右旋蛋氨酸在製備防治輻射誘導骨髓抑制藥物中的應用的製作方法

2023-06-21 04:38:46

專利名稱：：右旋蛋氨酸在製備防治輻射誘導骨髓抑制藥物中的應用的製作方法
技術領域：
：本發明涉及胺基酸類藥物在藥學領域中的應用。更具體的說是一種右旋蛋氨酸(D-met)在製備防治輻射、化學毒物誘導骨髓抑制藥物中的應用。
背景技術：
：機體暴露於外界物理化學及體內代謝產生的各種有害因素，如暴露於輻射或某些化學毒物，以及臨床接受放療、化療的患者。造血系統由少量骨髓造血幹細胞及不同發育時期不同系列的造血細胞組成，對各種有害因素非常敏感，受到損傷後會出現不同程度的抑制，表現為外周血白細胞降低、骨髓增殖功能下降甚至發生再生障礙性貧血，對患者的生存質量造成嚴重的危害甚至危及生命。目前臨床上對出現骨髓抑制多是採用加強營養或給與各種生長因子增加造血細胞的增殖。另外一些具有抗氧化損傷作用的化合物或中藥製劑。藥物種類很多，多是聯合應用，單獨評價時療效不很確定，還會有各種副作用的產生，如生長因子類，使用造價也比較昂貴。右旋蛋氨酸(D-methionine,D-met)作為營養成分促進生長已做過多年的研究。蛋氨酸在高蛋白飲食中含量達26mg/g，發酵產品奶酪及酸奶中含量更高，發酵過程中蛋氨酸通過轉氨作用可以從左旋轉化為右旋。右旋蛋氨酸(D-met)不僅作為營養成分還作為治療藥物。如WHO(1997)推薦蛋氨酸作為治療醋氨酚過量使用產生的毒性。2005年FDA批准了口服D-met對輻射導致的口腔黏膜炎的臨床前申請。動物試驗研究結果顯示右旋蛋氨酸(D-met)可以對抗鉑類腫瘤藥物、氨基甙類化合物以及噪聲引起的聽神經損傷，經注射或口服均可達到治療作用。各種動物學和人體試驗結果顯示D-met使用是安全的。如解除醋氨酚毒性的蛋氨酸推薦首次劑量是2.5g，隨後每隔4h給與2.5g，12h內用量可以達10g。D-met保護作用機制可能主要是通過直接或間接的抗氧化作用。1995年，Vogt發現D-met可以可逆性地發生氧化，成為自由基清除劑。作為含石危親核劑的D-met可以保護含石危的酶和蛋白質。D-met可以保護順4白引起的耳蝸超氧化物歧化酶、過氧化物酶、穀胱甘肽還原酶下降。還可以升高細胞內尤其是線粒體內的穀胱甘肽。本發明人在實驗中首次發現右旋蛋氨酸(D-methionine,D-met)在防治骨髓抑制中具有明顯的治療作用。特別是防治輻射誘導骨髓抑制更加明顯，基於上述的發現經過進一步試驗從而完成了本發明。
發明內容本發明要解決的技術問題是尋找能夠保護各種因素誘導骨髓細胞和功能的損傷得到防治與治療的藥物。因此，本發明的一個目的在提供右旋蛋氨酸在製備預防或治療輻射、化學毒物誘導骨髓抑制藥物中的應用。本發明的另一個目的在於提供右旋蛋氨酸與其他營養物質、促進骨髓細胞增殖藥物混合製成組合物或右旋蛋氨酸作為支持藥物與抗腫瘤藥物配合使用，降低化療所帶來的毒副作用。本發明的再一個目的在於提供了右旋蛋氨酸與藥學上可接受的藥用輔料混合製成各種藥物組合物，或製成各類保健品。為解決上述問題，本發明提供如下的技術方案一種右旋蛋氨酸在製備預防輻射、化學毒物誘導骨髓抑制藥物中的應用。一個優選的實施方式是右旋蛋氨酸在製備防治輻射誘導骨髓損傷藥物中的應用。所述的輻射誘導骨髓損傷，包括接受放射治療的腫瘤患者、輻射暴露的工作人員、意外輻射性同位素暴露的人員。另一個優選的實施方式是:右旋蛋氨酸在製備治療化學毒物誘導的骨髓型死亡藥物中的應用。其中所述化學毒物誘導的骨髓抑制，包括接受化學治療的胖瘤患者、抑制骨髓的化學毒物接觸的工作人員及意外暴露的人員。本發明所述的骨髓抑制(骨髓抑制性死亡)，包括外周血白細胞下降、骨髓增生不良或再生障礙性貧血。本發明進一步公開了含有右旋蛋氨酸的藥物組合物，它是將治療有效量的右旋蛋氨酸與藥學上可接受的藥用輔料混合製成組合物。本發明更進一步公開了含有右旋蛋氨酸與其它營養物質、促進骨髓細胞增殖藥物或抗腫瘤藥物的組合物，其中包括臨床各種劑型的治療藥物、預防藥物及保健食品等等。它是將右旋蛋氨酸與其他營養物質、促進骨髓細胞增殖藥物混合製成組合物或右旋蛋氨酸作為支持藥物與抗腫瘤藥物如順鉑、卡鉑、阿黴素、馬裡蘭等配合使用，降低化療所帶來的毒副作用。本發明所述的其他營養物質包括其他的左旋胺基酸營養液、維生素、葡萄糖、脂肪乳、離子等。本發明所述促進骨髓細胞增殖的藥物包括各種中藥製劑如多糖類(枸杞、銀耳、人參多糖等)、生物鹼類(小檗鹼、苦參總鹼等)、鬼甙類(人參皂甙、黃芪甙等)及其他如六味地黃口服液等升白中藥製劑；人粒細胞巨噬細胞集落刺激因子(rHuGM—CSF)、升白欣、肌苷、左旋咪唑、三抹口服液、康力龍等。本發明所述的右旋蛋氨酸與藥學上可接受的藥用輔料混合製成各種藥物組合物，包括片劑、膠嚢劑、顆粒劑、丸劑、滴丸劑、預乳劑、微乳劑、混懸劑、糖漿劑、各種腸溶製劑或注射劑製劑等等。各製劑可以根據常規的工藝製備而成。在製備成藥劑時可以加入藥學上可接受的輔料，所述的藥學上可接受的輔料，包括製劑中常規的稀釋劑、填充劑(如甘露醇、乳糖、聚乙二醇)，粘合劑(澱粉、微晶纖維素)，崩解劑(如羧甲基纖維素、低取代的羥丙基纖維素)，潤滑劑(如滑石粉、硬脂酸鎂)，溼潤劑(如丙二醇、乙醇)，穩定劑(EDTA-2Na、硫代硫酸鈉、焦亞硫酸鈉、亞硫酸鈉、乙醇胺、碳酸氫鈉)等等。當右旋蛋氨酸與藥學上可接受的藥用輔料混合組成藥物組合物時，組合物中含有的活性成份右旋蛋氨酸的量可以根據患者的病情、醫生診斷的情況特定的加以應用，所用右旋蛋氨酸的量或濃度在一個較寬的範圍內調節，通常右旋蛋氨酸的量範圍為組合物的0.5%~90%(重量)。另一優選的範圍為0.5%-70%。再一優選的範圍為3%-50%。本發明所述的右旋蛋氨酸與其他營養物質、促進骨髓細胞增殖藥物混合製成藥物組合物或右旋蛋氨酸作為支持藥物與抗腫瘤藥物配合使用。一般使用常規的技術，與製劑學上可接受的固體或液體載體結合，以及使之任意地與製劑學上可接受的輔助劑和賦形劑結合製備成微粒或微球。固體劑型包括片劑、分散顆粒、膠嚢、緩釋片、緩釋微丸等等。固體載體可以是至少一種物質，其可以充當稀釋劑、香味劑、增溶劑、潤滑劑、懸浮劑、粘合劑、崩解劑以及包裹劑。惰性固體載體包括磷酸鎂、硬脂酸鎂、滑粉糖、乳糖、果膠、丙二醇、聚山梨酯80、糊精、澱粉、明膠、纖維素類物質例如甲基纖維素、微晶纖維素、低熔點石蠟、聚乙二醇、甘露醇、可可脂等。液體劑型包括溶劑、懸浮液例如注射劑、粉針劑等等。本發明對輻射誘導骨髓抑制的試驗內容主要包括以下幾個方面1.D-met對體外照射的骨髓細胞損傷具有保護作用。2.D-raet對接受全身照射的小鼠骨髓細胞功能損傷具有保護作用。3.D-met對輻射所引起骨髓抑制性死亡具有保護作用。4.D-met對機體沒有損傷。下面通過藥效學實驗進一步說明右旋蛋氨酸在預防或治療輻射、化學毒物誘導骨髓抑制作用的藥理實驗情況。一、實驗方法1、骨髓單個核細胞分離無菌取小鼠股骨，含2。/。FCS的Hunks液沖洗骨髓，Ficoll分離，製備單個核細胞懸液，洗滌，計數調整所需的細胞濃度後待用。2、細胞活力測定向96孔板中設定孔加入lOOul的單個核細胞懸液，按設計加入處理藥物100ul，置入37。C二氧化碳孵箱中，培養6h或者18h。取出培養板，放置室溫，加入生物發光試劑cell-titer20ul，振蕩混勻後，轉入黑色測定板，GloMax"發光檢測儀採用Promega自帶檢測程序Cell-titerProtocol進行檢測。檢測結果自動生成Excel數據。3、集落形成(克隆)能力測定分裝甲基纖維素培養基，-20'C保存。用前置於2-8lC冰箱內或室溫下解凍；分離小鼠骨髓細胞，胎盤藍染色計數細胞調整細胞濃度加入M3534,振蕩器充分混勻，靜置待氣泡消失，用3ml注射器連接16#平頭注射器針頭，加入24孔板放入溼盒，置入37。C，5%C02培養箱中培養14天。從培養第5天開始在倒置顯微鏡下進行觀察。低倍觀察集落形成情況，細胞數>30為陽性集落，集落形成率以每105個細胞形成的集落數表示。4、全身照射小鼠生存率測定全身照射後，定期稱重，每日觀察小鼠死亡情況。二、實驗結果與討論1、對造血細胞免疫細胞細胞毒性(對比實驗)分離小鼠骨髓單個核細胞，調整細胞濃度至2xl0Vml。不同濃度(IO-2M~1(T6M)的L-met及D-met分別由RPMI-1640培養基或不含met的改良培養基進行配製。常規RP1640培養基中L-met含量在1(T4M。取細胞懸液lOOul及不同濃度處理藥物加入96孔培養板，孵育18小時後，生物發光法進行細胞活力測定。結果發現利用改良培養基進行實驗，兩種met均未發現明顯的細胞毒性作用。而在常規培養基，10_2、10—l-met對骨髓細胞具有一定的毒性。結果見表l、圖1。表1Met對骨髓細胞活力的影響(RLUxiOOO)濃度改良RPMI-1640RPMI--1640(M)L-MetD-MetLMetD誦Met0263.7±10.3256.2i;17.9382.9±20.2401.1±25.310-2254.9±21.1294.0±14.4279.7±40.9354.8±43.2103287.0±1.1309.0±22.1329.6±43.6393.4±34.4tableseeoriginaldocumentpage82、對腫瘤細胞細胞毒性根據預試驗，選定人肺癌細胞系460,人卵巢癌細胞系ES-2,人白血病細胞HL60A耐藥林及HL60S藥物敏感細胞林接種濃度。接種至96孔培養板，加入不同濃度的L-met和D-met,孵育48h後，測定細胞活力。結果發現，加入L-met和D-met對460細胞生長無明顯影響(圖2A)，其他細胞ES-2、HL60A、HL60S也取得相同結果。利用改良培養基培養的460細胞，與D-met比較，L-met具有促進增殖的作用(圖2B)，在10_3~10、範圍，二者差異有顯著性(P<0.01)。3、對造血免疫細胞體外輻射損傷的保護作用分離骨髓單個核細胞，加入不同濃度的藥物後(10-2M~1(TM)，賻育30min，進行照射。照射後繼續孵育18h,進行細胞活力測定。結果發現照射後骨髓細胞活力1、4、8Gy分別下降52。/。、72%、73%。與放射對照組比較，D-met對細胞活力有一定的保護作用(p<0.05~0.01)。結果見表3，圖3。表3Met對受照射骨髓細胞活力的影響(RLUx1000)tableseeoriginaldocumentpage8檢測不同時間加藥對骨髓造血細胞輻射損傷的保護作用，選擇1格瑞(Gray,Gy)照射劑量,分別在照射前30min,Omin，照射後15min、30min、lh、2h加入10—3D-met，結果發現以提前30min及同時加藥保護效果較好。4.對化學物誘導造血免疫細胞體外損傷的保護作用分離骨髓單個核細胞，按一定濃度接種至培養板，加入不同濃度的右旋蛋氨酸(10、~10、)，孵育30min，分別加入終濃度5uMVP16或60uM喜樹鹼，繼續孵育18h，進行細胞活力測定。結果發現VP16使骨髓細胞細胞活力下降60.5%、喜樹鹼下降35.1%。與抗腫瘤藥組比較，未發現D-met對細胞活力的抑制有保護作用(p>0.05)。表4D-met對抗腫瘤藥物導致的骨髓細胞損傷的保護作用tableseeoriginaldocumentpage9三、體內實驗1、D-met對輻射暴露小鼠骨髓細胞集落形成率的影響小鼠按照射劑量分為0、1、4、6.5Gy四組，9隻/組。照射前分別給予生理鹽水、300mg/kg、1000mg/kg，腹腔注射，每處理組3隻，照射後，取骨髓細胞，接種，進行粒單系集落形成試驗(colony-formingunit—granulocyte-macrophage,CFU—GM)。結果發J見，不同照射劑量對小鼠CFU-GM具有明顯的抑制作用，而D-met對1Gy照射具有明顯的保護作用(P<0.01)。表5D-met對照射小鼠骨髓CFU-GM的影響tableseeoriginaldocumentpage9tableseeoriginaldocumentpage102、D-met對輻射暴露小鼠存活率的影響雄性C57小鼠30隻，分為3組，分別給予生理鹽水、D-Met300mg/kg、D-Met1000mg/kg，腹腔注射，觀察30天。給藥後未發現小鼠異常表現。給藥組體重與對照組無差異。30d取材，稱取腦、肺、胸腺、肝、脾、腎等重要臟器重量，計算臟器指數，各組未見明顯差異。表6D-met:tableseeoriginaldocumentpage10雄性C57小鼠45隻，分為生理鹽水、D-Met300mg/kg、D-Met1000mg/kg3組，給予7.5Gy照射。照射前分別注射生理鹽水、D-Met300mg/kg、D-Met1000mg/kg。照射後每日觀察記錄小鼠死亡情況，定期稱重。計算LD50/30。結果發現D-Met300mg/kg對照射誘導的骨髓型死亡具有一定的保護作用，見圖4。根據體外、體內實驗結果發現，D-met對輻射誘導的骨髓細胞功能損傷具有一定的保護作用，並且對腫瘤細胞沒有促進增殖作用，提示預防性給藥可防治輻射誘導骨髓的損傷。因此，根據上述對腫瘤和骨髓細胞的實驗數據，如果是放療患者，在服用的營養液中將L-met更換為D-met有利於抑制腫瘤保護造血細胞。本發明與現有技術相比所具有的積極效果在於1、D-met是常用的具有促進生長作用的胺基酸，來源廣闊、安全有效、經濟適用，有廣泛的市售來源。2、D-met通過各種途徑給藥均有藥效學作用。3、D-met可以在300-1000mg/kg大劑量下使用沒有明顯的毒副作用。圖1Met對骨髓細胞活力的影響(％);圖2Met對肺癌細胞系460增殖的影響；圖3Met對受照射骨髓細胞活力的影響(％);圖4Met輻射小鼠的保護作用。具體實施例方式下面結合實施例對本發明做進一步的描述。這些實施例僅是對本發明的典型描述，但本發明並不限於此。具體實施例方式為了更充分的解釋本發明的實施，提供下述製劑實施例。這些實施例僅僅是解釋、而不是限制本發明的範圍。實施例1D-metlOOmg,乳糖50mg,微晶纖維素80mg,澱粉50mg，羥甲纖維素40mg，硬脂酸鎂5mg。將活性成分，乳糖、澱粉、微晶纖維素過IOO目篩，並充分混勻，將2%羥甲纖維素水溶液加入到上述混合粉末中混合，過20目篩制軟材，製得溼顆粒於45-55iC乾燥，將羧甲澱粉鈉、硬脂酸鎂加入到上述的乾燥顆粒中壓片。實施例2D-metlOOmg，升白新500mg，加4g(乳糖-微晶纖維5:1)、硬脂酸鎂1°/，用70%乙醇制粒、壓片即得。實施例3D-met10g，甘露醇60g，加1000ml注射用水溶解，補足注射用水至2000ml,加適量活性炭除熱源，0.2um微孔濾膜濾過，灌裝，冷凍乾燥，製得2000支凍乾粉針。規格70mg/支，供靜脈注射用。實施例4D-met10g，加糊精10g、乳糖30g用60%乙醇制粒、乾燥、裝膠嚢，製得1000粒膠嚢劑。規格50mg/粒。實施例5D-met20g,黨參5g、黃芪5g，加入澱粉10g,微粉矽膠5g，硬脂酸鎂1.5g，混勻後裝入膠嚢，製成1000粒膠嚢。實施例6D-met0.3g，肌香0.2g,甘露醇9.4g，阿司巴甜0.2g,焦亞石克酸鈉O.003g，香精O.lg,將主藥與輔料分別過IOO目篩。先將輔料充分混合，然後稱取處方量輔料與主藥充分混合。再加入粘合劑制軟材，20目篩制粒，55匸乾燥，20目篩整粒，篩出細粉，製成顆粒劑，包裝。實施例7D-met10g，生物鹼類小檗鹼15g加入苯甲酸鈉3g，加水至1000ml，靜置，濾過，灌封，殺菌，即得口服液。實施例8D-met10g，三林口服液1000ml,山梨酸鉀3g，加水至1000ml,靜置，濾過，灌封，殺菌，即得保健品口服液。綜上所述，本發明的內容並不局限在的實施例中，相同領域內的有識之士可以在本發明的技術指導思想之內可以輕易提出其他的實施例，但這種實施例都包括在本發明的範圍之內。權利要求1、右旋蛋氨酸在製備防治輻射、化學毒物誘導骨髓抑制藥物中的應用。2、權利要求l所述的應用，其特徵在於右旋蛋氨酸在製備預防輻射誘導骨髓損傷藥物中的應用。3、權利要求l所述的應用，其特徵在於右旋蛋氨酸在製備治療化學毒物誘導的骨髓抑制性死亡藥物中的應用。4、權利要求l所述的應用，其中所述輻射誘導的骨髓抑制，包括接受放射治療的腫瘤患者、輻射暴露的工作人員、意外輻射性同位素暴露的人員。5、權利要求l所述的應用，其中所述化學毒物誘導的骨髓抑制，包括接受化學治療的腫瘤患者、抑制骨髓的化學毒物接觸的工作人員及意外暴露的人員。6、權利要求l-3任一項所述的應用，其特徵在於所述的骨髓抑制，包括外周血白細胞下降、骨髓增生不良或再生障礙性貧血。7、權利要求l-3任一項所述的應用，其特徵在於將治療有效量的右旋蛋氨酸與藥學上可接受的藥用輔料混合製成組合物。8、權利要求l-3任一項所述的應用，其特徵在於將它是將右旋蛋氨酸與其他營養物質、促進骨髓細胞增殖藥物混合製成組合物或將右旋蛋氨酸作為支持藥物與抗腫瘤藥物配合使用。9、權利要求7-8任一項所述的應用，其特徵在於所述的組合物是片劑、膠嚢劑、顆粒劑、丸劑、滴丸劑、預乳劑、混懸劑、糖漿劑、各種腸溶製劑或注射劑。10、權利要求l-3任一項所迷的應用，其特徵在於將有效量的右旋蛋氨酸與藥學上可接受的藥用輔料混合製成保健品。全文摘要本發明公開了右旋蛋氨酸在製備預防或治療輻射、化學毒物誘導骨髓抑制藥物中的應用。通過現代藥理實驗證明，小鼠注射300-1000mg/kg右旋蛋氨酸對化學毒物、輻射誘導的骨髓抑制具有明顯的保護作用，提示預防性給藥可防治化學毒物、輻射誘導骨髓的損傷，並且對腫瘤細胞生長具有抑制作用。通過將右旋蛋氨酸與常規藥用輔料混合，還可製成各種劑型。對於放療患者，營養液中加入一定量的D-met更具有抑制腫瘤細胞增長，保護造血細胞的功能。文檔編號A61K31/185GK101283996SQ20081005346公開日2008年10月15日申請日期2008年6月10日優先權日2008年6月10日發明者吳紅英,孟愛民,常建輝,張俊伶,李德冠,勇王,王月英,褚麗萍,璐路申請人:中國醫學科學院放射醫學研究所