多通道測試裝置、其生產方法及其用途的製作方法
2023-06-21 11:22:46 1
專利名稱：多通道測試裝置、其生產方法及其用途的製作方法
技術領域：
本發明涉及基於免疫擴散的多通道測試裝置，該測試裝置能夠同時或平行進行多個不同的分析。本發明還公開了所述裝置的製備和用途。
背景技術：
已知多種基於免疫擴散的方法和測試裝置，例如下述專利和專利申請中所公開的US 4,757,002,US 3,990,852,US 4,562,147以及EP 0 250 137。也已經公開了基於免疫擴散的免疫層析方法，例如下述專利和專利申請中所公開的EP 0 291 194，EP 0 284 232(FI 93150)和WO 86/03839。
對於上述基於免疫擴散和免疫層析的測試裝置來說，最常見的是每個測試裝置僅用於進行一個分析。在很多情況下，對患有特定疾病或症候群的病人進行確診和選擇合適的治療方法可能需要進行多個不同的分析。如果識別引發症狀和疾病的病因或排除特定疾病需要進行多個不同的測試，那麼進行診斷將變得非常昂貴，以至於通常只進行一個或很少數目的分析，這些分析是基於治療醫師的判斷而隨機選擇的，或者是常用測試，在這種情況下，其它可選測試可能無法進行。
多於一個測試通道的使用是已知的，例如US B1 6,171,870和US A12003/0040021中所公開的。US B1 6,171,870涉及生產此類通道的方法，該方法涉及將斥水(water-repellent)物質例如蠟施加到多孔載體上。被處理的區域形成了通道之間的阻斷部分。在US A12003/0040021描述的方法中，樣品沿著處理過的通道移動，而未處理的區域留在通道之間。
與現有技術中的方法和測試裝置相比，本發明的優點包括試劑和材料消耗的減少、樣品體積和負載的下降，以及環境友好性、貨架壽命和用戶友好性的改善。環境友好性的提高是由於使用過的測試裝置所引起的環境負載下降。由於試劑消耗和人力成本的節約，本發明的方法可以以極低的成本生產測試裝置。
與基於免疫擴散和免疫色譜的常規測試裝置相關的問題在本發明中得到了解決，本發明的特徵公開在下面的權利要求中。
發明內容
本發明的基於免疫擴散的測試裝置包含多孔載體材料以及其中的區帶(zone)或斑點(blot)的形式的特異結合試劑(免疫試劑)。與第二種特異結合試劑(免疫試劑)偶聯的可檢測的標記被單獨或預先施加到所述多孔載體中，並且可被所述樣品移動。任選提供有過濾器的樣品施加位點也位於該測試裝置上。該測試裝置的多孔載體材料優選由硝酸纖維素製成，並且包含通道網絡，其是通過用雷射處理蝕刻到所述多孔載體材料中的。該通道網絡包含兩個或更多個通道(1)，由處理過的區域(2)隔開，固定於其中的一種或多種特異結合試劑(3)，置於所述通道中鄰近樣品施加位點(5)或位於樣品施加位點(5)本身裡的任選的標記點(4)，其放置的方式使得所述樣品能夠均勻分布到各個通道中。
本發明的測試裝置能夠基於同時或平行進行的對多種產生症候群的試劑或分析物的識別對不同的疾病或症候群進行診斷。該測試裝置可用於同時識別多種產生過敏的試劑，心肌梗塞標記物，產生性病的試劑，血液篩選分析物，產生呼吸系統感染的試劑，產生傳染病的試劑和/或癌症標記物。
有用的特異結合試劑的例子是抗體、抗體片段、重組抗體、重組抗體片段、抗原、凝集素、受體和/或配體。有用的標記試劑是例如乳膠、金、金屬或染色劑微粒或螢光物質。
本發明公開了一種生產該測試裝置的方法，其中所述特異識別免疫試劑固定在多孔材料中，已經使用物質使其變為惰性，並且其中樣品施加位點任選提供有過濾器和可檢測的標記，該可檢測的標記上結合有特異結合試劑。通過用雷射蝕刻多孔材料在所述多孔材料上形成具有預期形狀和尺寸的通道網絡。該網絡包含兩個或更多個通道(1)以及處理過的區域(2)；和一種或多種識別特異結合試劑被固定在各個通道(1)中作為區帶或斑點(3)。
使所述多孔材料變為惰性的有用的物質是混合物，其包含天然或合成聚合物，例如白蛋白和酪蛋白或PEG(聚乙二醇)和PVA(聚乙烯醇)，非離子去垢劑例如己烷磺酸和TRITON-X-100、BRIJ和防腐劑，例如糖，如蔗糖和海藻糖，或它們的衍生物。
在施加所述試劑後，所述測試裝置被乾燥並保持在相對溼度不超過8％並且被密封包裝，從而大大提高了所述測試裝置的耐儲存性。
該多通道測試裝置在同時或平行進行多個檢測中是有用的，這使得人們能夠診斷在只使用一個標記物的情況下可能很難診斷的目標疾病和/或症候群。所述樣品被施加到該測試裝置的施加位點(5)，其含有可被可分析樣品移動的標記以及與之偶聯的第二種特異結合試劑，所述樣品和試劑從該位點均勻移動到該通過雷射處理形成的通道網絡的通道中，在此處它們與所述特異結合試劑在其固定點(3)處反應或不反應，陽性或陰性結果可從此處直接讀出。
本發明還涉及用於同時或平行進行用於識別目標疾病和/或症候群的多個檢測的測試裝置。樣品被施加到該測試裝置的施加位點(5)，所述樣品從該位點移動到通道中，在此處其與可被所述樣品移動的標記和與之結合的第二種特異結合試劑混合併發生反應，此後，所述樣品和試劑均勻移動到該通過雷射處理形成的通道網絡的通道中，在此處它們與所述特異結合試劑在其固定點(3)處反應或不反應，陽性或陰性結果可從此處直接讀出。
本發明還涉及所述測試裝置在同時或平行進行用於識別目標疾病和/或症候群的多個檢測中的用途。所述樣品與單獨的標記(該標記具有與之偶聯的第二種特異結合試劑)混合，並且該混合物被施加到該測試裝置的施加位點(5)，所述樣品和試劑從該位點均勻移動到該通過雷射處理形成的通道網絡的通道中，在此處它們與所述特異結合試劑在其固定點(3)處反應或不反應，陽性或陰性結果可從此處直接讀出。
圖1示出了具有八個通道的網絡，這是用於進行多達八個不同檢測的優選測試裝置。標記點4同時作為樣品施加位點5起作用，通道1被處理過的區域2隔開，含有特異結合劑作為區帶3。
圖1a示出了根據圖1的用於進行最多八個不同檢測的多通道測試裝置的較好實施方式。標記點4同時作為樣品施加位點5起作用，通道1被處理過的區域2隔開，含有特異結合劑作為區帶3。該裝置標記有關於該測試和製造商的信息。
圖2示出了一種測試裝置，該測試裝置可用於進行六個不同的檢測及其對照反應，或者任選地，通過六個不同的標記進行最多十二個不同的檢測。通道1之一分支為兩個通道1a、1b，它們被處理過的區域2隔開。樣品施加位點位於通道網絡的中間，每個通道1包含標記點4以及一個或多個結合劑區帶3。
圖3示出了一種測試裝置，該測試裝置可用於進行四個不同的檢測及其對照反應，或者任選地，通過四個不同的標記進行最多八個不同的檢測。
圖4示出了一種測試裝置，該測試裝置可用於進行四個不同的檢測及其對照反應，或者任選地，通過四個不同的標記進行最多八個不同的檢測。
圖5示出了一種測試裝置，該測試裝置可用於進行最多六個不同的檢測，或者任選地三個檢測，及其對照反應。
圖6示出了一種測試裝置，該測試裝置可用於通過四個不同的標記進行十二個不同的檢測。
圖7示出了具有八個通道的網絡，這是用於進行最多二十四個不同檢測的優選測試裝置。每個通道1包含三個結合劑區帶3。
圖8示出了可用於同時進行十六個不同檢測的測試裝置。
圖9示出了一種測試裝置，該測試裝置可用於通過五個不同的標記進行二十個不同的檢測。
圖10示出了可用於進行二個檢測及對照反應的測試裝置。該裝置標記有關於該測試和製造商的信息。
圖11示出了可用於進行二個檢測及對照反應的測試裝置。該裝置標記有關於該測試和製造商的信息。
圖12示出了一種通過雷射蝕刻生產的測試裝置，該測試裝置可用於進行三個平行檢測，或者任選地三個個別的檢測及其對照反應。該裝置標記有關於該測試和製造商的信息。
具體實施例方式
本發明的目標是基於免疫擴散的多通道測試裝置，該裝置包含多孔載體材料，和在該材料中的區帶或斑點形式的一種或多種特異結合試劑(免疫試劑)，以及樣品施加位點，該樣品施加位點任選配置有過濾器，例如用於除去血細胞，並且任選包含可被可分析樣品移動的標記，其被第二種特異結合試劑(免疫試劑)包被。該標記位於測試裝置上或被加入樣品中。
本發明測試裝置的特徵在於它包含通道網絡，該通道網絡是通過在多孔載體材料上通過蝕刻，例如通過雷射，而製備的。已向該測試裝置的通道提供了一種或多種相同或不同的特異結合劑，該特異結合劑是從不同的標記物組中選擇的，可以一起使用，並且是診斷特定症候群所需要的。因此，通過同時進行用於識別特定目標疾病和/或症候群的多個檢測，使得診斷得以進行。樣品施加位點可以是點或斑點或線或區帶的形式，位於例如長條(strip)的中間或另一端，使得樣品可以均勻地分布到各個通道中。如果相同的特異結合試劑以不同的濃度用於通道中，那麼可以獲得半定量的結果。
本發明的測試裝置包含多個通道，可用於同時或平行測定多種分析物。在測試裝置中，可以任選地對下列試劑進行分組識別與各種症候群相關的致病劑(例如變應原)的試劑心肌梗塞標記物，用於識別性病和用於血液篩選的合適試劑，識別產生呼吸系統感染的試劑的標記物，IgG、IgA和IgM抗體，識別產生其他感染性疾病的標記物以及各種癌症標記物，用於它們的同時或平行測定。
本發明的另一個目的是生產所述測試裝置的方法。該生產方法的特徵在於，通過雷射技術，在多孔材料上蝕刻出具有預期形狀和尺寸(見圖1-12)的多通道網絡，所述雷射技術在基片上製造出某種形狀。不同的識別特異結合試劑被永久地連接(也就是固定)在每個通道的多孔物質中。測試反應的分析結果可以從這些點中讀出。
在這之後，採用可使自由反應位點變為惰性的物質處理多孔材料，也就是說，它們不以人們不想要的方式反應，例如通過減緩或阻止分析物或標記移動到永久固定的試劑區帶或斑點中。可檢測的、任選可見的標記上結合了第二種特異結合試劑，該標記被施加到樣品施加位點或測試通道的預定位置上。該結合試劑所結合的標記也可以被加入到樣品中，在這種情況下，當樣品被加入到樣品施加位點時，該標記被轉移到裝置中。
此外，本發明還描述了測試裝置在同時或平行進行多個檢測以識別某些疾病和/或症候群中的用途。分支的通道也可以用於對照該裝置的適當功能，採用通道之一作為測試通道，其它的通道作為功能性或對照(control)通道。也可以在測試裝置中加入指明裝置和試劑的功能性的獨立的對照通道。
本發明的多通道測試裝置及其在診斷方法中的應用與上述專利和專利申請中公開的現有技術中的測試裝置的不同點在於一個或多個不同的或相同的平行測試，優選2-40個，更優選4-30個，最優選8-24個平行測試可以採用從多孔材料製得的極小對象來進行。
採用雷射來生產通道網絡是製造本發明的測試裝置的優選方法。在該生產方法中使用的機器不昂貴，運行成本主要由耗電量構成。與使用斥水物質例如熱蠟相比，通過使用雷射，可以避免在製造過程中使用化學品。通過使用雷射，可以獲得精確的蝕刻結果(列印)，並且由於列印(壓印)的精確程度，如果需要的話，測試裝置可以在製造過程中被標記，從而減少把裝置搞混的危險。
可以通過下述方法製造大量的測試在滾軸上蝕刻單個的通道、平行通道或通道網絡，並在同一生產線上加入所需要的試劑和處理，最後以期望的方式將測試彼此分開成為單個的測試用於一個或多個檢測，或者成為多個平行測試的測試組合。
此外，測試裝置可以用於分析小體積的患者樣品，例如尿、血、血漿、血清、唾液、組織液、糞便、環境樣品等。小的樣品體積，即使小至每個測試裝置1.0-50μl，優選2.0-40μl，更優選4.0-20μl，或最優選5.0-10.0μl就足夠了，這有很多優點，特別是在針對從小兒或指尖血樣收集的樣品進行檢測方面。
生產檢測裝置檢測裝置的生產包括六個主要步驟。形成通道網絡，施加和固定特異性試劑，使多孔通道變為惰性，施加用第二種特異性試劑包被的標記，生產樣品施加位點和穩定測試裝置並確保其儲存性質。在提到的主要步驟之間，可以乾燥測試長條。如果將標記加入到樣品中，那麼將標記施加到測試裝置的步驟可以省略。
在本發明的測試裝置中，通過在測試裝置中形成通道，多個不同或相同的平行測試(圖1-12)可以在很密集的多孔材料項目(item)上進行。
生產通道試劑和樣品的通道化可以通過用斥水或部分斥水的物質，例如蠟、聚烯烴、聚丙烯醯胺顏料或其混合物，處理多孔的透水材料，例如硝酸纖維素、聚磺酸酯(polysulphonate)、尼龍或紙，而獲得。多孔材料上斥水材料的施加是在它們的熔解溫度上進行的，優選在50℃和80℃之間的溫度，有利地通過使用列印(printing)、刷或噴霧技術，從而在多孔材料上形成斥水圖形，該圖形具有預期的形狀並且包圍通道網絡，所述通道網絡包括彼此由被處理的區域分開的數個通道，樣品由於毛細作用和擴散而沿所述通道移動。在施加之後，立即將基片冷卻至室溫。以保持試劑反應性的方式將其施加到通道網絡中是可能的。
自然，所述通道也可以通過對適當大小的載體材料進行壓制以形成具有預期形狀和尺寸的通道網絡來生產。
但是，根據本發明，通道化優選是通過用雷射處理多孔和透水的材料例如硝酸纖維素來進行的。通過採用合適的雷射能，在不希望流體流動到其中的硝酸纖維素基片區域的硝酸纖維素可以被蝕刻掉，而處理過的區域僅被纖維素下面的塑料膜(Mylar膜)覆蓋。不同形狀的圖形(圖1-12)是由含硝酸纖維素或某種其它多孔材料的通道以及通道邊緣或處理過的區域形成的，所述處理過的區域完全延伸到基片邊緣，並已採用合適的預先編程的電腦程式進行了雷射蝕刻，其中採用了設備最大輸出功率的10-90％，優選10-80％，更優選12-60％，最優選15-40％，蝕刻速度優選在100mm/s到1500mm/s，更優選400mm/s到1000mm/s，解析度在50/1000到1000/1000，優選在100/1000到800/1000，更優選在150/1000到500/1000，最優選在200/1000到300/1000。
隔開通道的處理過的區域可以完全延伸到測試裝置的邊緣，或者任選地，未處理的區域可以留在圖形邊緣上。測試裝置可以通過蝕刻用關於製造商或測試的信息進行標記，例如通過雷射處理。
將試劑施加到載體中將進行測試所需的各種試劑施加並(如果需要的話)固定到通道網絡中是可能的。可以以很小的體積使用試劑。所需的試劑包括至少兩種特異結合試劑，其中一種被固定，另一種與可被樣品溶液移動的標記相結合，以及至少一種可檢測的標記。
特異結合試劑合適的物質包括各種結合試劑，特異性免疫化學試劑，例如抗體、抗體片段、重組抗體、重組抗體片段、抗原，以及其它配體例如受體、凝集素、生物素、抗生物素蛋白等。特別合適的是單克隆和多克隆抗體、抗原及其片段。至於過敏測試，合適的變應原包括由樹、草或雜草的花粉製得的提取物，由黴菌的孢子、蟎蟲、室內灰塵、動物皮膚的表皮、昆蟲、乳膠、寄生蟲、藥物或食物製得的提取物等。
可以通過已知的方法將結合試劑固定或採用化學或物理手段連接到多孔載體結構上的預期位點處，對照反應的結合試劑也可以任選地被固定或採用化學或物理手段連接到同一通道或分支的通道上。
使多孔物質變為惰性在生產了通道網絡並施加了特異結合試劑之後，通過使用所謂的封閉試劑將多孔載體物質變為惰性，從而通過合適除去載體物質的自由反應位點和特異結合試劑的非特異結合位點，的混合物所述混合物中含有天然和/或合成的聚合物，例如白蛋白或酪蛋白和/或PEG(聚乙二醇)和PVA(聚乙烯醇)，非離子去垢劑，例如己烷磺酸和TRITON-X-100、BRIJ，以及防腐劑，例如糖，如蔗糖和海藻糖，或它們的衍生物。在這之後，對測試裝置進行乾燥。
如果期望的話，可以在測試裝置製備好之後再加入封閉試劑，與樣品的施加相關。
製備標記點合適的標記試劑包括可被樣品流移動的各種塑料或金屬微粒，例如乳膠、金、脂質體、染色劑、螢光團、螢光染料或其它此類金屬物質的微粒或染色劑，其能結合分析物並與特異結合劑例如抗體、受體、凝集素或其它配體結合。螢光顆粒、螢光染色劑或超順磁顆粒也可以作為標記。
標記可以固定在多孔載體中的測試裝置的樣品施加位點或另一個與樣品施加位點不同的位點上。標記試劑也可以在可分析樣品施加到測試長條上之前加入到可分析樣品中。
製備樣品施加位點樣品施加位點可以任選地配有過濾器，通過在樣品施加位點上放置過濾器來實現，該過濾器阻止例如血細胞被攜帶到通道中。樣品施加位點可以配有標記，該標記上已經結合了第二種特異結合試劑。
穩定測試裝置並確保其儲存性質可以通過處理測試裝置例如通過乾燥為其提供低於8％的相對溼度，在這之後，密封包裝該測試裝置並儲存在乾燥處，以維持測試裝置的相對溼度低於8％從而使測試裝置變得耐儲存。這樣，該裝置保持其功能性長達24-36個月，在功能性上沒有任何明顯的下降，包括敏感性或特異性。
必要時，該測試裝置可以放置在由紙板或塑料製成的箱子中，需要時，其可以配備有描述測試裝置的操作和使用的說明書。
測試裝置的結構測試裝置的結構及其可能的變化描述於圖1-12中。
測試裝置包括多個通道1，優選2-10個，更優選3-8個，通道1可以在分支點上進一步分為多個分支的通道，優選2-5個(1a、1b)，更優選2-3個。處理過的區域2將通道1彼此隔開，並指導樣品在測試裝置中的移動。
通道1或分支的通道(1a、1b)含有一種或多種結合試劑作為結合劑區帶或斑點3。此外，測試裝置包含一個或多個標記點4，其可以任選地與樣品施加位點5結合。樣品施加位點5可以任選地配有過濾器。
圖1示出了一種測試裝置，其中具有預期大小例如25×25mm的硝酸纖維素膜已被分為八個相同的通道1。該通道是通過在多孔材料例如硝酸纖維素膜上列印圖形，並在硝酸纖維素膜的處理過的斥水性區帶2上用壓印裝置轉移熱的、熔融的、約60℃的聚烯烴來製備的。每個通道都含有特異結合劑3。位於測試裝置中間的標記點4含有針對待測分析物的第二種標記試劑。樣品施加位點5同時作為測試裝置的標記點4起作用。根據圖1的測試裝置的特徵在於每個通道中都可以含有不同的特異結合劑(例如變應原)，並且對每種結合劑都相同的微粒標記(例如抗人IgE)位於通道的中間。
圖1a示出了一種測試裝置，其中硝酸纖維素膜已被分為八個相同的通道1。該通道是通過在多孔材料例如硝酸纖維素膜上通過雷射蝕刻圖形來製備的，使得處理過的區域2留在通道之間，在雷射處理過程中，已經在所述處理過的區域上加入了與測試和製造商有關的標記。每個通道都含有特異結合劑3。位於測試裝置中間的標記點4含有針對待測分析物的第二種標記試劑。樣品施加位點5同時作為測試裝置的標記點4起作用。根據圖1的測試裝置的特徵在於每個通道中都可以含有不同的特異結合劑(例如變應原)，並且對每種結合劑都相同的微粒標記(例如抗人IgE)位於通道的中間。
圖2示出了一種測試裝置，其中通道1之一包含分支的通道1a和1b，其在結合劑區帶3上含有特異結合劑。其它的通道1包含兩個結合劑區帶3，其中另一個可以是對照區帶。所有的通道1含有單獨的標記點4。該裝置的中心包含單獨的樣品施加位點5。
圖3示出了一種測試裝置，其中四個相同或不同的通道1包含分支的通道1a和1b，其在結合劑區帶3上含有特異結合劑，並且在通道分支點的下遊含有四個單獨的微粒標記點4，該微粒標記點4已用特異結合劑包被。該裝置包含單獨的樣品施加位點5。
圖4示出了一種測試裝置，其具有四個相同或不同的通道1，所述通道1分支為通道1a和1b，其相應在結合劑區帶3上含有特異結合劑，並且在通道分支點的下遊含有四個單獨的微粒標記點4，該微粒標記點4已用特異結合劑包被。該裝置包含單獨的樣品施加位點5。
圖5示出了一種測試裝置，其中樣品施加位點位於該測試裝置或長條的一個末端。該裝置包含三個通道1，在每一個通道1中具有兩個結合劑區帶3。標記點4與樣品施加位點5相同。
圖6示出了一種測試裝置，其中四個不同的通道1進一步分支為三個通道1a、1b和1c，在所述通道1的12個單獨的結合劑區帶3中，含有最多12種不同的結合劑。而且，該裝置包含四個單獨的標記點4。該測試裝置包含單獨的樣品施加位點5。
圖7示出了一種測試裝置，包含八個相同的通道1以及它們之間的處理過的區域2。每一個通道1中含有三種特異結合劑，任選針對不同的分析物，位於三個單獨的結合劑區帶3中。位於測試裝置中間的標記點4含有針對待測分析物的另一種標記試劑。
圖8示出了包含八個通道1的測試裝置，每個通道1分支為兩個通道1a和1b，並含有結合劑區帶3。該裝置包含組合的標記和樣品施加位點4、5。
圖9示出了包含五個通道1的測試裝置，每個通道包含四個結合劑區帶3。該裝置包含四個單獨的標記點4和樣品施加位點5。
圖10示出了用於檢測病毒抗原的測試裝置，其中樣品施加位點5位於該測試裝置或長條的一個末端。該裝置包含三個通道1，每一個通道1中含有結合劑區帶和分離的標記點4。該裝置標記有關於製造商和測試的信息。
圖11示出了用於心肌梗塞檢測的測試裝置，其中樣品施加位點5位於該測試裝置或長條的一個末端。該裝置包含三個通道1，每一個通道1中含有結合劑區帶3和分離的標記點4。該裝置標記有關於製造商和測試的信息。
圖12示出了三種測試裝置，其中樣品施加位點5位於該測試裝置的一個末端。該裝置包含標記點4和結合劑區帶3，其中另一個結合劑區帶是對照點。
上述測試裝置的形式和尺寸只能被視為本發明的方法可以製造的測試裝置的例子。
測試裝置用於進行同時或平行檢測本發明基於多孔材料例如硝酸纖維素中的流體流動，由於擴散和毛細作用，所述的流體流動實際上在各個方向以相同的速度發生，這一點是公知的。所述輻射狀或側向流動使得樣品能夠移動到多個通道中，只要多孔材料的通道化已經以可靠的方式進行，其中該樣品中含有可分析的分析物和測試試劑，所述通道同時進行不同的測試。施加到測試裝置中的樣品與加入到樣品中的標記反應或與施加到該裝置中的一種或多種標記反應，該複合物隨後與固定的結合劑反應，所述結合劑進一步放置在測試裝置的不同的通道內。免疫試劑也可以被固定，而不幹擾其功能性。將樣品施加到測試裝置中是通過將少量樣品或其稀釋液施加到樣品施加位點5上來進行的，樣品從樣品施加位點5向標記點4移動，並沿著通道進一步進入測試區帶3，標記的特異結合劑、樣品中的分析物以及其它與固體載體結合的特異結合劑之間的反應發生在此處。如果標記是有顏色的微粒的話，該反應能夠由裸眼看到；或者，該反應可以作為發光的點、斑點、線或其它形狀在UV-光下由裸眼讀出；或者該反應可以通過合適的裝置，光度計、螢光計或測量磁場變化的裝置讀出和解釋。
在另一個實施方式中，標記點4位於樣品施加位點5中，在這種情況下，樣品中的分析物和標記的特異結合劑在樣品沿通道流動之前形成複合物。
在又一個實施方式中，標記向樣品中的施加是在向測試裝置中加入樣品之前進行的。
該測試裝置在過敏測試中是特別有用的，其中目前需要相對大量的血清以確定I gE類的過敏特異性抗體。當應用本發明時，通過將幾種不同的變應原分配到測試裝置的各個通道中，可以由很少量的樣品，甚至只有10-40μl的血清、血漿或全血，用同一個測試裝置同時檢測患者對多至24種或更多種不同變應原的敏化。
在本發明的一個優選實施方式中，將幾種不同的標記連接到測試裝置中。因此，一個小的樣品移動該標記，該標記任選是彼此不同的，並置於不同的通道中。這樣的測試裝置很適合於抗不同致病劑的免疫球蛋白特異性抗體檢測。
應用測試的實施例下面的實施方式應當被看作是實例，應該理解本發明的其它可能的應用對本領域技術人員來說是顯而易見的。
實施例1通過雷射形成通道網絡圖1a中所述的圖形是通過Domino DGM-1「High Resolution LaserMarker」裝置，將不希望流體在其中流動的區域中的硝酸纖維素蝕刻掉而在多孔的硝酸纖維素載體上製備的。在測試裝置上形成了包含八個通道1的網絡，所述通道1之間由處理過的區域2隔開。為了避免裝置被搞混的危險，通過不蝕刻硝酸纖維素而形成關於產品和製造商的標記。
預編程到電腦程式中的預期圖形是通過採用10-2500mm/秒的700mm/秒的標記速度、最大輸出功率20W的20％的雷射(85-132V/170-260V，I相輸入和20W輸出)和250/1000的解析度進行蝕刻的。
這樣生產的具有通道網絡的測試裝置模塊(matrix)用於根據下面的實施例同時進行多個檢測。
實施例2用於過敏檢測的測試裝置特異性可分析變應原作為溶液(濃度1-5mg/ml)加入到按照實施例1生產的測試裝置的網絡的通道1中，從而當它們連接到樣品施加位點的硝酸纖維素時，形成了不可溶區帶3。各個通道中施加不同的變應原(由樹、草或雜草的花粉製得的提取物，由黴菌的孢子、蟎蟲、室內灰塵、動物皮膚的表皮、昆蟲、乳膠、寄生蟲、藥物或食物製得的提取物)。在這之後，封閉通道1的反應性硝酸纖維素，即使之變為惰性，其中採用含有牛血清白蛋白(BSA)(0.1-5.0％)、己烷磺酸和海藻糖(1.0-3.0％)。將溶液(10-100μl)施加到測試裝置的中間，此後，由於擴散和毛細作用，其移動到各個通道中，並與硝酸纖維素的自由反應點結合(即封閉)。
此後，於室溫乾燥測試裝置，直到其相對溼度低於8％。
乾燥後，向測試裝置中間手工施加1.0-10.0μl的水溶液，其中含有用抗-IgE包被的有顏色的乳膠顆粒(0.2-1.0％)，該混合物中還含有0.1-1.0％的BSA，0.01-0.05％吐溫20和0.5-1.5％海藻糖。將顆粒溶膠乾燥到測試裝置的中間。
當使用測試時，來自患有過敏的人的10-50μl血清或其稀釋液被施加到測試裝置中間的樣品施加位點5上。樣品溶解了中間的標記。標記的抗-IgE抗體與過敏特異性IgE分子反應，並由於毛細作用擴散到測試通道中。
如果可分析樣品中含有針對測試裝置區帶3中的一種或多種變應原的特異性IgE抗體，那麼將在含有待測變應原抗體的反應通道中形成有顏色的區帶。
實施例3用於過敏測試的測試裝置採用合適的壓印機，將圖1所示的形成的圖形列印到多孔的硝酸纖維素載體上，其中形成了通道網絡，通過將有色的約60℃的聚烯烴在多孔載體上轉移，從而它封閉了預期區域中的載體的孔，並且在測試裝置上形成了網絡，該網絡含有被處理過的區域2隔開的八個通道1。
將待測的特異性變應原(濃度1-5mg/ml)加入到該網絡的通道中，從而它們形成了連接到樣品施加位點的硝酸纖維素的不可溶區帶3。各個通道中施加不同的變應原(由樹、草或雜草的花粉製得的提取物，由黴菌的孢子、蟎蟲、室內灰塵、動物皮膚的表皮、昆蟲、乳膠、寄生蟲、藥物或食物製得的提取物)。在這之後，封閉通道1的反應性硝酸纖維素，即使之變為惰性，其中採用含有牛血清白蛋白(BSA)(0.1-5.0％)、己烷磺酸和海藻糖(1.0-3.0％)。將溶液(10-100μl)施加到測試裝置的中間，此後，由於擴散和毛細作用，其移動到各個通道中，並與硝酸纖維素的自由反應點結合(即封閉)。
此後，於室溫乾燥測試裝置，直到其相對溼度低於8％。乾燥後，向測試裝置中間施加1.0-10.0μl的水溶液，其中含有用抗-IgE包被的有顏色的乳膠顆粒(0.2-1.0％)，該混合物中還含有0.1-1.0％的BSA，0.01-0.05％吐溫20和0.5-1.5％海藻糖。將顆粒溶膠乾燥到測試裝置的中間。
當使用測試時，來自患有過敏的人的10-50μl血清或其稀釋液被施加到測試裝置中間的樣品施加位點上。樣品溶解了放置在中間的標記。樣品的抗-IgE抗體與過敏特異性IgE分子反應，並由於毛細作用擴散到測試通道中。
如果可分析樣品中含有針對測試裝置區帶3中的一種或多種變應原的特異性IgE抗體，那麼將在含有待測變應原抗體的反應通道中形成有顏色的區帶。
實施例4用於性病測試和血液篩選的測試裝置實施例4描述了本發明在性病測試中的應用，其中，從病人的樣品中抗體和病毒抗原及細菌抗原被同時測定。
圖2中所示的測試裝置中已按實施例1所述製備了多通道網絡，該測試裝置被進一步製備，從而使得分支為兩個部分的第一通道1形成用於HIV1和HIV2抗體測試的測試通道。待測病毒的典型多肽或重組抗原被以線(Line)的形式置於這些通道中(0.1-0.5μl)，濃度為0.5-5.0mg/ml。有色標記點4置於通道1中，是通過用識別HIV1和HIV2病毒的第三種多肽或重組抗原包被例如金顆粒產生的。
同一測試裝置的第二通道1用於檢測HIV病毒抗原，通過將例如製備的抗HIV病毒p24-抗原的單克隆抗體的線或斑點(0.5-5.0mg/ml)置於該通道中，並將所謂的對照試劑區帶置於同一未分支通道1中，其中，所述對照試劑區帶包含針對同一待測標記抗體的單克隆抗體。
第三通道1用於檢測白血病病毒(HTLV-1/2)的抗體，通過以上述方法生產該病毒的典型重組抗原的測試線3和對照線3，並將所需的標記置於同一通道的標記點4中，所述標記是通過用HTLV1/2病毒的另一種典型的重組抗原包被金顆粒生產的。
以同樣的方式，將由適於檢測梅毒螺旋體(Treponema pallidum)細菌抗體的特異重組抗原製備的試劑區帶3置於第四通道1中。
在第五通道1中，放置了檢測B肝病毒表面抗原的測試系統，採用了兩種生產的針對表面抗原的特異抗體，一種在測試區帶3中，另一種在標記點4中。
檢測C肝病毒所需的試劑被置於第六通道1中。HCV的典型重組抗原置於測試線3中，標記點4是通過用抗人IgG包被金顆粒製備的。
用含有白蛋白(BSA)(0.1-5.0％)、TRITON-X-100、BRI和蔗糖的所謂封閉溶液處理測試裝置的所有通道1，通過將足量的該溶液加入到測試裝置的樣品施加位點5來進行，該溶液從樣品施加位點5擴散到各個通道中，並填充硝酸纖維素的反應點。在真空櫃中乾燥測試裝置以加速乾燥。
此後，通過使用合適的自動分配裝置，將每種測試的特徵性的所需上述標記加入到測試裝置的預定標記點4。按上述實施例所述進行乾燥。
當分析病人樣品時，將10-50μl的血清、血漿或全血施加到測試裝置的中間，結果可以在1-10分鐘的反應時間後讀出。當結果為陽性時，測試區帶出現有顏色的線或斑點，並且在那些通道或分支通道的對照區帶(如果有的話)中出現第二種有顏色的區帶。
實施例5用於性病測試和血液篩選的測試裝置實施例5描述了本發明在性病測試中的應用，其中，從病人的樣品中抗體和病毒抗原及細菌抗原被同時測定。
為了檢測HIV病毒抗原，圖3中所示的測試裝置中已按實施例1所述進行了通道化，該測試裝置是通過採用如下手段製備的將生產的抗HI V病毒p24抗原的多克隆抗體(0.5-5.0mg/ml)製備的斑點置於第一個通道1中，並將所謂的對照試劑區帶置於同一未分支通道中，其中，所述對照試劑區帶包含針對待測標記抗體的多克隆抗體。
以同樣的方式，將由適於檢測梅毒螺旋體細菌抗體的特異重組抗原製備的試劑區帶3置於第二通道1中。
在第三通道1中，放置了檢測B肝病毒表面抗原的測試系統，採用了兩種生產的針對表面抗原的特異抗體，一種在測試區帶3中，另一種在標記點4中。
檢測C肝病毒所需的試劑被置於第四通道1中。HCV的典型重組抗原置於測試線3中，標記點4是通過用抗人IgG包被金顆粒製備的。用含有酪蛋白(0.1-5.0％)、己烷磺酸和海藻糖(1.0-3.0％)的所謂封閉溶液處理測試裝置的所有通道1，通過將足量的該溶液加入到測試裝置的樣品施加位點5來進行，該溶液從樣品施加位點5擴散到各個通道中，並填充硝酸纖維素的反應區帶。在真空櫃中乾燥測試裝置以加速乾燥。
此後，將每種測試的特徵性的上述所需標記加入到預定標記點4。按上述實施例所述進行乾燥。
實施例6用於心肌梗塞測試的測試裝置很好描述了本發明應用的實例是用於由病人的全血、血漿或血清樣品檢測心肌梗塞的測試裝置。
生產了根據圖4的測試裝置用於四種不同的分析物。如實施例1所述生產的測試裝置包含四個相同的通道，每個通道進一步分支為兩個單獨的通道。這樣測試裝置就可以用於由一份樣品同時測定病人樣品中肌鈣蛋白I、肌紅蛋白、肌酸激酶MB同功酶(CKMB)和C反應蛋白(CRP)的存在。
至於測試裝置的通道1a和1b，將0.1-0.5μl濃度為1.0-5.0mg/ml的肌鈣蛋白I的抗體施加到通道1a中，將0.1-0.5μl濃度為1.0-5.0mg/ml的抗小鼠抗體施加到通道1b中。通道1a形成所謂的測試通道，通道1b形成所謂的內部功能性對照通道。
另一個反應對是由有顏色的顆粒形成的，該顆粒由生產的針對肌鈣蛋白I的抗體包被，並按實施例1所述施加到通道1中的預定標記點4。
除了肌鈣蛋白I之外，針對肌紅蛋白、CKMB和C反應蛋白(CRP)的特異測試也以上述方式製備於測試裝置中。
用含有聚乙二醇(PEG)、TRITON-X-100和海藻糖(1.0-3.0％)的所謂封閉溶液處理測試裝置的所有通道1，通過將足量的該溶液加入到測試裝置的樣品施加位點5來進行，該溶液從樣品施加位點5擴散到各個通道中，並填充硝酸纖維素的反應區帶。在真空櫃中乾燥測試裝置以加速乾燥。
此後，將每種測試的特徵性標記施加到測試裝置的預定標記點4。按上述實施例所述進行乾燥。
將樣品施加到測試裝置中間，樣品從此處輻射狀擴散到各個相同的通道中，如果病人樣品中含有對應於心肌梗塞標記物的分析物，那麼將啟動測試和對照反應。分析由血清、血漿或全血樣品進行，當採用全血時，合適的過濾系統從全血樣品中除去紅細胞和白細胞。
實施例7用於心肌梗塞測試的測試裝置如實施例1所述生產根據圖11的測試裝置，其中含有關於肌鈣蛋白I和肌紅蛋白特異性測試的信息的標記。
如實施例6所述產生肌鈣蛋白I和肌紅蛋白的特異性測試。如實施例6所述，也進行通道的封閉和標記的加入。通道之一作為對照通道，以確保測試被正確地儲存並且試劑是有功能的。
實施例8用於呼吸系統感染測試的測試裝置下面的實例描述了本發明在呼吸系統感染中的應用，其中期望由病人的血清、血漿或全血樣品測定針對所尋找的細菌或病毒抗原的類別特異性抗體。
如實施例1所述生產根據圖6的測試裝置。由每種可分析的細菌或病毒製備的抗原置於測試通道1中的點3，濃度為0.1-0.5mg/ml，每種試劑的總體積為0.1-0.5μl。通道1的非反應區帶被封閉，並且按實施例1所述乾燥測試裝置。分別在每個測試通道的分支點的標記點4中放置由抗-IgG、抗-IgM或抗-IgA抗體製成的偶聯物。按上文所述進行乾燥。
將病人的樣品(血清、血漿或全血)施加到測試裝置中間的樣品施加位點5，由於毛細作用，樣品從此處擴散並首先轉移到偶聯物(Conjugate)點，並在待測的標記點4中與微粒標記反應，隨後進一步向測試區帶3移動，如果樣品中含有針對可分析的細菌或病毒的待測亞類特異性抗體的話，在測試區帶3處將發生反應。以與上述實施例類似的方式檢測出陽性結果。
實施例9用於癌症診斷的測試裝置實施例9描述了本發明在癌症診斷測試裝置中的應用。如實施例1所述生產根據圖9的測試裝置。該測試裝置包含五個實際上相同的通道。將0.1-0.5μl生產的針對癌症標記物的單克隆抗體CA125(癌症抗原125)、PSA(前列腺特異性抗原)、pKAc(蛋白激酶A催化亞基)、CEA(癌胚抗原)、AFP(甲胎蛋白)加入到各個通道(從左至右)的各個測試點，濃度為0.1-5.0mg/ml。在施加抗體後，進行充分的乾燥，然後利用聚乙烯醇(PVA)、己烷磺酸和蔗糖進行封閉。然後對測試裝置進行乾燥，此後即可用於標記的加入。
向每個測試通道起始處的標記區帶4中分別加入針對相應癌症標記物製備的特異性標記，在該特異性標記中，按上述實施例所述，用生產的針對待測標記物的第二抗體包被金顆粒。在加入後，乾燥測試裝置，並將其包裝在保護性塑料盒中。
將10μl的病人樣品(血清、血漿、全血等)施加到樣品施加位點5，樣品從此處移動到對應於各個癌症標記物的通道1中，從標記點4溶解標記，並進一步向測試區帶3。如果樣品中含有可分析的癌症標記物的話，在待測通道中將出現可見的測試結果。
實施例10用於病毒抗原檢測的測試裝置實施例10描述了本發明在用於病毒抗原檢測的測試裝置中的應用。
為了檢測Rota病毒，通過向第一通道1中的測試區帶3中置入斑點，來生產圖10所示的測試裝置，該測試裝置已按實施例1所述進行了通道化，所述斑點由生產的針對病毒抗原的特異性抗體製成，該抗體是針對標記點4所用的標記抗體的抗體。
同一測試裝置的第三通道1用於檢測腺病毒抗原，通過向該通道的測試區帶3中放入線或斑點來進行，該線或斑點包含針對放置在標記區帶4中的待測標記抗體的特異性抗體。
該測試裝置的第二通道用作對照通道，以測試該測試裝置的功能性。向標記點中加入非特異性偶聯物，並向測試區帶中加入抗小鼠抗體。
按實施例1所述，封閉通道1的反應點並乾燥測試裝置。向各個測試通道的分支點的標記點4中加入每種檢測的特徵性標記。按上文所述進行乾燥。
將病人的樣品(稀釋的糞便樣品)施加到測試裝置的樣品施加位點5，由於毛細作用，樣品從此處擴散並首先移動到偶聯物點中，並在待測的標記點4中與微粒標記反應，隨後繼續向測試區帶3移動，如果樣品中含有可分析的病毒抗原的話，在測試區帶3處將發生反應。以與上述實施例類似的方式檢測出陽性結果。
權利要求
1.一種基於免疫擴散的測試裝置，其包含多孔載體材料，其中以區帶或斑點的形式施加了特異結合試劑(免疫試劑)；可被樣品移動的可檢測的標記，其與第二種特異結合試劑相偶聯並且被單獨或預先施加到所述多孔載體中；以及任選提供有過濾器的樣品施加位點，其特徵在於，它包含所述多孔載體材料中的通道網絡，該通道網絡是通過用雷射處理蝕刻多孔載體材料而形成的，該通道網絡包含兩個或更多個通道(1)，由處理過的區域(2)隔開，固定於其中的一種或多種特異結合試劑(3)，置於所述通道中鄰近樣品施加位點(5)或位於樣品施加位點(5)本身裡的任選的標記點(4)，樣品施加位點(5)放置的方式使得所述樣品能夠均勻分布到各個通道中。
2.權利要求1的測試裝置，其特徵在於，它能夠基於同時或平行進行的對一種或多種產生症候群的試劑或分析物的識別進行診斷。
3.權利要求1的測試裝置，其特徵在於，它用於同時識別多於一種產生過敏的試劑，心肌梗塞標記物，產生性病的試劑，血液篩選分析物，產生呼吸系統感染的試劑，其它產生感染性疾病的試劑和/或癌症標記物。
4.權利要求1的測試裝置，其特徵在於，所述多孔載體是硝酸纖維素。
5.權利要求1的測試裝置，其特徵在於，所述特異結合試劑是抗體、抗體片段、重組抗體、重組抗體片段、抗原、凝集素、受體和/或配體。
6.權利要求1的測試裝置，其特徵在於，所述被標記的試劑是乳膠、金、金屬或染色劑微粒或螢光物質。
7.一種生產權利要求1的測試裝置的方法，其中所述特異識別免疫試劑被固定在多孔材料中，用使該多孔材料變為惰性的物質處理該多孔材料，並且其中樣品施加位點任選提供有過濾器和可檢測的標記，該可檢測的標記上結合有特異結合試劑，其特徵在於，(a)通過用雷射蝕刻多孔材料在所述多孔材料上形成具有預期形狀和尺寸的通道網絡，該網絡包含兩個或更多個通道(1)以及處理過的區域(2)；(b)一種或多種識別特異結合試劑作為區帶或斑點(3)被固定在各個通道(1)中。
8.權利要求7的方法，其特徵在於，使所述多孔材料變為惰性的物質是混合物，其包含天然或合成聚合物，例如白蛋白和酪蛋白或PEG(聚乙二醇)和PVA(聚乙烯醇)，非離子去垢劑例如己烷磺酸和TRITON-X-100、BRIJ和防腐劑，例如糖，如蔗糖和海藻糖，或它們的衍生物。
9.權利要求7的方法，其特徵在於，在施加所述試劑後，所述測試裝置被乾燥到相對溼度不超過8％並且被密封包裝。
10.權利要求1的測試裝置在同時或平行進行用於診斷所尋找的疾病和/或症候群的多個檢測中的用途，其特徵在於，所述樣品被施加到該測試裝置的施加位點(5)，其含有可被可分析樣品移動的標記以及與標記偶聯的第二種特異結合試劑，所述樣品和試劑從該位點均勻移動到該通過雷射處理形成的通道網絡的通道中，在此處它們與所述特異結合試劑在其固定點(3)處反應或不反應，陽性或陰性結果可從此處直接讀出。
11.權利要求1的測試裝置在同時或平行進行用於識別所尋找的疾病和/或症候群的多個檢測中的用途，其特徵在於，所述樣品被施加到該測試裝置的施加位點(5)，所述樣品從該位點移動到通道中，在此處其與可被所述樣品移動的標記和與標記結合的第二種特異結合試劑混合併發生反應，此後，所述樣品和試劑均勻移動到該通過雷射處理形成的通道網絡的通道中，在此處它們與所述特異結合試劑在其固定點(3)處反應或不反應，陽性或陰性結果可從此處直接讀出。
12.權利要求1的測試裝置在同時或平行進行用於識別所尋找的疾病和/或症候群的多個檢測中的用途，其特徵在於，所述樣品與單獨的標記和與標記偶聯的第二種特異結合試劑混合，並且該混合物被施加到該測試裝置的施加位點(5)，所述樣品和試劑從該位點均勻移動到該通過雷射處理形成的通道網絡的通道中，在此處它們與所述特異結合試劑在其固定點(3)處反應或不反應，陽性或陰性結果可從此處直接讀出。
全文摘要
本發明的目的是基於免疫擴散和免疫層析的多通道檢測裝置，其使得同時或平行檢測多個分析物成為可能。在該檢測裝置中，有可能對識別變應原、心肌梗死標記物、性病分析物、血液篩選分析物、呼吸道疾病產生劑，IgG、IgA和IgM抗體、其他感染性疾病產生劑的標記以及各種癌症標記的不同組合進行分組，該多通道檢測裝置包括多孔載體材料，其上通過雷射蝕刻載體材料以形成含有多個通道的有形圖形已形成通道網絡。在通道中，已固定各種特異結合劑，其使得靶疾病和/或綜合症的診斷成為可能。樣品施加位點任選地提供濾器和任選地含有標記，所述標記可被分析樣品和特異結合劑移動。本發明還公開了該裝置的製備方法及其用途。
文檔編號G01N33/558GK1768267SQ200480008672
公開日2006年5月3日 申請日期2004年3月29日 優先權日2003年3月28日
發明者A·尼斯卡寧, H·拉伊內, M·薩拉梅基 申請人:安尼生物科技公司