用於檢測及預測氨苯碸超敏症候群的ELISPOT診斷試劑盒的製作方法

2023-06-21 21:43:11

本發明涉及一種用於檢測及預測氨苯碸超敏症候群的elispot診斷試劑盒。

背景技術：

目前，麻風病是由麻風桿菌引起的慢性傳染性疾病。麻風桿菌主要侵犯皮膚和神經，造成肢體的畸殘，不僅導致患者的勞動力喪失，而且引起社會對患者的恐懼和歧視，造成患者個人、家庭等社會問題。20世紀80年代，世界衛生組織(who)推薦聯合化療(mdt)的方案，隨著該方案的全球範圍內推廣應用，大多數國家和地區的麻風病發病率明顯降低，我國亦然。氨苯碸(4，4』-diamonodiphenylsulfone，dds)是mdt方案中必需的藥物。然而氨苯碸可導致部分患者罹患嚴重的藥物過敏---氨苯碸超敏症候群，該症候群在臨床上常表現為：發熱、淋巴結腫大、剝脫性皮炎、溶血和肝炎等，嚴重可導致患者死亡。我們研究顯示：我國麻風患者中氨苯碸症候群的發病率約為2％，而死亡率可高達12.5％，該病已成為導致我國麻風病患者死亡的最主要的原因之一。另外，dds在其他皮膚病的治療中也有較好的療效，如皰疹樣天皰瘡、類天皰瘡、聚合性痤瘡等；但同樣因其具有可引起患者罹患氨苯碸超敏症候群的風險，而致其在臨床應用上受阻。

鑑於上述原因，迫切需要用於檢測氨苯碸超敏症候群的臨床早期診斷試劑盒。

技術實現要素：

本發明要解決的技術問題是提供三種用於檢測及預測氨苯碸超敏症候群的elispot診斷試劑盒。

對於第一種用於檢測及預測氨苯碸超敏症候群的elispot診斷試劑盒，本發明採用的技術方案是，包括氨苯碸。

作為優選，氨苯碸的濃度為20～40ug/ml。

對於第二種用於檢測及預測氨苯碸超敏症候群的elispot診斷試劑盒，本發明採用的技術方案是，由以下所列組分組成：

氨苯碸(20-40ug/ml)、anti-humanifn-r、elispot板、生物素連接humanifn-r、鏈黴素-hrp、aec底物反應液、陽性對照(50ng/mlpma和1ug/mlinomycin)、陰性對照(1640完全培養基)、1640完全培養基、tween-20、pbs。

作為優選，所述氨苯碸的濃度為20-40ug/ml且含量為100ul；

anti-humanifn-r的含量為1ml；

elispot板的規格為96孔；

生物素連接humanifn-r的含量為1ml；

鏈黴素-hrp的含量為1ml；

aec底物反應液的含量為5ml；

陽性對照pma和inomycin各50ul；

陰性對照的含量為3ml；

1640完全培養基的含量為100ml；

tween-20的含量為100ml；

pbs的含量為500ml。

作為優選，陽性對照為50ng/mlpma和1ug/mlinomycin；陰性對照為1640完全培養基。

對於第三種用於檢測及預測氨苯碸超敏症候群的elispot診斷試劑盒，本發明採用的技術方案是，由表1所列組分及含量組成。

表1試劑盒成分

本發明的有益效果是：

作為用於檢測及預測氨苯碸超敏症候群的elispot診斷試劑盒，具有操作簡便、檢測快捷、靈敏度高、方便攜帶的優點，適用於氨苯碸超敏症候群早期診斷的檢測。

具體實施方式

一、實驗材料

1、單一核細胞：由中國醫學科學院皮膚病醫院麻風疾控中心提供病人單一核細胞樣本，液氮保存待用。

2、選取10例病人、10例健康人細胞：

(1)單一核細胞藥物刺激20小時elispot檢測

(2)單一核細胞用氨苯碸刺激t細胞增殖7天，elispot檢測。

3、試劑盒成分

表1試劑盒成分

二、實驗方法

1、抗體包被與封閉：

(1)pbs稀釋anti-humanifn-r(1∶200)，加之elispot孔板中，每孔100ul，4度過夜孵育；

(2)1640完全培養基洗一遍，再加入1640完全培養基室溫封閉2小時。

2、細胞刺激：

(1)1640完全培養基配置氨苯碸(1∶1000)，加入elispot孔板中，每孔100ul；

(2)單一核細胞稀釋，加入每孔2x10*5；

(3)陽性對照100ul，加入每孔2x10*5細胞；

(4)陰性對照100ul，加入每孔2x10*5細胞；

(5)37℃二氧化碳培養箱孵育16-26小時，水洗兩遍，pbs洗3遍。

3、抗體檢測

pbs稀釋生物素連接humanifn-r(1∶250)，加入加入elispot孔板中，每孔100ul；室溫孵育2小時。水洗兩遍，pbs洗3遍。

4、鏈黴素-hrp

pbs稀釋生物素連接鏈黴素-hrp(1∶200)，加入加入elispot孔板中，每孔100ul；室溫孵育1小時。水洗兩遍，pbs洗3遍。

5、底物反應

加100ulaec至每孔，室溫孵育15分鐘。

三、結果

選取10例病人及10例健康人單一核細胞，比較與氨苯碸共孵育t細胞反應頻率，表2表明，在相同藥物濃度、相同培養時間及相同培養溫度條件下，10例病人及10例健康人在氨苯碸刺激及共孵育7天下t細胞反應頻率。通過直觀顯示氨苯碸刺激及共孵育7天下t細胞反應頻率，氨苯碸超敏症候群病人在本試劑盒檢測下能靈敏的監測t細胞反應，其斑點形成數遠遠超過健康人。

表2：各中受試者在藥物刺激後t細胞反應

以上所述的本發明實施方式，並不構成對本發明保護範圍的限定。任何在本發明的精神和原則之內所作的修改、等同替換和改進等，均應包含在本發明的權利要求保護範圍之內。