防治草莓採前採後病害及促生長的菌劑、製備方法及應用與流程

2023-06-21 23:10:36 1

本發明屬於微生物
技術領域：
，具體涉及一種防治草莓採前採後病害及促進生長的菌劑、製備方法及其應用。
背景技術：
：草莓屬薔薇科草莓屬，果實顏色鮮豔，果肉酸甜適口，具有很高的營養及經濟價值。但是由於其果皮嬌嫩，極易產生機械傷，易導致採後生理失調、水分損失和病原菌侵染。草莓在採後貯藏或貯運過程中，引起果實腐爛的病原菌大多來源于田間，因此，在田前採取有效措施來降低採後果實表面的帶菌量，對於減少採後腐爛有重要作用。目前降低草莓採前採後腐爛的主要方法是使用化學殺菌劑，而化學殺菌劑會給環境和人類健康造成威脅以及帶來病原菌的抗藥性等問題，從而使其使用範圍越來越受限制，所以尋找其它防治方法勢在必行。技術實現要素：本發明提供的一種防治草莓採前採後病害及促進生長的菌劑，解決了草莓採前容易發生病害，採後容易腐爛的問題。本發明的第一個目的是提供一種防治草莓採前採後病害及促進生長的菌劑，其原料由以下質量百分比的組分組成：85～95％的混合發酵菌液、0.05～0.1％的吐溫80、0.2～0.5％的氯化鈣、0.1～0.5％的矽酸鈉、0.75～2％的殼聚糖，餘量用水補足到100％；所述混合發酵菌液中菌落總數為1.0×106～1.0×1011cfu/ml；所述混合發酵菌液由metschnikowiazizyphicolay-3發酵菌液、伯克氏菌b-1(burkholderiacontaminansb-1)發酵菌液以及腸桿菌b-6-1(enterobactercowaniib-6-1)發酵菌液按照1：1～2：0.5～1的質量比混合而成；其中，所述metschnikowiazizyphicolay-3發酵菌液是由metschnikowiazizyphicolay-3純菌株培養到對數末期得的；所述伯克氏菌b-1發酵菌液是由伯克氏菌b-1純菌株培養到對數末期得到的；所述腸桿菌b-6-1發酵菌液是由腸桿菌b-6-1純菌株培養到對數末期得到的。優選的，所述防治草莓採前採後病害及促進生長的菌劑，其原料由以下質量百分比的組分組成：90％的混合發酵菌液、0.08％的吐溫80、0.3％的氯化鈣、0.3％的矽酸鈉、1％的殼聚糖，餘量用水補足到100％；所述混合發酵菌液中菌落總數為1.0×108cfu/ml；所述混合發酵菌液由metschnikowiazizyphicolay-3發酵菌液、伯克氏菌b-1發酵菌液以及腸桿菌b-6-1發酵菌液按照2：2：1的質量比混合而成。本發明的第二個目的是提供一種防治草莓採前採後病害及促進生長的菌劑的製備方法，包括以下步驟：步驟1，將metschnikowiazizyphicolay-3的純菌株在-80℃取出後於28℃下在pda平板劃線培養48h，然後挑取單菌落於nydb液體培養基中，以200r/min的振蕩速度培養72h，得到metschnikowiazizyphicolay-3的初始發酵菌液；將伯克氏菌b-1的純菌株在-80℃取出後於28℃下在pda平板劃線培養48h後，挑取單菌落於ysp液體培養基中，以200r/min的振蕩速度培養24h，得到伯克氏菌b-1的初始發酵菌液；將腸桿菌b-6-1的純菌株在-80℃取出後於28℃下在pda平板劃線培養48h後，挑取單菌落於lb液體培養基中，以200r/min的振蕩速度培養24h，得到腸桿菌b-6-1的初始發酵菌液；步驟2，將metschnikowiazizyphicolay-3的初始發酵菌液置於nydb液體培養基中，然後在28℃下以200r/min振蕩速度培養至對數末期，得到metschnikowiazizyphicolay-3發酵菌液；將伯克氏菌b-1的初始發酵菌液置於nydb液體培養基中，然後在28℃下以200r/min振蕩速度培養至對數末期，得到伯克氏菌b-1發酵菌液；將腸桿菌b-6-1的初始發酵菌液置於nydb液體培養基中，然後在28℃下以200r/min振蕩速度培養至對數末期，得到腸桿菌b-6-1發酵菌液；步驟3，將步驟2中得到的metschnikowiazizyphicolay-3發酵菌液、伯克氏菌b-1發酵菌液以及腸桿菌b-6-1發酵菌液按1：1～2：0.5～1的質量比混合，得到混合發酵菌液；步驟4，稱取質量百分比為90％的上述混合發酵菌液、0.05％～0.1％的吐溫80、0.2～0.5％的氯化鈣、0.1～0.5％矽酸鈉、0.75％～2％的殼聚糖，餘量用水補足100％；步驟5，向步驟4中稱取的混合發酵菌液中添加步驟4中稱取的吐溫80、氯化鈣、矽酸鈉、殼聚糖以及水，混合均勻後，即得到所述防治草莓採前採後病害及促進生長的菌劑。優選的，每升所述ysp液體培養基中包含下述組分：蛋白腖10g、酵母膏5g、葡萄糖10g，餘量為水。優選的，每升所述nydb液體培養基中包含下述組分：牛肉膏8g，酵母浸膏5g、葡萄糖10g，餘量為水。優選的，每升所述lb液體培養基中包含下述組分：胰蛋白腖10g、酵母提取物5g、nacl10g，餘量為水。本發明的第三個目的是提供一種防治草莓採前採後病害及促進生長的菌劑在草莓生長以及採前採後病害防治中的應用。微生物保藏信息說明：metschnikowiazizyphicolay-3：已保藏於中國典型培養物保藏中心，地址：中國武漢市武漢大學，其保藏號為cctccno.m2016564，保藏日期：2016年10月17日。伯克氏菌b-1(burkholderiacontaminansb-1)：已保藏於中國典型培養物保藏中心，地址：中國武漢市武漢大學，保藏號為cctccno.m2014076，保藏日期：2014年3月7日。腸桿菌b-6-1(enterobactercowaniib-6-1)：已保藏於中國典型培養物保藏中心，地址：中國武漢市武漢大學，保藏號為cctccno.m2012398，保藏日期：2012年10月11日。其中，伯克氏菌b-1已經在2016年10月12日授權的授權公告號為cn104109645b的中國專利《用於防治果蔬採後病害的菌株及生防防菌劑》中被公開；腸桿菌b-6-1已經在2016年4月27日授權的授權公告號為cn103952327b的中國專利《防治果蔬採後病害的生物拮抗菌株、其製備方法及其應用》中被公開。與現有技術相比，本發明的有益效果在於：1)本發明提供的防治草莓採前採後病害及促進生長的菌劑在採前噴施可以有效降低草莓採後病害的發生率，同時還能促進草莓生長。2)本發明提供的防治草莓採前採後病害及促進生長的菌劑在採後噴施能有效降低果實表面帶菌量，降低草莓果實採後的腐爛率，為草莓的綠色生產及保鮮提供了新途徑。附圖說明圖1為採前噴施實施例2製備出的防治草莓採前採後病害及促進生長的菌劑對草莓果實灰黴病的影響結果圖；圖2為採前噴施實施例2製備出的防治草莓採前採後病害及促進生長的菌劑對草莓果實自然腐爛的影響結果圖。具體實施方式為了使本領域技術人員更好地理解本發明的技術方案能予以實施，下面結合具體實施例對本發明作進一步說明，但所舉實施例不作為對本發明的限定。本發明各實施例中所述實驗方法，如無特殊說明，均為常規方法。實施例1一種防治草莓採前採後病害及促進生長的菌劑，其原料由以下質量百分比的組分組成：85％的混合發酵菌液、0.05％的吐溫80、0.5％的氯化鈣、0.1％的矽酸鈉、2％的殼聚糖，餘量用水補足到100％；混合發酵菌液中菌落總數為1.0×106cfu/ml；混合發酵菌液由metschnikowiazizyphicolay-3發酵菌液、伯克氏菌b-1發酵菌液以及腸桿菌b-6-1發酵菌液組成按照1：1.5：0.8的質量比混合而成；其中，metschnikowiazizyphicolay-3發酵菌液是由metschnikowiazizyphicolay-3純菌株培養到對數末期得的；伯克氏菌b-1發酵菌液是由伯克氏菌b-1純菌株培養到對數末期得到的；腸桿菌b-6-1發酵菌液是由腸桿菌b-6-1純菌株培養到對數末期得到的。具體實施步驟如下：步驟1，將metschnikowiazizyphicolay-3的純菌株在-80℃取出後於28℃下在pda平板劃線培養48h，然後挑取單菌落於nydb液體培養基中，以200r/min的振蕩速度培養72h，得到metschnikowiazizyphicolay-3的初始發酵菌液；將伯克氏菌b-1的純菌株在-80℃取出後於28℃下在pda平板劃線培養48h後，挑取單菌落於ysp液體培養基中，以200r/min的振蕩速度培養24h，得到伯克氏菌b-1的初始發酵菌液；將腸桿菌b-6-1的純菌株在-80℃取出後於28℃下在pda平板劃線培養48h後，挑取單菌落於lb液體培養基中，以200r/min的振蕩速度培養24h，得到腸桿菌b-6-1的初始發酵菌液；其中，每升ysp液體培養基中包含下述組分：蛋白腖10g、酵母膏5g、葡萄糖10g，餘量為水；其中，每升nydb液體培養基中包含下述組分：牛肉膏8g、酵母浸膏5g、葡萄糖10g，餘量為水；其中，每升lb液體培養基中包含下述組分：胰蛋白腖10g、酵母提取物5g、nacl10g，餘量為水；步驟2，將metschnikowiazizyphicolay-3的初始發酵菌液置於nydb液體培養基中，然後在28℃下以200r/min振蕩速度培養至對數末期，得到metschnikowiazizyphicolay-3發酵菌液；將伯克氏菌b-1的初始發酵菌液置於nydb液體培養基中，然後在28℃下以200r/min振蕩速度培養至對數末期，得到伯克氏菌b-1發酵菌液；將腸桿菌b-6-1的初始發酵菌液置於nydb液體培養基中，然後在28℃下以200r/min振蕩速度培養至對數末期，得到腸桿菌b-6-1發酵菌液；步驟3，將步驟2中得到的metschnikowiazizyphicolay-3發酵菌液、伯克氏菌b-1發酵菌液以及腸桿菌b-6-1發酵菌液按照1：1.5：0.8的質量比混合，得到混合發酵菌液；步驟4，稱取質量百分比為85％的上述混合發酵菌液、0.05％的吐溫80、0.5％的氯化鈣、0.1％的矽酸鈉、2％的殼聚糖，餘量用水補足100％；步驟5，向步驟4中稱取的混合發酵菌液中添加步驟4中稱取的吐溫80、氯化鈣、矽酸鈉、殼聚糖以及水，混合均勻後，即得到所述防治草莓採前採後病害及促進生長的菌劑。實施例2一種防治草莓採前採後病害及促進生長的菌劑，其原料由以下質量百分比的組分組成：90％的混合發酵菌液、0.08％的吐溫80、0.3％的氯化鈣、0.3％的矽酸鈉、1％的殼聚糖，餘量用水補足到100％；混合發酵菌液中菌落總數為1.0×108cfu/ml；混合發酵菌液由metschnikowiazizyphicolay-3發酵菌液、伯克氏菌b-1發酵菌液以及腸桿菌b-6-1發酵菌按照1：1：0.5的質量比混合而成。具體實施步驟如下：步驟1，將metschnikowiazizyphicolay-3的純菌株在～80℃取出後於28℃下在pda平板劃線培養48h，然後挑取單菌落於nydb液體培養基中，以200r/min的振蕩速度培養72h，得到metschnikowiazizyphicolay-3的初始發酵菌液；將伯克氏菌b-1的純菌株在-80℃取出後於28℃下在pda平板劃線培養48h後，挑取單菌落於ysp液體培養基中，以200r/min的振蕩速度培養24h，得到伯克氏菌b-1的初始發酵菌液；將腸桿菌b-6-1的純菌株在-80℃取出後於28℃下在pda平板劃線培養48h後，挑取單菌落於lb液體培養基中，以200r/min的振蕩速度培養24h，得到腸桿菌b-6-1的初始發酵菌液；其中，nydb液體培養基、ysp液體培養基以及lb液體培養基同實施例1；步驟2，將metschnikowiazizyphicolay-3的初始發酵菌液置於nydb液體培養基中，然後在28℃下以200r/min振蕩速度培養至對數末期，得到metschnikowiazizyphicolay-3發酵菌液；將伯克氏菌b-1的初始發酵菌液置於nydb液體培養基中，然後在28℃下以200r/min振蕩速度培養至對數末期，得到伯克氏菌b-1發酵菌液；將腸桿菌b-6-1的初始發酵菌液置於nydb液體培養基中，然後在28℃下以200r/min振蕩速度培養至對數末期，得到腸桿菌b-6-1發酵菌液；步驟3，將步驟2中得到的metschnikowiazizyphicolay-3發酵菌液、伯克氏菌b-1發酵菌液以及腸桿菌b-6-1發酵菌液按照1：1：0.5的質量比混合，得到混合發酵菌液；步驟4，稱取質量百分比為90％的上述混合發酵菌液、0.08％的吐溫80、0.3％的氯化鈣、0.3％的矽酸鈉、1％的殼聚糖，餘量用水補足100％；步驟5，向步驟4中稱取的混合發酵菌液中添加步驟4中稱取的吐溫80、氯化鈣、矽酸鈉、殼聚糖以及水，混合均勻後，即得到所述防治草莓採前採後病害及促進生長的菌劑。實施例3一種防治草莓採前採後病害及促進生長的菌劑，其原料由以下質量百分比的組分組成：95％的混合發酵菌液、0.1％的吐溫80、0.2％的氯化鈣、0.5％的矽酸鈉、0.75％的殼聚糖，餘量用水補足100％；所述混合發酵菌液中菌落總數為1.0×1011cfu/ml；所述混合發酵菌液由metschnikowiazizyphicolay-3發酵菌液、伯克氏菌b-1發酵菌液以及腸桿菌b-6-1發酵菌液按照1：2：1的質量比混合而成；具體實施步驟如下：步驟1，將metschnikowiazizyphicolay-3的純菌株在-80℃取出後於28℃下在pda平板劃線培養48h，然後挑取單菌落於nydb液體培養基中，以200r/min的振蕩速度培養72h，得到metschnikowiazizyphicolay-3的初始發酵菌液；將伯克氏菌b-1的純菌株在-80℃取出後於28℃下在pda平板劃線培養48h後，挑取單菌落於ysp液體培養基中，以200r/min的振蕩速度培養24h，得到伯克氏菌b-1的初始發酵菌液；將腸桿菌b-6-1的純菌株在-80℃取出後於28℃下在pda平板劃線培養48h後，挑取單菌落於lb液體培養基中，以200r/min的振蕩速度培養24h，得到腸桿菌b-6-1的初始發酵菌液；其中，nydb液體培養基、ysp液體培養基以及lb液體培養基同實施例1；步驟2，將metschnikowiazizyphicolay-3的初始發酵菌液置於nydb液體培養基中，然後在28℃下以200r/min振蕩速度培養至對數末期，得到metschnikowiazizyphicolay-3發酵菌液；將伯克氏菌b-1的初始發酵菌液置於nydb液體培養基中，然後在28℃下以200r/min振蕩速度培養至對數末期，得到伯克氏菌b-1發酵菌液；將腸桿菌b-6-1的初始發酵菌液置於nydb液體培養基中，然後在28℃下以200r/min振蕩速度培養至對數末期，得到腸桿菌b-6-1發酵菌液；步驟3，將步驟2中得到的metschnikowiazizyphicolay-3發酵菌液、伯克氏菌b-1發酵菌液以及腸桿菌b-6-1發酵菌液按照1：2：1的質量比混合，得到混合發酵菌液；步驟4，稱取質量百分比為95％的混合發酵菌液、0.1％的吐溫80、0.2％的氯化鈣、0.5％的矽酸鈉、0.75％的殼聚糖，餘量用水補足100％；步驟5，向步驟4中稱取的混合發酵菌液中添加步驟4中稱取的吐溫80、氯化鈣、矽酸鈉、殼聚糖以及水，混合均勻後，即得到所述防治草莓採前採後病害及促進生長的菌劑。下面結合防治草莓採前採後病害及促進生長的菌劑的應用來對本發明的效果做進一步的說明。由於實施例1-3製備出的菌劑用來噴施草莓後，測定出的草莓各項性能參數相似，因此僅以實施例2中優選的菌劑噴施草莓後測定出的性能參數作為說明。一、利用實施例2的防治草莓採前採後病害及促進生長的菌劑對草莓病害的防治實驗實驗材料：草莓(品種為「紅顏」)於山西省榆次市東陽鎮溫室種植，未使用化學殺菌劑。對照樣：使用無菌水噴灑。處理樣：使用實施例2製備出的防治草莓採前採後病害及促進生長的菌劑。實施方法：分別於採前6d、3d和0d時使用手動噴霧器對草莓進行噴施，噴施到有液滴滴下為止，每個噴施期重複噴施3次，每次噴施重複40株草莓，待草莓成熟期時將噴施過的草莓果實採收後運回實驗室，挑選色澤一致無機械傷的果實進行實驗，實驗結果如下：1、採前噴施菌劑對草莓果實灰黴病的控制將上述採收後的草莓果實在濃度為1×105孢子/ml的灰葡萄孢懸液中蘸10s，無菌風吹乾後將其裝入滅菌塑料盒中，加塑膠袋保溼後依次放置於6℃下15d和16℃下7d，記錄病害發生率，每批處理重複3次，具體實驗結果見圖1。從圖1可以看出，16℃下貯藏7d後，用菌劑處理的草莓果實灰黴菌的發病率為32.23％，而對照樣的草莓果實灰黴菌的發病率為93.87％；6℃下貯藏15d的草莓果實灰黴菌的發病情況與16℃下貯藏7d的情況相似，噴灑3次菌劑處理後草莓果實灰黴菌的發病率相對於對照樣來說也明顯降低，由此可見，相對於噴施無菌水的草莓對照樣來說，噴施本發明的菌劑能夠很好的控制採後草莓果實灰黴病的發病率。2、採前噴施菌劑對草莓果實自然腐爛的影響將採收後的草莓果實裝入塑料盒中，將塑料盒保溼放置於6℃下15d和16℃下7d，記錄果實的腐爛率，每批處理重複3次，具體實驗結果見圖2。從圖2可看出，採前噴施菌劑後，在兩個不同溫度下，噴施菌劑處理過的草莓果實腐爛率明顯降低，處理後在6℃，15d時腐爛率為24.14％，16℃，7d時腐爛率為20.72％。而對照樣的腐爛率在16℃，7d時為78.98％，在6℃，15d時為76.73％。因此，噴施本發明的複合菌劑能夠很好的防止草莓腐爛，降低草莓的腐爛率。3、採前噴施菌劑對草莓果實採後品質的影響果實表面色差值採用cr-400型色差儀(minolta，日本)測定，其中l*值表示亮度，a*值負值表示綠光，正值表示紅光，h值表示色相角，色差值均在果實赤道部位進測定，採前噴施菌劑對草莓果實採後表面色差的影響見表1。表1採前複合菌劑處理對草莓採後色澤變化的影響從表1中可以看出，經過貯藏期後兩個不同溫度條件下的用複合菌劑處理過的樣品亮度值均下降。與對照樣相比，兩個溫度下貯藏7d和15d後，雖然處理樣的l*值比對照樣略高，但差異並不顯著。a*值和h值也得到相似的結論，經貯藏後各處理樣a*值普遍升高，而h值普遍降低，表明果實顏色進一步轉紅，而處理樣與對照樣間差異不明顯，表明採前噴施菌劑對草莓果實貯藏期顏色影響並不明顯。採前噴施菌劑對草莓品質的影響見表2。表2採前複合菌劑處理對草莓採後品質的影響採前噴施菌劑對草莓品質的影響見表2，16℃下貯藏7d後草莓果實失重率較6℃下15d大，但在相同溫度條件下無顯著差異。此外，採前噴施菌劑可以在一定程度上延緩果實硬度、ssc、可滴定酸、vc含量的下降。二、利用實施例2的防治草莓採前採後病害及促進生長的菌劑對草莓生長影響的實驗實驗材料：草莓(品種為「紅顏」)於山西省榆次市東陽鎮溫室種植，未使用化學殺菌劑。對照樣：使用無菌水噴灑。處理樣：使用實施例2製備出的防治草莓採前採後病害及促進生長的菌劑。實驗過程：在草莓盛果期時(4月上旬)，於白粉病發生較嚴重的地塊對草莓植株進行噴施，隔2天噴灑1次菌劑，共噴3次。噴施時使用手動噴霧器對草莓進行噴施，噴施到有液滴滴下為止，每次噴施重複120株草莓，對對照不作處理。最後一次噴施菌劑10d後，觀察記錄對照和處理的草莓植株生長情況，記錄草莓植株的株高、地上部鮮重、單株葉片數，以及白粉病的發生情況。1、菌劑對草莓的促生效應噴施複合菌劑後對草莓的促生效果見表3。表3菌劑處理對草莓苗生長的影響處理株高(cm)植株鮮重單株葉片數處理樣24.26±0.27103.59±2.427.53±0.28對照樣19.56±0.4389.42±2.835.31±0.42從表3可以看出，採前噴施3次菌劑對草莓植株的生長表現出一定促進作用。與對照植株相比，噴施3次的草莓植株比較健壯，葉片濃綠，長勢明顯優於對照，採前噴施3次的植株株高、植株鮮重和單株葉片數均有明顯增加。2、菌劑對白粉病的抑制作用噴灑菌劑劑10d後，將處理和對照進入轉紅期以後的草莓全部採收，並分別統計草莓果實和植株白粉病的發病率，實驗結果見表4。表4菌劑處理對草莓苗白粉病的影響處理植株發病率果實發病率處理樣12.97±1.4256.43±2.18對照樣27.52±1.3529.08±1.53從表4可以看出，處理樣的植株發病率和果實發病率菌明顯低於對照樣，噴施複合菌劑後草莓苗抑制白粉病發病率的效果明顯。儘管已描述了本發明的優選實施例，但本領域內的技術人員一旦得知了基本創造性概念，則可對這些實施例作出另外的變更和修改。所以，所附權利要求意欲解釋為包括優選實施例以及落入本發明範圍的所有變更和修改。顯然，本領域的技術人員可以對本發明進行各種改動和變型而不脫離本發明的精神和範圍。這樣，倘若本發明的這些修改和變型屬於本發明權利要求及其等同技術的範圍之內也意圖包含這些改動和變型在內。當前第1頁12