一種檢測半胱氨酸的方法

2023-06-21 09:24:56

專利名稱：一種檢測半胱氨酸的方法
技術領域：
本發明涉及巰基胺基酸的檢測方法，具體屬於一種在半水溶液中檢測半胱氨酸的方法，該方法可以區分同型半胱氨酸(Hcy)和半胱氨酸(Cys)。
背景技術：
巰基胺基酸包括同型半胱氨酸(Hcy)和半胱氨酸(Cys)，是人體必需的生物小分子，在生理過程中扮演著重要的角色。血漿中Hcy濃度的升高會導致很多疾病，如心血管疾病，老年痴呆症和骨質疏鬆症等。如果Cys缺乏則會導致兒童的生長減緩，肝臟損傷，肌肉和脂肪損失，皮膚損傷以及體質虛弱等疾病。通常測試巰基的方法有電化學，紫外_可見吸收光譜，高效液相色譜(HPLC)，毛細管電泳以及酶聯免疫等。
螢光技術由於具有儀器操作簡單、靈敏度高等優點，在分析化學和生物醫學領域得到了廣泛的應用。是目前公認的一種非常有前景的高效、便捷的檢測方法。光纖螢光傳感技術是其中最有潛力的一種實用化技術。近年來，人們已經合成了多種化合物並用於巰基胺基酸的光學檢測。然而，由於同型半胱氨酸(Hcy)和半胱氨酸在結構上非常相似(Hcy 在結構上僅比Cys多一個-CH2)，大多數化合物都不能將它們區分開。因此對於各自的檢測存在相互幹擾，所以設計一種能區分Hcy和Cys的螢光化學傳感器有重要的意義。發明內容
本發明的目的在於提供一種檢測半胱氨酸的方法，應用該方法可以快速地將半胱氨酸和同型半胱氨酸區分開。
本發明提供的一種檢測半胱氨酸的方法，包括以下步驟
(I)用 DMF 配製 2*1(Γ3Μ 的 Ir2 (ppy) 4C12 溶液；
(2)用三蒸水配製ρΗ7· O的濃度為O. 2Μ的HEPES緩衝液；
(3)用微量進樣器吸取適量上述Ir2(ppy)4Cl2溶液加到螢光皿中，然後加入10-40 倍的DMF，在螢光儀上檢測，505nm有發射；
(4)將步驟(2)配製的HEPES緩衝液也加入到螢光皿中，使得螢光皿中的DMF與 HEPES的體積比為9:1 I: I ;
(5)取被測溶液，用微量進樣器逐漸加入到上述螢光皿中，邊加樣邊在螢光儀上檢測，隨著溶液的繼續加入，體系的發射峰由505nm紅移至570 576nm，說明溶液中含有半胱氨酸；或用365nm波長的紫外光照射上述螢光皿，體系的發射顏色由綠色變為橘黃色，也說明溶液中含有半胱氨酸。
所述的DMF可用DMSO代替。
本發明檢測半胱氨酸的方法可以應用於臨床、食品和環境中半胱氨酸是否存在的檢測。
本發明的檢測方法對半胱氨酸的選擇性相對於其他胺基酸以及陰離子是專一的， 即其他胺基酸或陰離子的存在不幹擾本方法對半胱氨酸的測定。
本發明作為選擇性檢測半胱氨酸的螢光探針有如下優點首先檢測成本低；其次檢測速度快，幾分鐘即可完成，實現實時檢測；第二，選擇性好，其他的胺基酸包括同型半胱氨酸也沒有幹擾。


圖IA實施例I的螢光發射圖
圖IB實施例I的發射光的顏色變化圖
圖2實施例2的螢光發射圖
圖3實施例3的螢光發射圖
圖4(a)本發明檢測方法對半胱氨酸選擇性識別的螢光信號(與其他胺基酸比較)
圖4(b)本發明檢測方法對半胱氨酸選擇性識別的螢光信號(與陰離子比較)
實施方式
實施例I :利用該方法區分半胱氨酸和同型半胱氨酸
用DMF 配製 2*1(Γ3Μ 的 Ir2 (ppy) 4C12 溶液，並用三蒸水配製 pH 7. O 的 HEPES(0. 2M) 緩衝液；分別取1750 μ I DMF、200l·! I HEPES緩衝液加到兩個螢光池中，用微量進樣器吸取上述的Ir2 (ppy)4Cl2溶液50 μ I加到螢光皿中在螢光儀上檢測，505nm有發射；分別取 4X IO-3的半胱氨酸和同型半胱氨酸溶液100 μ 1，用微量進樣器逐漸加入到上述兩個螢光池中，室溫放置20分鐘後在螢光儀上檢測，加入半胱氨酸的體系發射峰由505nm紅移至 576nm(圖1A)。用手提式紫外燈365nm紫外光照射，發射光的顏色由綠色變為橘黃色，而加入同型半胱氨酸體系的發射光顏色沒有發生明顯的變化(圖1B)。
實施例2
用DMF 配製 2 X ICT3M 的 Ir2 (ppy) 4C12 溶液，並用三蒸水配製 pH 7. O 的 HEPES(O. 2M) 緩衝液；取1750 μ I DMF、200l·! I HEPES緩衝液加到螢光池中，用微量進樣器吸取上述的 Ir2 (ppy)4Cl2溶液50 μ I加到螢光皿中在螢光儀上檢測，505nm有發射；取半胱氨酸溶液，用微量進樣器逐漸加入到上述螢光池中，邊加樣邊在螢光儀上檢測，隨著半胱氨酸的逐漸加入體系的發射峰由505nm紅移至576nm (圖2)。
實施例3
用DMF 配製 2*1(Γ3Μ 的 Ir2 (ppy) 4C12 溶液，並用三蒸水配製 pH 7. O 的 HEPES(0. 2M) 緩衝液；取900μ1 DMFjOOyl HEPES緩衝液加到螢光池中，用微量進樣器吸取上述的 Ir2 (ppy)4Cl2溶液50 μ I加到螢光皿中在螢光儀上檢測，505nm有發射；取半胱氨酸溶液，用微量進樣器逐漸加入到上述螢光池中，邊加樣邊在螢光儀上檢測，隨著半胱氨酸的逐漸加入體系的發射峰由505nm紅移至570nm (圖3)。
實施例4:本發明檢測方法對半胱氨酸的選擇性識別
用DMF 配製 2 X ICT3M 的 Ir2 (ppy) 4C12 溶液，並用三蒸水配製 pH 7. O 的 HEPES(O. 2M) 緩衝液；取1750 μ I DMF、200l·! I HEPES緩衝液加到螢光池中，用微量進樣器吸取上述的 Ir2(ppy)4Cl2溶液50 μ I加到螢光皿中，然後加入摩爾數10倍於實施例2中半胱氨酸量的苯丙氨酸，在螢光光譜儀上檢測，計算體系在576nm與511nm處的螢光強度比值(1576/1511 )。 按照同樣方法，將苯丙氨酸分別用等量的丙氨酸、蛋氨酸、甘氨酸、色氨酸、天門冬醯胺、蘇氨酸、異亮氨酸、穀氨醯胺、賴氨酸、絲氨酸、精氨酸、羥脯氨酸、纈氨酸、亮氨酸、穀氨酸、天冬氨酸、還原型穀胱甘肽、同型半胱氨酸代替，結果表明加入半胱氨酸體系的比值是加入其他胺基酸體系的10倍，是加入還原型穀胱甘肽體系的5倍。說明本發明檢測方法對半胱氨酸有較好的選擇性(見圖4 (a))。
按照同樣方法，在上述比色皿中，將苯丙氨酸分別用常見陰離子如碳酸根、磷酸根、磷酸氫二根、磷酸二氫根、硫酸根、氯離子以及溴離子代替，在螢光光譜儀上檢測，計算體系在576nm與511nm處的螢光強度比值(1576/1511 )。結果表明，加入半胱氨酸體系的螢光強度是加入其他陰離子體系的大約7倍，進一步說明本發明檢測方法對半胱氨酸有較好的選擇性(見圖4 (b))。
權利要求
1.一種可以在半水溶液中檢測半胱氨酸的方法。其特徵在於，包括以下檢測步驟(1)用DMF 配製 2*10_3M 的 Ir2 (ppy) 4C12 溶液； (2)用三蒸水配製ρΗ7·O的濃度為O. 2Μ的HEPES緩衝液； (3)用微量進樣器吸取適量上述Ir2(PPy)4Cl2溶液加到螢光皿中，然後加入10-40倍的DMF ； (4)將步驟(2)配製的HEPES緩衝液也加入到螢光皿中，使得螢光皿中的DMF與HEPES的體積比為9:1 1:1 ; (5)取被測溶液，用微量進樣器逐漸加入到上述螢光皿中，邊加樣邊在螢光儀上檢測，隨著溶液的繼續加入，體系的發射峰由505nm紅移至570 576nm，說明溶液中含有半胱氨酸。
2.如權利要求I所述的一種可以在半水溶液中檢測半胱氨酸的方法，其特徵在於，步驟(5)取被測溶液，用微量進樣器逐漸加入到上述螢光皿中，用365nm波長的紫外光照射上述螢光皿，體系的發射顏色由綠色變為橘黃色，說明溶液中含有半胱氨酸。
3.如權利要求I所述的一種可以在半水溶液中檢測半胱氨酸的方法。其特徵在於，所述的DMF用DMSO代替。
全文摘要
本發明提供了一種可以在半水溶液中檢測半胱氨酸的方法。重要的是應用此方法可以將半胱氨酸與同型半胱氨酸區分開。該方法基於配合物二氯四[2-(2-吡啶基)苯基]二銥(III)[Ir2(ppy)4Cl2]，在DMF或DMSO的半水溶液中，利用螢光方法直接檢測半胱氨酸。測定過程簡單方便，不受溶液中其他胺基酸包括同型半胱氨酸以及陰離子的幹擾，可以應用於半胱氨酸是否存在的檢測。
文檔編號G01N21/64GK102928392SQ201210420558
公開日2013年2月13日 申請日期2012年10月29日 優先權日2012年10月29日
發明者陳繪麗, 李曉凱 申請人:山西大學