病治療、疾病預防和新藥開發提供了重要的理論基礎。[I]然而，當今蛋白質複合物結構的研究在很大程度上取決於其技術方法水平的高低。人體內的蛋白質有10萬種以上，而蛋白質之間通過相互作用而形成的複合物則有上千萬種之多。目前，世界上對於蛋白質複合物的結構研究工作剛剛起步，絕大多數蛋白質複合物的結構並沒有獲得解析。其主要原因為大多數蛋白質複合物不穩定，在分離過程中容易分解。當前的主要的蛋白質純化方法為色譜法和親和性分離，其中色譜法使用柱層析進行分離，耗時長[3];而使用親和性分離法，如鏈酶親和素-生物素，NTA-6His相互作用，需要較為強烈的洗脫條件，大多數蛋白質之間的相互作用為瞬時作用，其作用力較為薄弱因而蛋白質複合物不穩定，隨時間和環境的變化而發生解離，導致獲得高純度的目標蛋白質複合物成為一個難題，這已經成為阻礙該領域發展的一個瓶頸。如何克服該瓶頸，開發出快速純化蛋白質的方法以用於結構表徵，是目前該領域方法學研究中的一個新問題。透射電鏡單粒子分析是解決蛋白質複合物三維結構的一種有效手段，該方法是將蛋白質在各個角度的二維圖像通過三維重建的方法還原為三維結構。這種方法過程簡單，不需要像X射線衍射分析法(XRD)那樣需要結晶過程；該方法也不像NMR—樣，需要大量的蛋白質樣品(毫克級)。因此該方法是一種可以解決蛋白質複合物三維結構的有效方法。2010年，劉遵峰等提出使用鏈酶未和素修飾石墨稀，可用作生物素標記的蛋白質的快速分離，不需要經過淋洗等步驟，便可將其應用於透射電鏡單粒子分析。[4]然而，該方法存在很大的缺陷，就是石墨烯具有很強的吸附能力，用作蛋白質分離時，石墨烯表面對雜質蛋白的非專一性吸附能力很強，因此純化的純度不能夠保證。對石墨烯表面使用聚乙二醇等高分子進行處理，用以減少非專一性吸附，又會增加石墨烯的尺寸，影響電子透射率，從而影響蛋白質結構分析的精度。這成為該方法進一步應用的瓶頸。目前，急需一種既能達到快速蛋白質分離、可應用於結構分析、並能解決雜質非專一性吸附的方案。參考文獻I. Phizicky, E. M. ;Fields，S. Protein-Protein Interactions-Methods forDetection and Analysis. Microbiological Reviews 1995，59 (I)，94-123.2. Mastrobattista, E. ；van der Aa，M.A.E.M. ；Hennink, W. E. ；Crommelin,D.J.A. Artificial viruses a nanotechnological approach to gene delivery. NatureReviews Drug Discovery 2006,5 (2),115-121.3. Graslund, S. ；Nordlund, P. ；Weigelt, J. Bray, J. ；Hallberg, B. M. ;Gileadi，
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發明內容
本發明是使用親和性識別分子修飾碳納米管，並將其連接到透射電鏡支持膜上，從而獲得具有親和性分離功能的透射電鏡支持膜。由於碳納米管是一維的管狀結構，因此將碳納米管連接到透射電鏡支持膜之後，將形成鏤空結構，雜質蛋白質將從鏤空結構的孔中漏下去，而目標蛋白質將附著於碳納米管上，從而可以解決雜質蛋白質的非專一性吸附問題。基於一維碳納米材料的親和性分離透射電鏡支持膜是一種功能化的透射電鏡支持膜，由3部分組成，包括鏤空透射電鏡支持膜，一維碳納米材料，和親和性分離基團，其特徵是親和性分離基團連接到一維碳納米材料上，一維碳納米材料連接到透射電鏡支持膜上。所述的一維碳納米材料為碳納米管、碳納米線、碳納米帶,優選的，該一維碳納米材料為單壁碳納米管；該一維碳納米材料的長徑比為10-10000之間；所述的親和性分離基團為可專一性識別特定分子或功能基團的分子或功能基團；所述的親和性分離基團為鏈酶親和素及其衍生物與生物素，6X組氨酸及其衍生物與鎳NTA標記、甲殼素與甲殼素結合蛋 白、麥芽糖與麥芽糖結合蛋白，穀胱甘肽S-轉移酶與穀胱甘肽，抗原與抗體等一種或幾種親和性識別功能對之一；所述的一維碳納米材料使用表面活性劑處理；所述的表面活性劑為單臂或多臂聚乙二醇等。下面給出本發明所述的基於一維碳納米材料的親和性分離透射電鏡支持膜的設計原理。本發明針對當前蛋白質複合物的純化與結構分析，提出了如下解決方案。通過對碳納米管進行化學方法修飾，使具有親和性分離的基團連接到碳納米管上，從而使碳納米管具有了親和性分離的功能，可以用來從細胞裂解液中俘獲目標蛋白。由於單臂碳納米管直徑較小，因此電子透射率好，當目標蛋白質位於單臂碳納米管兩側時，更不會受到該碳納米管的影響。將單臂碳納米管連接到鏤空的透射電鏡分離膜上，使該透射電鏡支持膜具有親和性分離功能。進行蛋白質分離前，可將目標蛋白質進行修飾，使其可識別電鏡膜上的親和基團，從而可使用該透射電鏡分離膜將目標蛋白質進行分離。雜質蛋白質可以從碳納米管之間的空間漏下去，因此不會對目標蛋白質的成像造成影響。碳納米管使用單臂或多臂聚乙二醇進行處理，可以減小碳納米管本身對雜質蛋白質的非專一性吸附，從而獲得高純度。本發明與現有技術相比具有的有益效果(I)蛋白質複合物的純化、濃縮、以及結構分析可以集中在碳納米管上，整個分離、純化過程可以在幾秒至幾分鐘內完成。(2)對於結構分析所需的蛋白質的量可大大很少，對於整個結構分析過程，只需少量細胞即可。 (3)碳納米管的高導電性可以有效減小透射電鏡分析過程中的靜電效應，從而避免樣品在成像過程中的飄移。(4)沿著碳納米管，可以有效且方便的找到目標蛋白質複合物，從而使取樣簡單化。(5)目標蛋白質粒子被碳納米管俘獲後，其去向可以被有效限制，從而大大減少結構分析過程中所需的計算機處理過程。(6)雜質蛋白質可以從碳納米管周圍的空隙中漏下去，從而有效避免雜質蛋白質的非專一性吸附，減少目標蛋白質在成像過程中受到的幹擾。


圖I.基於一維碳納米材料的親和性分離透射電鏡支持膜示意圖。I.透射電鏡支持膜；2. —維碳納米材料；3.親和性功能基團圖2.基於一維碳納米材料的親和性分離透射電鏡支持膜的透射電鏡圖。標尺長度2. 5微米
具體實施例方式實施例一將IOmg單臂碳納米管(SWNT)於硝酸中(2· 8M)中120°C加熱攪拌2h，過濾，洗滌烘乾，獲得SWNT-C00H。取2. 5mg SffNT-COOH分散於Iml DMF中，加入Img氨基封端的生物素(Biotin-PEG8-NH2)，2mg(3H-l，2，3-三唑並[4，5_b]吡啶 _3_ 氧基)三-I-吡咯烷基鱗六氟磷酸鹽(PyAOP)，2mg N, N-二異丙基乙胺(DIEA)，室溫攪拌lh，過濾、洗滌，得到SWNT-biotin,將其分散於IOml H2O中。將5ml SWNT-biotin與5mg鏈酶親和素混合，過濾，得到鏈酶親和素修飾的單臂碳納米管(SWNT-strep)，將其溶解於2ml含O. 5%的4臂聚乙二醇2000的磷酸緩衝液(PBS，pH 7. 5)中。取10 μ I SWNT-strep滴加在鏤空透射電鏡支持膜上，獲得可用於親和性分離的透射電鏡支持膜。
使用Iml含有O. 1% triton的tris-HCl緩衝液將培養於IOcm培養皿中的表達有生物素標記的綠色螢光蛋白的H293T細胞裂解。使用上述功能化的透射電鏡支持膜在裂解液中撈取，之後使用細胞裂解液衝洗。使用螢光顯微鏡觀測到俘獲在透射電鏡膜上的綠色螢光蛋白，說明蛋白質俘獲能力很好。實施例二 將IOmg單臂碳納米管(SWNT)於硝酸中(2· 8M)中120°C加熱攪拌2h，過濾，洗滌烘乾，獲得 SffNT-COOH0 取 2. 5mg SffNT-COOH 分散於 5ml H20 中，2mg 碳二亞胺(EDC)，2mgN-羥基琥珀醯亞胺(NHS)，室溫攪拌lh，過濾、洗滌，得到SWNT-NHS，將其分散於5ml H2O中。加入N，N，- 二(羧甲基)-L-賴氨酸混合，過濾，得到NTA修飾的單臂碳納米管(SWNT-NTA)，將其溶解於2ml含O. 5%的4臂聚乙二醇2000的PBS緩衝液中。取10 μ I SffNT-NTA滴加在鏤空透射電鏡支持膜上，滴加1%的NiCl2，獲得可用於親和性分離的透射電鏡支持膜。
使用Iml含有O. 1% triton的tris-HCl緩衝液將培養於IOcm培養皿中的表達有6His標記的綠色螢光蛋白的H293T細胞裂解。使用上述功能化的透射電鏡支持膜在裂解液中撈取，之後使用上述緩衝液衝洗。使用螢光顯微鏡觀測到俘獲在透射電鏡膜上的綠色螢光蛋白，說明蛋白質俘獲能力很好。實施例三將IOmg單臂碳納米管(SWNT)於硝酸中(2· 8M)中120°C加熱攪拌2h，過濾，洗滌烘乾，獲得 SWNT-C00H。取 2. 5mg SWNT-C00H 分散於 5ml H20 中，2mg EDC, 2mg NHS，室溫攪拌lh，過濾、洗滌，得到SWNT-NHS，將其分散於5ml H2O中。加入N，N，- 二(羧甲基)-L-賴氨酸混合，過濾，得到NTA修飾的單臂碳納米管(SWNT-NTA)，將其溶解於2ml含O. 5%的單臂聚乙二醇2000的PBS緩衝液中。取10 μ ISffNT-NTA滴加在鏤空透射電鏡支持膜上，滴加1%的NiCl2，獲得可用於親和性分離的透射電鏡支持膜。使用Iml含有O. I % triton的tris-HCl緩衝液(細胞裂解液)將將培養於IOcm培養皿中的同時表達有6His標記的綠色螢光蛋白，和無標記的紅色螢光蛋白的H293T細胞裂解。使用上述功能化的透射電鏡支持膜在裂解液中撈取，之後使用上述細胞裂解液衝洗。使用螢光顯微鏡觀測到俘獲在透射電鏡膜上的綠色螢光蛋白，未觀測到紅色螢光蛋白，說明蛋白質純化效果很好。實施例四將IOmg單臂碳納米管(SWNT)於硝酸中(2· 8M)中120°C加熱攪拌2h，過濾，洗滌烘乾，獲得 SffNT-COOH0 取 2. 5mg SffNT-COOH 分散於 5ml H2O 中，加入 2mg EDC，2mg NHS，室溫攪拌lh，過濾、洗滌，得到SWNT-NHS，將其分散於5ml H2O中。加入穀胱甘肽S-轉移酶，反應lh，過濾，得到穀胱甘肽S-轉移酶修飾的單臂碳納米管(SWNT-GST)，將其溶解於2ml含
O.5 %的4臂聚乙二醇2000的PBS緩衝液中。取10 μ I SffNT-GST滴加在鏤空透射電鏡支持膜上，獲得可用於親和性分離的透射電鏡支持膜。使用Iml O. I % triton的tris-HCl緩衝液(細胞裂解液)將將培養於IOcm培養皿中的同時表達有GST標記的綠色螢光蛋白，和無標記的紅色螢光蛋白的H293T細胞裂解。使用上述功能化的透射電鏡支持膜在裂解液中撈取，之後使用上述細胞裂解液衝洗。使用螢光顯微鏡觀測到俘獲在透射電鏡膜上的綠色螢光蛋白，未觀測到紅色螢光蛋白，說明蛋白質純化效果很好。
權利要求
1.一種基於一維碳納米材料的親和性分離透射電鏡支持膜，它是ー種功能化的透射電鏡支持膜，由3部分組成，包括鏤空透射電鏡支持膜，一維碳納米材料，和親和性分離基團，其特徵是親和性分離基團連接到一維碳納米材料上，一維碳納米材料連接到透射電鏡支持膜上。
2.根據權利要求I所述的基於ー維碳納米材料的親和性分離透射電鏡支持膜，其特徵在於所述的一維碳納米材料為碳納米管、碳納米線、碳納米帶。
3.優選的，根據權利要求I所述的基於ー維碳納米材料的親和性分離透射電鏡支持膜，其特徵在於所述的一維碳納米材料為單壁碳納米管。
4.根據權利要求I所述的基於ー維碳納米材料的親和性分離透射電鏡支持膜，其特徵在於所述的一維碳納米材料的長徑比為10-10000之間。
5.根據權利要求I所述的基於ー維碳納米材料的親和性分離透射電鏡支持膜，其特徵在於所述的親和性分離基團為可專一性識別特定分子或功能基團的分子或功能基團。
6.根據權利要求I所述的基於ー維碳納米材料的親和性分離透射電鏡支持膜，其特徵在於所述的親和性分離基團為鏈酶親和素及其衍生物與生物素，6倍組氨酸(6XHis)及其衍生物與鎳NTA標記、甲殼素與甲殼素結合蛋白、麥芽糖與麥芽糖結合蛋白，穀胱甘肽S-轉移酶與穀胱甘肽，抗原與抗體等一種或幾種親和性識別功能對之一。
7.根據權利要求I所述的基於ー維碳納米材料的親和性分離透射電鏡支持膜，其特徵在於所述的一維碳納米材料使用表面活性劑處理。
8.根據權利要求I所述的基於ー維碳納米材料的親和性分離透射電鏡支持膜，其特徵在於所述的一維碳納米材料使用表面活性劑處理，所述的表面活性劑為單臂或多臂聚こニ醇等。
全文摘要
本發明屬於生物醫藥技術領域，基於一維碳納米材料設計一種具有蛋白質分離功能的親和性分離透射電鏡支持膜。該親和性分離透射電鏡支持膜由3部分組成，包括鏤空透射電鏡支持膜，一維碳納米材料，和親和性分離基團，其中親和性分離基團連接到一維碳納米材料上，一維碳納米材料連接到透射電鏡支持膜上。本發明通過使用親和性識別分子修飾一維碳納米材料，並將其連接到鏤空的透射電鏡支持膜上，從而形成孔隙結構。雜質蛋白質可從一維碳納米材料的的縫隙中漏下去，而目標蛋白質將被俘獲於一維碳納米材料上，該過程可以迅速完成。從而可以解決雜質蛋白質複合物純化以及結構分析過程中的易分解、純度低等問題。本發明的用途是蛋白質分離，可用於蛋白質複合物的分離、純化、三維結構分析。
文檔編號G01N1/28GK102661882SQ20121011132
公開日2012年9月12日 申請日期2012年4月17日 優先權日2012年4月17日
發明者劉倩, 劉遵峰, 王楠 申請人:劉倩, 劉遵峰, 王楠