增進骨生長與抑制骨再吸收的方法
2023-06-21 04:32:01
專利名稱：增進骨生長與抑制骨再吸收的方法
相關申請本申請要求在2003年9月3日提出的美國臨時申請號60/499,696的優先權，其內容結合於此作為參考。
背景本發明涉及增進骨生長與抑制骨再吸收的方法，更特別地，本發明涉及以稠合吡唑基化合物增進骨生長與抑制骨再吸收的方法。
現有技術骨胳是一種複雜組織，其持續性地進行更新與修復，即是所謂的「骨重塑作用(bone remodeling)」。負責骨重塑作用的兩種主要細胞種類為破骨細胞以及成骨細胞，前者再吸收骨，後者形成新骨。骨重塑作用是由數種全身性激素(例如副甲狀腺激素，1，25-二羥基維生素D3，性激素及降鈣素)，以及局部因子(例如一氧化氮，前列腺素，生長因子及細胞因子)所調節。當骨的再吸收與形成不協調，且骨分解超過骨重建，就會造成骨質疏鬆症。骨質疏鬆症也可能由其它病症造成，例如，激素失調，疾病，或藥物作用(例如皮質類固醇或抗癲癇劑)。
能調節骨重塑過程的化合物，不論是抑制骨再吸收或刺激骨形成，都具有增進骨生長的潛能，而可以用於治療骨質疏鬆症。
發明內容
本發明基於以下出乎意料的發現一種稠合吡唑基化合物可抑制骨再吸收和增進骨生長。
本發明的一方面涉及一種增進骨生長或抑制骨再吸收的方法。上述方法包括向需要其的受試者施用有效量的下式的稠合吡唑基化合物
其中A為H，R，或 (之後稱為「(CH2)nAr3(R5)(R6)」)；Ar1、Ar2、Ar3各自獨立地為苯基，噻吩基，呋喃基，或吡咯基；R1，R2，R3，R4，R5，及R6各自獨立地為H，滷素，R，C(O)OH，C(O)OR，C(O)SH，C(O)SR，C(O)NH2，C(O)NHR，C(O)NRR』，ROH，ROR』，RSH，RSR』，NHR，NRR』，RNHR』，或RNR』R」；或R1與R2一起，R3與R4一起，或R5與R6一起為ORO；其中R，R』，R」各自獨立地為C1～C6烷基；以及n為1、2、或3。
參考上式，式(I)化合物的一個子集其特徵在於A是(CH2)nAr3(R5)(R6)。在一個實施方案中，Ar1為苯基，且R1與R2分別在苯基的4與5位上取代。在另一個實施方案中，Ar2為5』-呋喃基，且R3與R4之一在5』-呋喃基的2位上取代。在還有另外的實施方案中，Ar3為苯基且n為1。
上述化合物的另一子集其特徵在於A為H。在一個實施方案中，Ar1為苯基，且R1與R2分別在苯基的4與5位上取代。在另一個實施方案中，Ar2為5』-呋喃基，且R3與R4之一在5』-呋喃基的2位上取代。
上述化合物的另一子集其特徵在於Ar1為苯基或Ar2為5』-呋喃基。
術語「烷基」是指直鏈或支鏈烴，包括1-10個碳原子。烷基的實例包括但不限於，甲基，亞甲基，乙基，亞乙基，正丙基，異丙基，正丁基，異丁基，及叔丁基。烷基可被任選地取代。取代基的實例包括但不限於，滷素，羥基，氨基，氰基，硝基，巰基，烷氧羰基，醯氨基，羧基(carboxy)，烷磺醯基，烷羰基，脲基，氨基甲醯基，羧基(carboxyl)，硫脲基，硫代氰酸根合，亞磺醯氨基，鏈烯基，炔基，烷氧基，芳基，雜芳基，環基，和雜環基，其中鏈烯基，炔基，烷氧基，芳基，雜芳基，環基，及雜環基可以再被取代。
上述稠合吡唑基化合物包括，如果適用，其鹽及其前藥。其鹽，例如，可由稠合吡唑基化合物上帶負電的取代基(如羧酸鹽)與陽離子形成。適當的陽離子包括但不限於，鈉離子，鉀離子，鎂離子，鈣離子，及銨離子如四甲基銨離子。類似地，帶正電子的取代基(如氨基)可與帶負電的抗衡離子形成鹽。適當的抗衡離子包括但不限於，氯化物，溴化物，碘化物，硫酸鹽，硝酸鹽，磷酸鹽，或醋酸鹽。前藥的實例包括酯和其它藥學上可接受的衍生物，當將其施用於受試者時，可提供上述稠合吡唑基化合物。
本發明的另一方面涉及一種治療骨質疏鬆症的方法。上述方法包括向需要其的受試者施用有效量的上述稠合吡唑基化合物。
以下所列為可用於實施本發明方法的稠合吡唑化合物的實例 吲唑1本發明範圍也包括上述化合物在製備增進骨生長，抑制骨再吸收或治療骨質疏鬆症的藥物中的應用。
本發明的多種實施方案將詳述於以下。本發明的其它特徵、目的，及優點將經由以下的詳細說明與權利要求中而更為明顯。
發明詳述用於實施本發明方法的稠合吡唑基化合物可以由本領域普通技術人員所熟知的方法製備(參見例如美國專利第5,574,168號)。它們包括以下合成路徑首先將芳香基酮經由偶合芳香羰基氯化物與另一芳族化合物而製備。其中任一芳族化合物為任選地單或多取代。上述酮接著與芳基烷基肼反應，其中的芳基亦為任選地單或多取代，以形成含有三個芳基的腙。上述腙基團經由鏈烯烴接頭轉化為稠合吡唑核心化合物，另一芳香基稠合至吡唑核心的4-C與5-C，且第三芳基直接連接到吡唑核心的3-C。稠合吡唑基化合物的衍生物可經由修飾芳基的任何取代基而得到。
用於上述合成路徑的化合物包括，例如溶劑，反應劑，催化劑，保護基及去保護基反應劑。上述方法可附加地包括其它步驟，不論是在上述特定步驟之前或之後，以增加或除去適當保護基團，而得以完成稠合吡唑化合物的合成。此外，也可以採用替換順序進行各種合成步驟，以得到所需化合物。用於合成可應用的稠合吡唑化合物的合成化學轉化與保護基團方法學(保護與去保護)是本領域所熟知的，並且包括，例如R.Larock，Comprehensive Organic Transformations，VCH Publishers(1989)；T.W.Greene及P.G.M.Wuts，Protective Groups in Organic Synthesis，2d.Ed.JohnWiley and Sons(1991)；L.Fieser及M.Fieser，Fieser and Fieser’s Reagentsfor Organic Synthesis，John Wiley and Sons(1995)；及L.Paquette，ed.，Encyclopedia of Reagents for Organic Synthesis，John Wiley and Sons(1995)及其後續版本所敘。
如此合成的稠合吡唑化合物可以經由例如柱層析法，高壓液相層析，或再結晶法進一步純化。
本發明的一方面提供一種增進骨生長或抑制骨再吸收的方法。因此，上述方法包括但不限於，治療骨質疏鬆症，骨折，身材矮小症，關節固定失敗，軟骨發育障礙(dyschondroplasia)，軟骨發育不全(achondroplasia)，或先天性假關節。「骨質疏鬆症」的實例包括但不限於，經絕期後骨質疏鬆症，老年骨質疏鬆症，原發性骨質疏鬆症，皮質類固醇引發的骨質疏鬆症，腎衰竭，高副甲狀腺機能症，維生素D缺乏相關的骨質疏鬆症，以及長期不動(immobilization)。「骨折」的實例包括但不限於，不癒合，延遲癒合，以及病理性骨折。上述方法包括向需要其的受試者施用有效量的一種或多種稠合吡唑化合物以及藥用載體。如此處所述，術語「治療」是指治癒，恢復，減輕，緩和，改變，補救，改善，或預防與不適當骨生長相關的疾病，如骨質疏鬆症。「有效量」定義為稠合吡唑基化合物的量，在施用於所需受試者後，其足以賦予該受試者治療效果。有效量可以改變，如本領域技術人員所認可，依照給藥途徑，賦形劑的使用，及可能共同使用於增進骨生長，或治療骨質疏鬆症的其它藥劑而異。
為實施本發明的方法，可以將含有稠合吡唑基化合物與藥用載體的組合物經由口服，非胃腸道途徑，吸入式噴霧，或經由植入式儲囊而施用。術語「非胃腸道途徑」，如此處所述，包括皮下，皮內，靜脈內，肌內，關節內，動脈內，滑液內，胸骨內，鞘內，傷口內及顱內注射，或輸注技術。
口服給藥的組合物可以為任何口服可接受的劑型，其包括但不限於，膠囊，片劑，乳劑及水混懸劑，分散劑及溶液。口服使用的片劑中，常用的載體包括乳糖與玉米澱粉。潤滑劑，如硬脂酸鎂，也典型地添加。口服使用的膠囊中，有用的稀釋劑包括乳糖與幹玉米澱粉。當以水混懸劑或分散劑形式口服給藥時，活性成分可以懸浮於或溶解於油相，並結合乳化或懸浮劑。若有需要，某些甜味劑，調味劑，或著色劑亦可添加。吸入式組合物可以依藥學配方技術領域所熟知的技術製備，而可製備為鹽水溶液，採用苯甲基醇或其它適當防腐劑，增強生物利用度的吸收促進劑，甲醛，和/或其它本領域所熟知的溶解或分散劑。
無菌注射組合物，例如，無菌注射水溶性或油狀混懸劑，可以依照本領域所熟知的技術，採用適當分散或溼潤劑(如吐溫80)以及懸浮劑配製。無菌注射製劑也可以為無菌注射液或混懸劑，其在無毒、非胃腸道可接受稀釋劑或溶劑中，例如，溶於1，3-丁二醇的溶液。在可接受載體與溶劑中，可採用甘露醇，水，林格氏液及等滲氯化鈉溶液。此外，無菌、固定油也常規用作溶劑或混懸介質(如合成單或雙甘油脂)。脂肪酸，如油酸及其甘油酯衍生物用於注射劑的製備，其為天然藥用油，如橄欖油或蓖麻油，特別是其多氧乙烷化物。這些油溶液或混懸劑也可以包含長鏈醇稀釋劑或分散劑，或羧酸甲基纖維素或類似的分散劑。
藥學組合物的載體必須是「可接受的」，也就是與製劑中的活性成分可相容(優選地，能夠使它穩定)，且不會對治療的受試者有害。例如，加溶劑如環糊精，可與稠合吡唑基化合物形成特異性的，更可溶性的複合物，或一種或多種加溶劑，可以用作藥物賦形劑以傳遞稠合吡唑基化合物。其它載體的實例包括膠狀二氧化矽，硬脂酸鎂，纖維素，十二烷基硫酸鈉，及DC黃色10號。
適當的體外試驗可以用於預先評估稠合吡唑基化合物增加骨小結形成的能力。體內篩選也可以經由本領域所熟知的以下步驟進行。參考以下具體實施例。
不需詳加闡述，相信上述說明已提供本發明實施的適當說明。因此，以下特定實施例僅是用於說明本發明，並非用以限制限定本發明的範圍。所有此處所引用的出版物，包括專利，皆以其完整內容併入本案作為參考。
化學合成首先製備硼氫化鈣，其經由於無水THF(20mL)中攪拌無水氯化鈣(88.8mg，0.8mmole)與硼氫化鈉(60mg，1.6mmole)4小時。將30mL含有88.0mg的1-苄基-3-(5』-甲氧羰基-2』-呋喃基)-吲唑(0.27mmole)的THF溶液，於30±2℃滴入上述硼氫化鈣溶液。將混合物於回流下加熱6小時，冷卻，淬滅至碎冰中，置於減壓狀態以除去THF，並過濾以得到固體產物。上述固體再以二氯甲烷萃取。將上述萃取物濃縮至50mL，加入石油醚後沉澱出固體。收集此沉澱物並以柱層析(矽膠-苯)純化以得到70.0mg的1-苄基-3-(5』-羥甲基-2』-呋喃基)-吲唑，產率87％。以下稱此化合物為「吲唑1」。
熔點108-109℃MS(％)，m/z304(M+)IR(KBr)λmax3350cm-1(-OH)1H-NMR(DMSO-d6，200MHz)δ4.51(2H，d，J＝5.5Hz，-CH2O-)，5.31(1H，t，J＝5.5Hz，-OH)，5.70(2H，s，＝NCH2-)，6.48(1H，d，J＝3.4Hz，H-4』)，6.97(1H，d，J＝3.4Hz，H-3』)，7.21-7.31(6H，m，H-5，苯基)，7.45(1H，t，J＝8.2Hz，H-6)，7.75(1H，dd，J＝8.2，1.8Hz，H-7)，8.12(1H，dd，J＝8.2.1.0Hz.C4-H)。
生物試驗方法原代破骨細胞培養由18日齡胎兒Sprague-Dawley(簡稱SD)種大鼠的顱頂製備原代破骨細胞，依照以下方法採用腹膜內注射三氯乙醛(200mg/kg)麻醉懷孕的大鼠。接著以無菌操作剖開大鼠胎兒的顱頂。於解剖顯微鏡下除去軟組織。將顱頂分成小碎片並以0.1％膠原蛋白酶(SigmaChemical，St.Louis，MO)溶液於37℃下處理10分鐘。收集經兩次20分鐘連續膠原蛋白酶消化處理而由顱頂釋出的細胞，並經過70μm尼龍過濾器(Falcon，BD BioSciences，San Jose，CA)過濾。再使細胞於塑料細胞培養皿，在95∶5的空氣-二氧化碳下，補加20mM HEPES與10％熱失活的FCS，2mM-穀氨醯胺，青黴素(100U/ml)與鏈黴素(100μg/ml)(將pH調整至7.6)的度別克氏修正過的伊葛氏培養基(Dulbecco’s modified Eagle’s medium，簡稱DMEM)(Gibco，Grand Island，NY)培養。一周換兩次細胞培養基。以形態學與鹼性磷酸酶(alkaline phosphatase，簡稱ALP)的表達確認破骨細胞。為檢驗破骨細胞的成熟度，將細胞於含有抗壞血酸(50μg/ml)(SigmaChemical，St.Louis，MO)與β-甘油磷酸(10mM)(Sigma Chemical，St.Louis，MO)的生長培養液培養14天，並每3天換一次培養基。
鹼性磷酸酶活性的試驗將細胞培養於存有或不存在吲唑1的6孔平板中，再於1ml的0.2％Nonidet P-40中收集，使細胞懸浮液經超聲波處理破碎。於1500g離心5分鐘後，以Lowry等(1954)J Biol Chem 20719-37的方法測量上清液中的ALP活性。
von Kossa染色將破骨細胞培養於含有50μg/ml的維生素C與10mMβ-甘油磷酸的DMEM中2周，且每3天換一次培養基。為檢驗骨小結的形成，將細胞以4％多聚甲醛固定10分鐘，水清洗後，以1％硝酸銀染色，置於紫外光下30分鐘，再以水清洗後，才以5％硫代硫酸鈉處理2分鐘。將細胞以水清洗兩次，並以1％Safranin-O對染以便顯現基質。於光學顯微鏡下計數每孔的骨小結形成的數目。經由測量培養的破骨細胞中4-羥脯氨酸含量確認膠原蛋白的合成。將細胞培養於含有50μg/ml的維生素C與10mM β-甘油磷酸的DMEM中2周後，再於116℃下以6N HCl水解16小時。冷凍乾燥並於蒸餾水重建溶胞產物後，於550nm的分光光度測定法測定4-羥脯氨酸的含量，如Berg(1982)的Meth Enzymol.82372-398所述。
細胞增殖試驗將破骨細胞(2×104細胞/孔)接種於24-孔平板(Costar，Cambridge，MA)。細胞在加入吲唑1前先培養於無血清培養基中24小時。於吲唑1下溫育24小時後，加入BrdU成為10μM再溫育24小時。BrdU的摻入是依照酶聯免疫吸附測定化學發光檢測試劑盒(Roche MolecularBiochemicals)的步驟進行測試，並採用發光計數器(TopCount；PackardInstruments，Meriden，CT)。每秒計數量直接與DNA合成量相關，由此而推知增生的細胞量。
破骨細胞生成(Osteoclastogenesis)骨髓細胞的製備是經由取得6-8周齡SD大鼠的股骨，並以含有20mM HEPES與10％熱失活的FCS，2mM-穀氨醯胺，青黴素(100U/ml)及鏈黴素(100μg/ml)的DMEM衝洗骨髓腔。24小時後，收集未粘附的細胞(造血細胞)作為破骨細胞前體。將細胞接種於24孔平板成為1×106細胞/孔(0.5ml)，並同時存在人類重組可溶性RANKL(50ng/ml，Peprotech EC Ltd.，London，United Kingdom)以及鼠類M-CSF(20ng/ml，Genzyme，Cambridge，MA)。每3天換一次培養基。在8-10天後，以抗酒石酸鹽酸磷酸酶(tartrate-resistant acid phosphatase，簡稱TRAP)試驗(Kotake等人，1999)確認破骨細胞形成。簡言的，附著的細胞以溶於磷酸鹽緩衝鹽水的10％甲醛固定3分鐘。在以乙醇/丙酮(50∶50v/v)處理1分鐘後，使細胞表面風乾並於室溫下溫育於含有0.01％萘酚AS-MX磷酸鹽(Sigma)與0.03％快紅紫LB鹽(fast red violet LB salt)(Sigma)的醋酸緩衝液(0.1M醋酸鈉，pH5.0)，50mM酒石酸鈉存在下10分鐘。每孔的類破骨細胞TRAP陽性細胞是經由計算TRAP陽性與含有超過三個核的多核細胞數目而評分。
破骨細胞的骨再吸收試驗破骨細胞前體由如上述的大鼠長骨分離。將細胞重新懸浮於完全DMEM培養基中，並接種至以磷酸鈣磷灰石包被的24孔平板，OAAS(Oscotec，OCT USA Inc.)，細胞濃度為1×106細胞/0.5ml/孔。細胞培養於M-CSF(20ng/ml)加sRANKL(50ng/ml)存在下5天。在M-CSF與sRANKL不存在下另三天每天注入吲唑1。於第8天終止培養，孔中留下的細胞以1N NaOH裂解。採用倒置顯微鏡(200×)獲得每孔5個影像，並採用影像分析儀測量吸收區域。
局部注射採用雄性SD大鼠，體重介於70-88gm。以戊巴比妥麻醉大鼠的兩肢，由後側方埋入套管(22G)至近端脛骨幹骨後端。套管的外端在皮下組織。吲唑1經皮注射，由套管注入近端脛骨一天一次，連續一周。同樣濃度的生理鹽水稀釋過的DMSO也注入右側作為對照。在第14天，犧牲大鼠並以10％甲醛於4℃下固定48小時。
骨組織形態學分析在甲醛固定脛股完成後，將脛骨於0.5N鹽酸中去鈣，以濃度升高系列乙醇溶液與丙酮進行脫水，並包埋於石臘中。系列切片(5μm)是於長軸方向切割，並以玫爾氏蘇木精-伊紅溶液(Yang等(1993)Calcif Tissue Int 5257-61)染色。生長盤與近端脛股的影像是採用照相微圖數位化插入系統(PhotoMicroGraphic Digitize integrate System，簡稱MGDS；Total-Integra Technology Co.，Ltd.，臺北，臺灣)。在整個次級松質上進行骨體積測量，其位於初級松質下並且特徵在於較大的小梁。骨體積是採用影像分析軟體計算。所有測量皆以單盲方式進行。
卵巢切除術與坐骨神經切除於成年雌性與雄性大鼠(三月齡)分別進行卵巢切除術與坐骨神經切除。手術後，每天對大鼠注射吲唑1(腹腔注射，1mg/kg)或載體共4周。最後注射的後一天，犧牲大鼠並移除其脛骨與股骨。
脛骨與股骨的製備在實驗結束時，以斷頭術犧牲大鼠。移除脛骨，清洗軟組織，並以精確卡尺(±0.05mm)量測脛骨長度，如Weinreb等(1991)J Bone Miner Res 6725-731所述。脛骨以10％甲醛於4℃下固定48小時，以便進行骨組織形態學分析。移除脛骨與股骨的部分並保存於-20℃以便進行礦物質分析。
骨礦物質密度(bone mineral density，簡稱BMD)與含量(簡稱BMC)的分析脛骨與股骨的BMD與BMC是以雙能量X射線吸收儀(DEXA，XR-26；Norland，Fort Atkinson，WI)測量。採用適用於小個體的測量的形式。0.7％的變異係數是由每日測量腰部人體模型(phantom)的BMD，超過1年所計算得(Yang等人(1998)Calcif Tissue Int 6386-90)。進行骨礦物質分析前，將脛骨與股骨融解至室溫。掃描整個脛骨與股骨，並以吸收儀測量BMD與BMC。
生物力學三點彎曲試驗骨組織的力學特性是經由三點彎曲試驗測量，採用MTS-858試驗機(MTS System Inc.，Minneapolis，MN)。兩支持點的跨度為20毫米且變形率為1mm/分鐘。負重/變形曲線是由Team 490軟體(第4.10版，Nicolet Instrument Technologies Inc.，Madison，WI)獲得。採用SigmaPlot 6.0軟體(SPSS Inc.，Chicago，IL)以計算骨樣品的外在材料特性，包括最大負重，極限負重，最大負重的能量，極限負重的能量，及線性強直(Linearstiffness)。最大負重的能量與極限負重的能量是由負重/變形曲線下區域計算。強直是由負重/變形曲線的線性部分的斜率計算。惰性剖面距是假設剖面為橢圓形下計算(Turner等，The effect of fluoridated water on bone strength.Orthop Res(1992)10581-587)。
最大壓力，極限壓力，及彈性係數(楊氏係數)是採用Turner等人Basicbiomechanical measurements of bonea tutorial，Bone(1993)14595-608所述的方法計算。
結果骨生長將雄性年輕大鼠(SD)，體重介於70-90gm，分為六組。每組大鼠平均體重為73.9±1.1gm。將吲唑1溶解於DMSO並以生理鹽水稀釋至最終濃度為10μM。六組之一為對照組，而其它組分為僅植入套管針，採用套管針注射載體(第1天，一次)，注射吲唑1(第1天，一次)，採用套管針注射載體(第1-7天，每天)，以及注射吲唑1(第1-7天，每天)。在14天後犧牲大鼠，僅植入套管針(22G)或採用套管針注射載體並不影響骨體積。然而，大鼠注射吲唑1(0.1nmole)7天再餵飼7天後會顯著地增加次級骨松質的體積。局部注射吲唑17天後，次級骨松質的骨小梁增加至90％。脛骨長度並未顯著地受局部注射吲唑1影響(脛骨長度對照組為3.31±0.01cm，而吲唑1處理組為3.32±0.02cm，n＝9)。
雄性年輕大鼠僅注射吲唑1，或注射吲唑1與NG-硝基-L-精氨酸-甲酯(L-NAME，0.6nmole/天)，NO合成酶(NOS)抑制劑。對照於僅注射吲唑1者，同時給予吲唑1與L-NAME顯著地減弱吲唑1對於次級骨松質中骨形成的增進作用。
骨損失的預防作用卵巢切除術(簡稱OVX)是於成年雌性大鼠進行(＝28)。在卵巢切除術後，卵巢切除的大鼠(n＝16)中的一組注射吲唑1(腹腔注射，1mg/kg/天)，其它組(n＝12)未注射。15隻未進行卵巢切除術的成年雌性大鼠作為偽處理(sham-operated)對照組，且並未注射吲唑1。卵巢切除術並未顯著地影響脛骨與股骨的長度，但減低兩者的骨礦物質密度(BMD)與含量(BMC)。參見以下的表1。意外地，每日注射吲唑1可保護脛骨與股骨免於發生卵巢切除術誘發BMD與BMC損失。與偽處理組比較，卵巢切除術會造成脛骨次級骨松質的骨小梁的減少。在卵巢切除術後，可在4周觀察到60％的骨體積減少。另一方面，每日注射吲唑1(1mg/kg)連續4周會減低骨小梁損失的情形。骨體積達到偽處理對照組的76％。
表1吲唑1對於骨礦物質密度與含量的效果
吲唑1是於成年雌性大鼠卵巢切除術的次日，經由腹腔注射(1mg/kg)每日施用連續1個月。對照組是施用載體(3％DMSO，0.3ml)。
ap＜0.05對照於偽處理組。
bp＜0.05對照於OVX組。
BMD骨礦物質密度BMC骨礦物質含量數據是以平均值±S.E.表示。
三點彎曲試驗是於股骨進行。對照於偽處理對照組，OVX大鼠顯示股骨顯著較低的極限壓力與楊氏係數。意外地，吲唑1處理OVX大鼠僅稍微降低股骨的極限壓力與楊氏係數。參照以下表2表2股骨的生物力學特性
吲唑1是於成年雌性大鼠卵巢切除術的次日，經由腹腔注射(1mg/kg)每日施用連續4周。對照組是施用載體(3％DMSO，0.3ml)。
*p＜0.05對照於偽處理對照組。
§p＜0.05對照於OVX組。
坐骨神經切除是於成年雄性大鼠進行。結果顯示於以下表3。對照於相對側，在坐骨神經切除1個月後，脛骨與股骨兩者於手術側的長度並未顯著地改變。然而，脛骨與股骨兩者的重量，BMD，BMC及骨體積皆對應於坐骨神經切除而降低。意外地，在坐骨神經切除後立刻每日注射吲唑1(1mg/kg)連續4周會拮抗神經切除造成的骨損失。參見以下表3表3吲唑1防止坐骨神經切除造成的骨損失
吲唑1是於成年雄性大鼠坐骨神經切除的次日，經由腹腔注射(1mg/kg)每日施用連續1個月。對照組是施用載體(3％DMSO，0.3ml)。數據是以平均值±S.E.表示(對照組n＝14，吲唑1處理組n＝10)。
培養破骨細胞的效果測試吲唑1慢性處理對於鹼性磷酸酶活性的效果。依照原代破骨細胞培養的方法培養破骨細胞，並以吲唑1(10μM)處理2周。由ALP染色顯示，上述處理顯著地增加ALP活性。吲唑1增加ALP活性是屬濃度依存性，且可被L-NAME(60μM)，ODQ(20μM)或KT5823(2μM)所拮抗。同時測試吲唑1在體外對於骨小結形成的效果。發現當破骨細胞培養於含有維生素C與β-甘油磷酸的培養基會形成礦物化小結。在電子顯微鏡下，礦物化小結顯示帶有活性破骨細胞，陷入的破骨細胞，胞外膠原蛋白纖維及羥基磷灰石沉積的骨結構，使此系統成為研究體外骨形成的有效模型。意外地，吲唑1處理2周會以濃度依存性形式增加骨小結數目(經von Kossa染色觀察的骨小結)。吲唑1在0.1與1μM的濃度下稍增加破骨細胞的增殖(分別為對照組的119.3％與126.1％)。
纖連蛋白(Fn)在調控破骨細胞的粘附，遷移，及成熟方面扮演重要角色。Fn纖維原生成涉及骨礦物化的過程。測試吲唑1對於培養破骨細胞中Fn纖維原生成的作用。經由單層3～5天的破骨細胞內原性釋放Fn而得到的纖維原生成固定形式是採用免疫細胞化學法研究。第3天破骨細胞與吲唑1(10μM)溫育24小時增加胞外Fn集合。採用流氏細胞儀分析吲唑1對於細胞表面α5與β1整合蛋白的表達的效力。意外地發現吲唑1處理24小時增加細胞表面兩種整合蛋白的表達。另一方面，膠原蛋白合成只有在較高濃度如10μM的吲唑1處理下增加。
對於破骨細胞分化與活化的效果破骨細胞前體培養物於M-CSF(20ng/ml)與sRANKL(50ng/ml)存在下8天會誘發大型成熟、帶有多核的破骨細胞的形成，其特徵為獲得成熟表現型標記，如TRAP。吲唑1意外地以濃度依存性形式抑制破骨細胞的分化。
還測試吲唑1對於破骨細胞再吸收活性的效果。破骨細胞前體培養於M-CSF與sRANKL存在下5天，接著由破骨細胞活性試驗的基質平板的培養基中移除M-CSF與sRANKL。將不同濃度的吲唑1加入培養基再培養3天。相對於對照組，吲唑1會顯著地以濃度依存性方式抑制破骨細胞再吸收活性。
其它實施例本說明書所公開的所有特徵可組合為任何組合。本說明書所公開的每一特徵可以由用作相同，等同，或類似目的的替代性特徵所替換。因此，除非特別指出，此處所公開的每一特徵僅為等同或類似特徵的通用系列中的一例。
由上述說明書，本領域技術人員可容易確認本發明的基本特徵，且在不背離本發明的精神與範圍內，可對於本發明進行各種改變與修飾，以便更適於各種用途與狀況。例如，構造上類似於稠合吡唑化合物的化合物亦可以用於實施本發明。因此，其它實施方案亦包括於本發明的權利要求利範圍內。
權利要求
1.一種增進骨生長或抑制骨再吸收的方法，其包含向需要其的受試者施用有效量的下式化合物 A為H，R，或Ar1、Ar2、Ar3各自獨立地為苯基，噻吩基，呋喃基，或吡咯基；R1，R2，R3，R4，R5，及R6各自獨立地為H，硝基，滷素，R，OH，OR，C(O)OH，C(O)OR，C(O)SH，C(O)SR，C(O)NH2，C(O)NHR，C(O)NRR』，ROH，ROR』，RSH，RSR』，ROC(O)R』OH，NHR，NRR』，RNHR』，或RNR』R」；或R1與R2一起，R3與R4一起，或R5與R6一起為ORO；其中R，R』，R」各自獨立地為C1～C6烷基；以及n為1、2、或3。
2.權利要求1的方法，其中A為
3.權利要求2的方法，其中Ar1為苯基。
4.權利要求2的方法，其中Ar2為5』-呋喃基。
5.權利要求2的方法，其中Ar3為苯基且n為1。
6.權利要求5的方法，其中Ar1為苯基。
7.權利要求6的方法，其中Ar2為5』-呋喃基。
8.權利要求7的方法，其中R3與R4之一在呋喃基的2位上取代。
9.權利要求8的方法，其中R1，R2，R5與R6各自為H。
10.權利要求9的方法，其中R3與R4之一為H，另一個為CH2NHCH3，CH2OCH3，或COOCH3。
11.權利要求9的方法，其中R3與R4之一為H，另一個為CH2OH。
12.權利要求1的方法，其中Ar1為苯基。
13.權利要求1的方法，其中Ar2為5』-呋喃基。
14.權利要求1的方法，其中A為H。
15.權利要求14的方法，其中Ar1為苯基。
16.權利要求14的方法，其中Ar2為5』-呋喃基。
17.一種治療骨質疏鬆症的方法，其包含向需要其的受試者施用有效量的下式化合物 其中 A為H，R，或Ar1、Ar2、Ar3各自獨立地為苯基，噻吩基，呋喃基，或吡咯基；R1，R2，R3，R4，R5，及R6各自獨立地為H，硝基，滷素，R，OH，OR，C(O)OH，C(O)OR，C(O)SH，C(O)SR，C(O)NH2，C(O)NHR，C(O)NRR』，ROH，ROR』，RSH，RSR』，ROC(O)R』OH，NHR，NRR』，RNHR』，或RNR』R」；或R1與R2一起，R3與R4一起，或R5與R6一起為ORO；其中R，R』，R」各自獨立地為C1～C6的烷基；以及n為1、2、或3。
18.權利要求17的方法，其中A為
19.權利要求18的方法，其中Ar1為苯基。
20.權利要求18的方法，其中Ar2為5』-呋喃基。
21.權利要求18的方法，其中Ar3為苯基且n為1。
22.權利要求21的方法，其中Ar1為苯基。
23.權利要求22的方法，其中Ar2為5』-呋喃基。
24.權利要求23的方法，其中R3與R4之一在呋喃基的2位上取代。
25.權利要求24的方法，其中R1，R2，R5與R6各自為H。
26.權利要求25的方法，其中R3與R4之一為H，另一個為CH2NHCH3，CH2OCH3，或COOCH3。
27.權利要求25的方法，其中R3與R4之一為H，另一個為CH2OH。
28.權利要求17的方法，其中Ar1為苯基。
29.權利要求17的方法，其中Ar2為5』-呋喃基。
30.權利要求17的方法，其中A為H。
31.權利要求30的方法，其中Ar1為苯基。
32.權利要求31的方法，其中Ar2為5』-呋喃基。
全文摘要
本發明特徵為一種增進骨生長或抑制骨再吸收的方法。該方法包括向需要其的受試者施用(Ⅰ)式化合物A為H，R，或(Ⅱ)式，Ar
文檔編號A61K31/416GK1615853SQ20041007516
公開日2005年5月18日 申請日期2004年9月2日 優先權日2003年9月3日
發明者符文美, 湯智昕, 楊榮森, 鄧哲明, 郭盛助, 李芳裕 申請人:永信藥品工業股份有限公司