用於恢復面部或身體所選區域中年齡相關組織損失的方法和組合物的製作方法

2023-07-01 08:21:01

專利名稱：用於恢復面部或身體所選區域中年齡相關組織損失的方法和組合物的製作方法
用於恢復面部或身體所選區域中年齡相關組織損失的方法和組合物 發明領域
本發明涉及恢復面部或身體所選區域中年齡相關組織損失的方法。更具體而言，這種方法注射自體幹細胞，所述自體幹細胞恢復面部或身體所選區域中的年齡相關組織損失。相關申請
本申請要求2009年5月4日提交的第61/175，275號美國臨時申請的優先權權益，其在此通過引用全部而併入。
背景技術：
皮膚由表皮和真皮組成。皮下組織位於這些層下面，其通常未被歸類為皮膚的層。皮下組織也通常被稱為皮下脂肪層或者皮下組織。最外的表皮由帶有下面基底膜的復層扁平上皮組成。其不包括血管，並且通過擴散從真皮獲得營養。構成表皮的主要細胞類型是角質形成細胞。也存在黑素細胞和朗格漢斯細胞。該層皮膚負責將水保持在身體中並且阻止有害的化學品和病原體進入。真皮位於表皮下，並且包括許多結構，包括血管、神經、毛囊、平滑肌、腺體和淋巴組織。真皮(或者真皮層)通常是3-5毫米厚，並且是人體皮膚的主要組分。其由結締組織的網絡、主要是提供支持的膠原纖維和提供彈性的彈性組織組成。主要細胞類型是成纖維細胞、脂肪細胞和巨噬細胞。皮下組織位於真皮下面。它的目的是將皮膚附著在下面的骨骼和肌肉上以及向其供應血管和神經。其由疏鬆結締組織和彈性蛋白組成。主要細胞類型是成纖維細胞、巨噬細胞和脂肪細胞。皮下組織包括50%的身體脂肪。脂肪對身體起襯墊和隔離作用。面部老化由於幾個因素而發生皮膚內的固有變化，重力的影響，作用於皮膚的面部肌肉(動態紋)，軟組織損失或移位以及骨損失和組織彈性的損失。當表皮開始變薄、引起與真皮的連接破壞(flatten)時,皮膚老化。膠原蛋白隨著人變老而減少並且使皮膚飽滿的膠原蛋白束變得更鬆散和失去強度。當皮膚失去彈性時，其抵抗拉伸的能力下降。加上重力、肌肉牽拉和組織變化，皮膚開始起皺。水損失和細胞之間的連接破壞也降低皮膚的屏障作用，其可以弓I起皮膚的毛孔大小增加。當人變老時，面部失去容量、軟組織和脂肪。下頜垂肉和褶皺的出現通常由面部組織的下垂和下面肌肉附著於皮膚的區域的折皺引起。隨著軟組織的部分減少，面部變得更加凹陷。更具體地說，在各種面部區域，例如前額、眼部、鼻子、面中部和下面部中，與老化相關的變化已得到充分證明。在前額區，前額和眉隨著時間的過去下垂，這使眉毛降低，並且引起上眼瞼皮膚起皺。當一個人試圖保持眉和眼瞼向上來抵抗這些變化時，前額紋出現。眾所周知眼部經常是顯示老化跡象的第一面部特徵。與面部其它區域相比，眼部周圍的皮膚變化更早發生，這是因為眼部周圍的皮膚更薄。這裡的皮膚包括更少的腺體，並且經受不斷的眨眼、斜視、摩擦以及牽拉。當面頰開始下垂、引起鼻唇溝褶皺時，面中部老化。鼻唇溝褶皺是從鼻側延伸至嘴角的紋。已經用面部填充劑處理這些褶皺。在鼻子區域，隨著人老化，鼻子拉長。拉長的通常原因是軟組織的變薄和彈性的丟失，這引起"鼻尖的下垂"以及骨骼的暴露，產生新的隆起。在下面部區域，隨著面部老化，面部組織下降。這導致所謂的〃笑紋〃。已經用面部填充劑處理該區域中的褶皺和紋。在面部的更下方，嘴角可能下垂以及下頜的下降可產生經常被稱為"牽線木偶"紋的褶皺。而且，當面頰沿著面部肌肉附著於頜骨之處的下頜的固定點周圍凹陷時，下頜垂肉形成。面部肌肉繼續向下至頸中，作為稱為頸闊肌的片。這一肌肉通常在頸中心分開，產生兩個帶。各種注射劑已用於恢復面部中的組織損失。自20世紀80年代，注射膠原蛋白已被用作軟組織填充劑，以填充面部上的皺紋、紋(line)和疤痕。膠原蛋白是天然存在的蛋白質，其支持身體的各個部位，包括皮膚、肌腱和韌帶。脂肪注射已使用多年，以增加容量，填補皺紋、紋，以及增強嘴唇。脂肪注射涉及從患者身體的一部分(腹部、大腿或臀部)獲取脂肪並將其重新注射到面部皮膚下。肉毒桿菌毒素已被用於頸部痙攣、顱神經障礙和眼部痙攣。隨著近期FDA批准Botox在眉間區域中的美容應用，該藥物被用於撫平皺紋。當注射面部肌肉時肉毒桿菌毒素阻斷神經衝動，暫時麻痺肌肉並撫平皺紋。透明質酸是最常用的美容真皮填充劑之一，它增加容量，以最小化皺紋和紋。透明質酸是線性多糖，其天然存在於所有活生物中並且是身體組織細胞外空間的通用組分。所有物種和組織中透明質酸的相同結構使這一多糖成為在健康和藥物中用作生物材料的理想物質。透明質酸存在於人體中的許多部位。它為皮膚提供容量，為眼部提供形狀並且為關節提供彈性。最高濃度發現於結締組織中，並且大部分透明質酸(約56%)發現於皮膚中。各種形式的透明質酸由許多製造商商業化地提供。最常用的透明質酸是澄清凝膠形式的非動物穩定化透明質酸(NASHA)，由鏈球菌屬(streptococci)細菌的細菌發酵產生。與動物衍生透明質酸不同，非動物衍生透明質酸不含動物蛋白。這限制了基於動物的疾病傳播或對動物蛋白產生過敏反應的風險。最知名的非動物穩定化透明質酸是由Q-med，Seminariegatan, Uppsala製造的，並且可以以商品名Restylane 得到。從其1996年商業化開始，據估計全球已經進行了超過250萬次處理。其他非動物穩定化透明質酸產品包括來自Q-med的Per lane ,其與Restylane 相比具有較大的顆粒，以及來自Genzyme公司的Captique 0另一個常用的填充劑是Genzyme公司生產的乙醯透明質酸,並且可以以商品名Hylaform Plus得到。Hylaform Plus是由乙醯透明質酸交聯分子組成的無菌、無熱源、粘彈性、澄清、無色、透明的凝膠植入物。儘管透明質酸及其衍生物是最常用的真皮填充劑，但它們的活力有限。需要每
4-12個月或甚至更短的時間重新注射。據報導，皮膚可以注射生長因子以通過增加真皮中的脂肪量來恢復皮膚的外觀。用特定的生長因子刺激前體脂肪細胞(preadipocyte)誘導未定向細胞加速分化為脂肪細胞，導致在注射部位脂肪的局部增加。這些生長因子包括胰島素、胰島素樣生長因子、三碘甲狀腺原氨酸(T3)、甲狀腺素(T4)和視黃酸。如由此通過引用全部併入的美國專利7，414，021所教導的，注射組合物可以包括 透明質酸作為載體和至少一種生長因子，所述生長因子充當細胞間的信號分子並促進細胞的分化和成熟。這種生長因子的作用類似於激素。用作注射組合物一部分的合適激素是甲狀腺激素和雌激素。美國專利7，414，021陳述，許多不同的生長因子可用於刺激前體脂肪細胞並誘導其在注射部位向成熟脂肪細胞的加速分化；然而，特定的生長因子如雌激素在注射到真皮後刺激彈性蛋白和膠原蛋白產生。在真皮層和下面的皮下組織層中實現的效果的結合導致處理部位處年齡相關組織損失的恢復雖然在過去的50年中，各種注射劑已被開發並在臨床用於恢復面部中的年齡相關組織損失，但由於材料或與組織的相容性中的各種限制，恢復組織損失中的長期效果有限。期望開發改進的注射劑和處理方法，以提高在恢復面部或身體所選區域如頸部和手部中年齡相關組織損失中的整體效果。本發明提供了改進的注射劑和遞送它們的方法。改進的注射劑包括自體幹細胞，儘管也可使用來自該個體以外的來源的幹細胞。遞送幹細胞的新方法包括微磨療法(microabrasion therapy)的應用。幹細胞和幹細胞衍生物的應用已經在醫學研究中引起增加的興趣，特別是在提供用於處理組織損傷的試劑領域，所述損傷無論是遺傳缺陷、損傷和/或疾病過程引起的。理想地，能夠分化成受影響細胞類型的細胞可以被移植到需要其的受試者中，在該受試者中它們將與器官微環境相互作用並供應所需的細胞類型來修復損傷。申請人首次認識到，這種幹細胞可用於恢復面部和身體所選其它區域中的年齡相關組織損失。申請人:還認識到創造環境使注射幹細胞保持和旺盛生長的需要。因此，申請人在注射幹細胞前在皮膚上進行微磨皮(microdermabrasion)。通過這些描述，包括上述相關技術的描述，在此描述的任何和所有可公開獲取的文件，包括任何和所有的美國專利，特別地在此通過引用全部併入。上述相關技術的描述並非意圖以任何方式認可，本文任何描述的文件、包括未決的美國專利申請是本公開的現有技術。此外，本文中與所述產品、方法和/或裝置相關的任何缺點的描述並非意圖限制公開的實施方案。事實上，本公開的實施方案可包括所述產品、方法和/或裝置的某些特徵，而不遭受其所述缺點。發明概述
本發明涉及恢復人面部或身體所選區域中年齡相關組織損失的處理方法。在一個實施方案中，該處理方法包括下列步驟提供包含幹細胞和載體的組合物，並且將組合物注射到人面部的一個或多個區域或者人身體所選區域的真皮或者皮下組織中，以刺激膠原蛋白、彈性蛋白或者脂肪細胞產生，由此恢復人面部或身體所選區域中的年齡相關組織損失。在本發明的另一個實施方案中，處理方法還包括最初重複處理時期(treatmentsession)大約兩次,兩個時期之間的時間間隔為大約一周。在本發明的又一個實施方案中，處理方法還包括每兩個月重複處理時期一次，進
行一年。在本發明的另一個實施方案中，組合物可以包括透明質酸作為載體。另外，處理方法也可以與和特定生長因子組合的透明質酸注射相結合。透明質酸隨著時間在真皮或者皮下組織中吸收，由此提供組合物中生長因子向真皮或者皮下組織中的延時釋放(timerelease)。可以用於本發明方法的生長因子包括胰島素、胰島素樣生長因子、甲狀腺激素、成纖維細胞生長因子、雌激素、視黃酸或者其組合。在本發明的另一個實施方案中，注射組合物可以包括脂肪細胞。脂肪細胞可以通過充當襯墊行使它們在整容中的傳統作用；然而，脂肪細胞還能夠創造使得被注射的多能細胞自身定向成為脂肪細胞的環境。在另一個實施方案中，本發明涉及用於在引入幹細胞前準備皮膚的方法，這允許幹細胞在注入皮膚之後保持和旺盛生長。通過進行微磨皮促進細胞修復來處理皮膚，這創造使得被注射幹細胞茁壯成長的環境。根據一些實施方案，提供包括幹細胞以及作為載體的透明質酸的組合物，其中所述幹細胞是外周血幹細胞、骨髓衍生幹細胞或者間充質幹細胞。優選地，幹細胞是自體幹細胞。根據一些實施方案，提供用於恢復人面部或身體所選區域中組織容量的處理方法，包括向人受試者施用包括幹細胞和作為載體的透明質酸的組合物，其中所述幹細胞是外周血幹細胞、骨髓衍生幹細胞或者間充質幹細胞，並且其中所述組合物通過注射到面部的一個或多個區域的真皮或者皮下組織中施用，由此恢復所述人身體的所述所選區域的組織容量。優選地，幹細胞是自體幹細胞。在一些實施方案中，組合物還包括脂肪細胞或者前體脂肪細胞。在一些實施方案中，組合物還包括胰島素、胰島素生長因子、甲狀腺激素、成纖維細胞生長因子、雌激素、視黃酸或者其組合。甲狀腺激素可以是三碘甲狀腺氨酸鈉、左旋甲狀腺素鈉或者其組合。在一些實施方案中，面部的一個或多個區域是眶周區域、唇、顴骨區域、鼻唇褶、唇-下頜褶、頸部或者手。在一些實施方案中，本公開的幹細胞組合物還包括視黃酸。在一些實施方案中，本公開的幹細胞組合物還包括氘減少的水。


為了更好地理解本發明，參考下列描述並結合附圖，其中相同的參考字符自始至終指相同的部分。圖I顯示人間充質幹細胞向前體脂肪細胞或者脂肪細胞的體外分化。發明詳述
為了促進對本發明原理的理解，現在將參考圖中示例說明的實施方案，並且將使用特定語言對其進行描述。但應該理解，不意圖由此限制本發明的範圍，在示例說明設備中的這種變化和進一步的修改、以及如本文示例說明的本發明原理的這種進一步應用對於本發明相關領域技術人員來說將被視為是通常可想到的。注射組合物
一方面，本發明提供包括幹細胞(例如，多能幹細胞)的注射組合物，用於注射到真皮或者皮下組織(皮下組織)中以恢復面部和身體所選區域如頸部和手中的年齡相關組織損失。根據一些實施方案，幹細胞是自體幹細胞。根據一些實施方案，幹細胞是自體外周血幹細胞。根據一些實施方案，幹細胞是自體間充質幹細胞(MSCs)。根據一些實施方案，幹細胞是自體極小胚胎樣(VSEL)幹細胞。本發明的幹細胞可以使用任何可用的載體(例如，藥學可接受的載體)配製成可注射的皮下製劑。鹽水是合適的載體，如同任何無菌生理緩衝劑一樣。幹細胞
包括多能幹細胞的根據本發明的幹細胞通過本領域眾所周知的方法分離。任何未定向的多能或全能細胞可用作本發明的一部分，包括來自胚胎和成體來源的幹細胞。來自許多不同組織的幹細胞已 經被分離用於再生醫學中。例如，在此通過引用全部併入的授予Tsukamoto等人的美國專利第5，750，397號公開了人造血幹細胞的分離和生長,所述造血幹細胞被報告能夠分化為淋巴、紅細胞和骨髓單核細胞譜系。在此通過引用全部併入的授予Bruder等人的美國專利第5，736，396號公開了在合適的生長和/或分化因子的影響下分離的人間充質幹細胞的譜系定向分化方法。然後衍生細胞可以被引入宿主中用於間充質組織再生或修復。本發明考慮多種幹細胞的應用。例如，間充質幹細胞(MSCs)是一種這樣的細胞類型。MSCs已顯示具有分化為幾個譜系的潛能，包括骨(Haynesworth等(1992) 13Bone 81_88)、軟骨((Mackay 等(I"8) 4 Tissue Eng 41 5_28 ;Yoo 等(I"8) 80 JBone Joint Surg Am 745-57)、脂肪組織(Pittenger 等(2000) 251 Curr Top MicrobiolImmunol-11)、腱(Young 等(1998) 16 J Orthop Res 406-13)、肌肉以及間質(Caplan 等(2001) 7 Trends Mol Med 259-64)。也可應用 Ratajczak (WO 2007/067280)鑑定的極小胚胎樣(VSEL)幹細胞，其在此通過引用全部併入。提供同質人間充質幹細胞組合物，其作為用於所有間充質細胞譜系的祖先。通過用獨特單克隆抗體識別的特異性細胞表面標記鑑定MSCs。同質MSC組合物通過粘附骨髓或者骨膜細胞的陽性篩選而獲得，它們沒有與造血細胞或者分化的間充質細胞相關的標記。這些分離的間充質細胞細胞群顯示僅與間充質幹細胞相關的表位特性、具有在培養中再生而不分化的能力、並且具有在體外誘導或置於體內損傷組織位點時分化為特定間充質譜系的能力。為了獲得受試者人間充質幹細胞，從骨髓中的其他細胞或其他MSC來源中分離稀有的多能間充質幹細胞是必要的。骨髓細胞可以從髂嵴、股骨、脛骨、脊柱、肋骨或者其他骨髓腔獲得。人間充質幹細胞的其他來源包括胚胎卵黃囊、胎盤、臍帶、胎兒和青年皮膚以及血液。它們的分離方法包括下列步驟提供包括間充質幹細胞的組織樣品；將來自組織樣品的細胞加入培養基，所述培養基包含刺激間充質幹細胞生長而不分化的因子，並且允許培養時僅間充質幹細胞選擇性地粘附到基底表面；培養樣品-培養基混合物；和從基底表面除去未粘附物質。另一方面，本發明涉及用於從組織樣品中分離人間充質幹細胞的培養基，其中培養基包括刺激間充質幹細胞生長而不分化的因子，並且允許培養時僅間充質幹細胞選擇性地粘附到基底表面。在另一個方面，本發明涉及用於培養-擴增分離的和/或純化的間充質幹細胞的方法，例如骨髓、血液、骨膜或者真皮衍生的間充質幹細胞。該方法包括下列步驟提供包括間充質幹細胞的組織樣品；將來自組織樣品的細胞加入培養基，所述培養基包含刺激間充質幹細胞生長而不分化的因子，並且允許培養時僅間充質幹細胞選擇性地粘附到基底表面；培養組織樣品-培養基混合物；通過用相同組成的新鮮培養基替換培養基從基底表面除去未粘附物質；和允許分離的粘附間充質幹細胞培養擴增。已經發現，在特定條件下、在培養擴增期間，培養擴增的間充質幹細胞的分化和/或修復潛能得以保持。用於獲得人間充質幹細胞的方法在美國專利第5，486，359號中描述，其在此通過引用全部併入。另一細胞群，多潛能成體祖細胞(MAPCs)，也已從骨髓中純化(BM; Reyes等(2001) 98 Blood 25261 5-2625 ；Reyes &Vetfaillie (2001) 938 Ann NY Acad Sci 231-235)。已經顯示，這些細胞能夠在體外擴增超過100群體倍增數而沒有端粒變短或者核型異常的產生。還已顯示，MAPCs能夠在確定培養條件下分化為30種的各種間充質細胞(例如，成骨細胞、成軟骨細胞、脂肪細胞和骨骼肌肌細胞)、內皮、神經外胚層細胞，以及更近期地分化為肝細胞(Schwartz 等(2000) 109 J Clin Invest 1291-1302)。另外，造血幹細胞(HSCs)已報告能夠分化為許多細胞類型。BM造血幹細胞已報告能「轉分化」為表達早期心臟(Orlic 等(2003) 7 Pediatr Transplant 86-88; Makino等(1999) 103 J Clin Invest 697-705)、骨骼肌(Labarge & Blau (2002) 111 Cell589-601; Corti 等(2002) 277 Exp Cell Res 74-85)、神經(Sanchez-Ramos (2002) 69Neurosci Res 880-893)、肝臟(Petersen 等(I 999) 284 Science I 168-1 170)或胰腺細胞(Lanus 等(2003) 111 J Clin Invest 843-850; Lee & Stoffel (2003) 111 JClin Invest 799-801)標記的細胞。人中的體內實驗也證明⑶34 +外周血(PB)幹細胞的移植導致供體衍生的肝細胞(Korbling等(2002) 346 N Engl J Med 738-746)、上皮細胞(Korbling 等(2002) 346 N Engl J Med 738-746)以及神經元(Hao 等(2003) 12 JHematother Stem Cell Res 23-32)的出現。另外，人BM衍生細胞已顯示有助於梗塞心肌白勺再生(Stamm 等,(2003) 361 Lancet 45-46)。幹細胞富集或分選
可以根據與幹細胞有關的細胞表面標記對幹細胞進行分選。因為對幹細胞進行富集是本發明的一個實施方案，用於細胞分選的有用標記無需唯一地在幹細胞中表達。但不是唯一地在幹細胞中表達的細胞標記在幹細胞的富集中會具有效用。還應該注意到，分化細胞的標記也用於本發明的方法，因為這些標記可以用於例如選擇性地移除分化細胞，並且因而在其餘細胞群中富集幹細胞。可用於本發明的任何過程的細胞表面或者其它處的標記包括至少下列，
權利要求
1.組合物，其包含幹細胞和作為載體的透明質酸，其中所述幹細胞是外周血幹細胞、骨髓衍生幹細胞或者間充質幹細胞。
2.根據權利要求I的組合物，其中所述幹細胞是自體幹細胞。
3.根據權利要求I的組合物，其中所述組合物還包含脂肪細胞或者前體脂肪細胞。
4.根據權利要求I的組合物，其中所述組合物還包含胰島素、胰島素樣生長因子、甲狀腺激素、成纖維細胞生長因子、雌激素、視黃酸或者其組合。
5.根據權利要求I的組合物，其中所述甲狀腺激素是三碘甲狀腺氨酸鈉、左甲狀腺素鈉或者其組合。
6.根據權利要求I的組合物，其中所述面部的一個或多個區域是眶周區域、唇、顴骨區域、鼻唇褶，唇-下頜褶、頸或者手。
7.根據權利要求I的組合物，其中所述組合物還包含視黃酸。
8.根據權利要求I的組合物，其中所述組合物還包含氘減少的水。
9.用於恢復人面部或身體所選區域中組織容量的處理方法，包括向人受試者施用組合物，所述組合物包含幹細胞和作為載體的透明質酸，其中所述幹細胞是外周血幹細胞、骨髓衍生幹細胞或者間充質幹細胞，並且其中所述組合物通過注射到面部的一個或多個區域的真皮或皮下組織中施用，由此恢復所述人身體所述所選區域的組織容量。
10.根據權利要求9的處理方法，其中所述幹細胞是自體幹細胞。
11.根據權利要求9的處理方法，其中所述組合物還包含脂肪細胞或者前體脂肪細胞。
12.根據權利要求9的處理方法，其中組合物還包含胰島素、胰島素樣生長因子、甲狀腺激素、成纖維細胞生長因子、雌激素、視黃酸或者其組合。
13.根據權利要求9的處理方法，其中所述甲狀腺激素是三碘甲狀腺氨酸鈉、左甲狀腺素鈉或者其組合。
14.根據權利要求9的處理方法，其中所述面部的一個或多個區域是眶周區域、唇、顴骨區域、鼻唇褶、唇-下頜褶、頸或者手。
15.根據權利要求9的處理方法，其中所述組合物還包含視黃酸。
16.根據權利要求9的處理方法，其中所述組合物還包含氘減少的水。
全文摘要
本發明涉及用於恢復面部和身體其他所選區域中年齡相關組織損失的幹細胞組合物和方法。在第一實施方案中，組合物包括幹細胞和作為載體的透明質酸，其中幹細胞是外周血幹細胞、骨髓衍生血液幹細胞或者間充質幹細胞。
文檔編號A61K8/02GK102625689SQ201080030065
公開日2012年8月1日 申請日期2010年5月4日 優先權日2009年5月4日
發明者R.L.史密斯, V.賈姆帕帕 申請人:尼奧斯泰姆公司