一種無核葡萄育種的分子標記方法

2023-06-21 18:00:06 1

專利名稱：一種無核葡萄育種的分子標記方法
技術領域：
本發明涉及植物基因工程和分子標記育種技術領域，特別涉及一種無核葡萄育種的基因標記及脫氧核糖核酸(DNA)片段的序列。
葡萄作為世界性水果，其面積和產量均居各類水果的首位。近年來，鮮食葡萄和制幹葡萄的消費量劇增，特別是發達國家和新發展葡萄生產的地區，如美國和澳大利亞等。在這些國家，無核葡萄的主要用途是鮮食和制幹。美國的鮮食和制幹葡萄幾乎全是無核葡萄。僅1994年，美國鮮食葡萄上市產量8.33257億公斤，佔當年全世界總產量38.76％，美國制幹葡萄2.45億公斤，佔當年全世界總產量的68.66％(國際葡萄局O.I.V年報第986——988頁)。又如澳大利亞生產和出口的葡萄中，60％為無核葡萄。在我國，隨著人民生活水平提高，市場需求量增大，無核葡萄也呈現出栽培面積上升，但卻缺乏新的品種。採用傳統常規雜交育種技術，選育無核葡萄品種效率極低，而且鑑定雜種的無核性需3-5年。這種人力、物力、時間耗費多而成效低的育種方法已遠遠不能滿足生產的要求。
國外學者David博士發展起來的胚挽救培養技術，提高了葡萄雜交後代無核雜種的出現率，同時與常規傳統雜交技術相比，可縮短一年時間觀察到雜種果實性狀種子的有無。但這種方法的缺點是採集幼果後，需特殊的培養基培養和離體培養以及實驗室的操作技術，而且沒有解決在幼苗期都選鑑定無核雜種的問題。
分子標記與脫氧核糖核酸(DNA)序列輔助育種技術分子標記輔助基因工程育種技術，這項技術僅在其它農作物或蔬菜品種上應用過，而且多數以限制性片段長度多態性(RFLP)分了標記為多。這項技術自1986年首次發明應用以來，國外在一些農作物品種上進行分子標記輔助育種，取得了明顯成效。自1990年首次報導隨機擴增多態性脫氧核糖核酸(RAPD)技術作為植物育種的分子標記技術以來，這項技術在分子生物學研究領域得到迅速發展，並取得了明顯的成效。隨機擴增多態性脫氧核核酸(RAPD)技術用來尋找遺傳的分子標記，比限制性片段長度多態性(RFLP)技術擁有快速、簡便、成本低、多態性檢測豐富，又不需同位素示蹤和安全可靠的特點，因而受到國際上分子生物學研究者的廣泛重視。
本發明的目的是解決常規傳統雜交技術下，無核葡萄育種周期長的問題，發明了一種能夠檢測葡萄無核基因的脫氧核糖核酸(DNA)的序列，從根本上解決和加速葡萄無核育種進程。
本發明採用隨機擴增多態性脫氧核糖核酸(RAPD)技術，對美國農業部加利福尼亞州Fresno試驗站(David博士課題組)幾十年的雜交組合及胚挽救技術獲得的幼苗進行研究，尋找與葡萄無核基因連鎖的DNA分子標記，用於無核葡萄育種的早期篩選鑑定，對分子標記研究它的DNA序列組成，合成寡聚核苷酸，發展應用成檢測葡萄無核性的探針。
本發明採用隨機擴增多態性脫氧核糖酸(RAPD)技術，獲得了無核葡萄育種的基因標記與脫氧核糖核酸(DNA)序列，基因標記為484對鹼基及其序列(見附

圖1)，由此序列為模板，利用DNA序列合成儀，人工合成了18個核苷酸組成(5』CCAGTTCCGCCCGTAAATG 3』)的寡聚核苷酸被應用，具有檢測葡萄無核基因存在與表達的特性，具體操作步驟如下A.用無核葡萄雜交育種組合(B72-216×B45-187)的親本及雜種後代的64株試材作模板脫氧核糖核酸(DNA)，採用隨機擴增多態性脫氧核糖核酸(RAPD)技術，用加拿大不列顛哥侖比亞大學(UBC)的隨機引物100個(UBC201-300)，進行脫氧核糖核酸的擴增，引物中UBC269可以擴增區分有核與無核的雜種、親本、原始祖先親本，獲得了與葡萄無核基因連鎖的分子標記UBC-269480，其大小約為480對鹼基；B.用細菌質粒M13對在A步驟中獲得的分子標記克隆後，用核酸自動分析序列儀(型號373A)測定該標記(UBC-269480)的鹼基構成及其序列，得出了該分子標記由484對鹼基構成及特定排列順序；C.對B步驟中測定所得脫氧核糖核酸(DNA)序列分析，並與隨機引物UBC-269對比，按照所獲序列為依據，利用DNA合成儀，人工合成寡聚核苷酸5』CCAGTTCGCCCGTAAATG 3』用作引物，它對原雜交群體、親本及原始祖先的無核性可以檢測出來，並以約590對鹼基大小的脫氧核糖核酸(DNA)片段表現了擁有葡萄無核性狀和無核基因；D.用C步驟中合成的寡聚核苷酸作引物，用無核白(Thompson seedless)，百樂無核Perlette)，閃不無核(Flame Seedless)，奧蘭多無核(Orlando Seedless)，Fresno Seedless和新選育的無核品種Dovine做模板擴增，這些品種共同表現了約590對鹼基大小的脫氧核糖核酸(DNA)片段，這些品種唯一的相同性狀是無核性和擁有無核基因；E.用D步驟中應用的引物，對另外兩個無核葡萄育種組合P79-101×FresonSeedless和C73-47×B53-122的親本及其雜種作模板擴增，凡出現約590對鹼基大小的脫氧核酸(DNA)片段，即為無核基因的攜帶者。
2、本發明的其他用途(1)本發明獲得的分子標記(UBC-269484)的脫氧核糖核酸(DNA)序列，在於(a)可以做為無核葡萄育種早期篩選鑑定的分子遺傳標記；上述A步驟為實施例；(b)可以做為脫氧核糖核酸(DNA)的探針，因484對鹼基序列已知；(c)可以用做聚合酶鏈反應(PCR)中合成寡聚核苷酸的模板，例如上述C步驟合成的一個寡聚核苷酸是以這484對鹼基序列為依據的；(2)本發明在分子標記(UBC-269484)脫氧核糖核酸(DNA)序列基礎上，合成的18個核苷酸的序列組成(5』CCAGTTCGCC CGTAA ATG 3』)的作用在於(a)可以用作檢測葡萄無核性或無核基因的探針，上述C、D、E三個步驟涉及的材料與實驗結果即為實施例。
(b)可以用作引物，利用隨機擴增多態性脫氧核糖核酸(RAPD)技術，在無核葡萄育種的幼苗期，擴增出現590對鹼基大小的片段即為檢測到葡萄無核基因，作為無核雜種的早期鑑定與篩選的分子依據，上述C、D、E三個步驟涉及的材料與實驗結果即為實施例。
具體實施例方式利用美國農業部加利福尼亞州Fressno試驗站無核葡萄雜交育種第七代的64株雜種和雙親及其原始無核祖先無核白為試材提取、分離並純化其脫氧核糖核酸做模板；隨機引物購自加拿大不列顛哥侖比亞大學(UBC)，每合100個(編號為UBC201-300)；採用隨機引物擴增多態性脫氧核糖核酸(RAPD)技術及混合分離個體分析方法，標記與葡萄無核性狀連鎖的基因。從100個隨機引物中篩選，儀有加拿大不列顛哥侖比亞269(UBC-269)為特殊引物，獲得了與葡萄無核基因連鎖的特殊性脫氧核糖核酸(DNA)片段為分子標記，其大小約為480鹼基對的片段，簡要記為UBC-269480，採用QIAquick Gel ExtractionKit快速從瓊脂糖凝膠中提取純化該片段(UBC-269480)。用細菌質粒M13對脫氧核糖核酸片段UBC-269480進行克隆，將UBC-269480這個脫氧核糖核酸片段嵌入細菌質粒，並構建成環狀的克隆產物；利用核酸自動分析序列儀(型號373A)測定脫氧核糖核酸片段UBC-269480)的組成為484對鹼基及其特定的序列。將這484對鹼基序列與最初所用隨機引物對比分析，按照所獲脫氧核糖核酸序列為依據，人工合成一個寡聚核苷酸，用作特殊引物，以最初利用的雜種、親本和原始無核祖先無核白以及國際性商品化無核栽培品種等作為模板，進行隨機擴增多態性脫氧核糖核酸分析。當用該寡聚核苷酸作引物，對另外兩個無核葡萄育種雜交群體驗證時，凡出現約為590鹼基對大小片段者，均百分之百為無核植株。所以，用來自於無核葡萄的脫氧核糖核酸特殊片段作模板，合成的這個特定序列的寡聚核苷酸，不僅可以檢測原雜交群體的雜種、親本及其原始無核性，還可以對其它無核雜交群體後代的無核性進行檢測。至此，凡用該寡聚核苷酸作引物，當葡萄用作模板脫氧核糖核酸(DNA)時，擴增出現590鹼基對脫氧核糖核酸片段的植株或雜種，即為無核基因的攜帶者。
本發明的優點在於所獲得的脫氧核糖核酸片段的序列，可以作為無核葡萄育種早期鑑定的分子依據和標記；由該片段人工合成的寡聚核苷酸，可以作為探針用於葡萄無核育種程序中檢測無核基因的有無，以加速育種進程和提高無核育種的準確性；進一步通過染色體步移法，可以對無核基因作圖與定位。
本發明具有如下用途
1)用作脫氧核糖核酸(DNA)探針；2)用作核糖核酸(RNA)探針；3)用作基因轉移；4)用於遺傳工程；5)用於聚合酶鏈反應中的特殊性寡聚核苷酸；6)用於無核葡萄育種的早期篩選鑑定的DNA分於依據。
7)用於無核葡萄品種脫氧核糖核酸(DNA)指紋，可用作註冊植物專利的理論依據。
本發明施用涉及的材料如下1、本發明對美國加利福尼亞Fresno試驗站果樹遺傳研究項目無核葡萄雜交育種組合B72-216×B45-187的第七代的雜種親本及其原始無核祖先，具有檢測葡萄無核基因的功效。
2、本發明對世界性商品化栽培的無核葡萄品種，無核白(Thompson.Seedless)，閃光無核(Flame seedless)，百樂無核(perlette)以及無核品種奧蘭多無核(Orlando Seedless)，Fresno seedless和Dovine等及無核葡萄新品系具有檢測無核性的功效。
3、本發明對美國加福利亞州Fresno試驗站果樹遺傳項目的其它無核葡萄雜交育種組合P79-101×Fresno seedless與C78-47×B53-122兩個組合的後代及其親本具有檢測無核基因的功效。
權利要求
1.一種核酸分子，其特徵在於具有下列序列5′CCAGTTCGCCCGTAAATG3′。
2.權利要求1所述核酸分子用於檢測無核葡萄基因方法，其特徵在於以該核酸分子為引物，以該檢測的葡萄基因為模板進行擴增，擴增出現約590對鹼基大小的脫氧核糖核酸(DNA)的片段表現相擁有葡萄無核基因。
全文摘要
本發明涉及基因工程和分子標記育種技術的方法。採用隨機擴增多態性脫氧核糖核酸(RAPD)技術,獲得了約480對鹼基大小的脫氧核糖核酸片段。對該片段用細菌質粒M13進行克隆,用核酸自動分析序列儀測定其鹼基序列為484對鹼基。以此序列為依據,人工合成的一個寡聚核苷酸具有可以檢測親本、雜種以及商品化無核品種的無核基因存在與無核性狀表達,用作無核葡萄育種中檢測葡萄無核基因的探針。
文檔編號C12N15/29GK1182794SQ9710061
公開日1998年5月27日 申請日期1997年3月7日 優先權日1997年3月7日
發明者王躍進 申請人:西北農業大學