一種純化、識別胰腺內分泌細胞的方法
2023-06-21 19:32:21
專利名稱：一種純化、識別胰腺內分泌細胞的方法
技術領域：
本發明屬於生物領域，其涉及到細胞分化，具體涉及一種純化、識別胰腺內分泌細胞的方法。
背景技術：
胰島細胞移植方法是治療糖尿病有效手段之一，但來源極為有限。研究如何獲得足夠多的人胰島β細胞已成為當前研究的重點課題。據此，發展識別和純化具胰島素分泌功能的細胞以及具分化胰島素分泌功能的幹細胞或前體細胞的有效方法已成為當務之急。胰腺內分泌幹細胞(Pancreatic endocrine stem cells，例如Ngn3表達陽性的具分化能力的胰胚細胞)和前體細胞經培養後可分化或分泌胰島素的細胞，並用於治療糖尿病患者(Jiang，et al.，Stem Cells 2007 ；25 1940-53, Eshpeter, et al. ,Cell Prolif 2008 ；41 :843-58)。
發明內容
本發明的目的是提供一種純化胰腺內分泌細胞的方法。實現上述目的的技術方案如下一種純化胰腺內分泌細胞的方法，該方法包括以下步驟(a)選擇待純化分類的候選細胞群；(b)用檢測試劑檢測該細胞群中Insm2表達陽性的細胞；(c)分離出Insm2表達陽性的細胞，純化，得到胰腺內分泌幹細胞。 優選地，檢測步驟(b)所用的標記檢測的試劑包括抗Msm2抗體或是Msm2的mRNA 的互補核苷酸。本發明的另一目的是提供一種識別內分泌幹細胞或前體細胞的方法，包括以下步驟(a) 一種Msm2特異檢測試劑接觸待識別的細胞；(b)檢測Insm2的表達；(c)發現Insm2的出現即為識別出所檢出的細胞為內分泌幹細胞或前體細胞。優選地，所述檢測試驗為含有抗Msm2抗體或一種與Msm2的mRNA互補的核苷酸。本發明的另一目的是提供一種識別可調節內分泌細胞功能或啟動內分泌細胞增殖化合物的方法。實現上述目的的技術方案如下一種識別化合物的方法，該化合物可調節內分泌細胞功能或啟動內分泌細胞增殖，該方法包括常規高通量篩查中的各個步驟如化合物與^sm2陽性細胞接觸，以及測量該化合物對內分泌細胞功能影響。一種識別Msm2活性調節因子的方法，包括與純化的Msm2接觸的一組試驗的化合物，選擇與^sm2特異結合的化合物，和測驗所選化合物對內分泌細胞功能的影響。本發明證實hsm2是Snai VGfiVInsm1轉錄因子家族的新成員，與發育和疾病有重要關係。Insm2是胰腺內分泌細胞和內分泌細胞前體細胞的標記物。這些細胞可分化成具糖誘導的分泌胰島素的β細胞。因此，Insm2可識別和純化胰腺內分泌細胞和前體細胞。這些細胞經培養後可分化或分泌胰島素的細胞並用於治療糖尿病患者(Jiang，et al.，Stem Cells 2007 ；25 :1940-53, Eshpeter, et al. ,Cell Prolif 2008;41:843-58)。Insm2 也能用於藥物靶標以識別刺激幹細胞和前體細胞分化或增殖的分子。Insm2還能用於幫助識別內分泌幹細胞/前體細胞的表面標記。這樣就可以採流式細胞儀(FACQ等方法來純化內分泌幹細胞或前體細胞。
圖1是INSM2基因分析。圖2是人的INSM2和小鼠的hsm2在發育過程中和成年期組織表達水平的檢測。圖3是hsm2表達在成年人和小鼠的胰島細胞中。圖4是hsm2在斑馬魚胚胎發育期的表達。圖5是Ngn3和NeuroDl對hsm2的活化作用。圖6是Ngn3和NeuroDl誘導胰腺mPANC細胞的內源性hsm2的表達。圖7是hsm2在小鼠胚胎發育過程和成年胰島表達調控的模式圖。
具體實施例方式I.引言本發明證實Msm2是內分泌幹細胞或前體細胞的一種標記。因此，Insm2可用於純化和識別該類細胞，而在經體外培養後，可回置於病人體內。這些細胞在體外可誘導增殖或分化成對糖反應的分泌胰島素的細胞。Insm2也能用於藥物試驗的靶標。這樣的試驗可用於識別和選擇能誘導內分泌幹細胞或前體細胞分化和/或增殖的藥物。Insm2還能用於幫助識別內分泌幹細胞或前體細胞的表面標記物。這些表面標記物可用於流式細胞儀純化細胞以及藥物試驗的靶標。一旦有足夠的具功能的人的β細胞，即可對糖尿病的治療和研究有重要的影響。 其中一個直接的應用就是進一步研究β細胞的生物學功能。高通量篩選糖尿病藥物也是應用範圍之一。也可用於篩選能誘導內分泌細胞分化的小分子或其它化合物。另外，這些細胞也可用於糖尿病的移植治療。II.定義本發明所用術語及其定義符合本領域科學研究的常規範疇。舉例如下「胰腺幹細胞」是未分化的細胞，具有變成廣泛特殊細胞的潛能(如胰腺內分泌細胞和β細胞)。 胰腺幹細胞包括胰胚幹細胞、成年胰腺幹細胞、前體細胞，和胰腺來源的多潛能前體細胞 (Calne，et al.，Nat Rev Endocrinol 2010 ；6 :173_7)。「內分泌細胞」是來源於成年或胚胎內分泌腺(在胰腺或胰島)的一種細胞。「內分泌胰腺細胞」是指來源於成年或胚胎胰腺，特別是胰島細胞的細胞。「培養」內分泌胰腺細胞是指原代培養以及表達重組核苷酸的細胞。培養內分泌細胞也包括已經轉型的細胞， 即使用癌基因等(如SV40T抗原，ras，或端粒酶基因等)。其它所用術語還包括多種「胰島細胞」，「誘導細胞分化」，「β細胞特異基因」，「糖反應的分泌胰島素」，「轉錄因子」，「調節β細胞功能」，「I型或II型糖尿病」，「免疫反應」，「過表達」，「報導基因」，"Insm2」，"Insm2多肽」，「啟動子(promoter) 」，「試驗化合物」，「候選藥物」，「抑制劑」，「激活劑」，「小的有機分子」，"RNAi 分子」，"siRNA"等等。III.本發明的細胞本發明提供一種方法，用以誘導細胞分化(如胰胚幹細胞，胰腺來源的多潛能iPS 細胞和內分泌細胞)，該方法就是採用Insm2作為標記來純化這些細胞。本發明所述的細胞可以是原代細胞也可能是維持培養的細胞。建立一種原代細胞培養的方法和技術可參見文獻(Chao,et al. , Cell Transplant 2008 ； 17 :657_64, Qi, et al. , J Vis Exp 2009 ；pii 1343)。合適的細胞包括內分泌細胞和幹細胞(如胰胚幹細胞，成年幹細胞和胰腺來源的多潛能前體細胞)。合適的內分泌細胞包括胰腺細胞，胰島細胞(如β細胞和S細胞)。胰島細胞可來源於成年胰腺組織，發育期的胰腺組織和胰島樣細胞團。細胞可來源於任何合適的哺乳動物或發育期的組織。例如，細胞可以從嚙齒類動物(小鼠、大鼠、天竺鼠和兔子)和非嚙齒類動物(如狗、貓、豬、羊、馬、牛和山羊)；靈長類動物如猩猩和人等。本發明在重組遺傳學方面採用常規的技術。常用的方法見Sambrook等的「分子克隆」中的基本內容(Sambrook, et al. , Molecular Cloning, A Laboratory Manual 1989 ； 2nd ed.)。IV.細胞培養本發明在細胞培養方面採用常規技術，相應的方法參見「動物細胞培養(1994年， 第三版)。一般來說，細胞培養環境包括考慮細胞生長的底物，細胞密度和細胞之間的接觸、 氣相、培養基和溫度。細胞通常在37°C飽和溼度的孵育箱培養。CO2濃度為5%。常用的培養液為DMEM 和RPMI1640等。通常用低糖，並加10%熱滅活的小牛或胎牛血清。培養液的PH為7. 2-7.4。 其它可加抗菌素、胺基酸和肝細胞生長因子等。細胞培養72小時後更換培養液。細胞生長的密度可根據不同的細胞類型由經驗判斷。當細胞密度超過85%後即可傳代。V.治療糖尿病的方法本發明純化的細胞可用於治療糖尿病。例如，本方法所生產的分化的內分泌細胞可用於胰島素依賴型的糖尿病(I型)的治療。治療過程中使用細胞的多少主要由臨床醫師綜合判斷決定。細胞毒性，移植反應， 疾病的程度及進展，以及抗移植細胞抗體的產生等均有影響。如何使用本發明生產的細胞， 可根據能否維持血糖水平，不同量的細胞的副作用，以及患者的體重及整體健康狀況來決
定。 所使用的細胞劑量應使患者較長時間獲得治療效益。也可取決於細胞類型及患者的狀況，以及體重或體表面積等情況。劑量的大小也取決於副作用的出現，性質和程度，以及是否伴隨著載體或轉型細胞類型等。可單劑量也可多劑量使用。移植細胞的免疫注射是能否成功進行胰島移植的一個主要障礙。任何供體細胞的移植均會被免疫細胞識別。但近年免疫排斥反應已初步得到控制。使用本發明的永生化的細胞系的優勢是基因工程後的移植細胞有可靠的質量，可避免或抑制宿主的免疫反應。藥物可接受的載體部分決定於所採用的特殊成分(如細胞或小分子)以及如何使用這些成分的特殊方法。相應地，本發明可用的藥物成分形式可有較廣泛的選擇。使用形式可以是靜脈注射、肌肉注射、皮內、腹腔或經皮注射。VI.檢測Insm2陽性細胞檢測Insm2陽性細胞可採用常用的針對Insm2蛋白質或RNA的方法，如特異性抗 Insm2抗體作組織化學染色或與Insm2核苷酸的互補鏈結合再與化學標記物如螢光標記， 同位素標記等連接。VII.內分泌細胞功能調節實驗本章舉例說明如何應用Insm2表達細胞及識別其他調節內分泌細胞功能的因子。A 試驗試驗是指採用本發明所用細胞來檢測與內分泌細胞功能調節有關(抑制或激活) 有關因子的表達。如GK, SUR-LMafA,胰島素，granuphilin，chromagranin A等，這些調節因子對治療與糖代謝有關的疾患，糖尿病或低血糖有重要作用。功能異常的治療包括對各型糖尿病，胰島素瘤所致的高胰島素血症，或因藥物或過量使用胰島素所致的低血糖，或因胰島素或胰島素受體的抗體所致的免疫疾病等。通過測試標記物(InSm2)表達(RNA或蛋白質)可檢測出調節的功能。物理或化學變化的檢出也可以制定化合物對內分泌細胞功能的影響。用未加化合物處理的樣本作對照，可檢測出化合物處理的細胞的抑制或激活的調節作用。舉例來說，試驗之前可選轉染連接了某啟動子的報導基因，報導基因的表達表明所實驗的化合物是β細胞功能的調節因子。合適的報導基因包括螢光素酶(Luciferase)， 螢光蛋白(GFP)等。合適的啟動子包括胰島素啟動子，PDX-I啟動子，Insm2啟動子和 NeuroD/bete2 啟動子等。B調節物成為內分泌細胞功能調節物可以是任何小分子化合物，或大分子，如蛋白質，糖， 核苷酸或脂類。理論上任何化合物均可在本發明試驗系統中檢測是否為調節物或底物。當然，大部分化合物使用時為溶液或溶於有機物(特別是DMSO為基礎的)溶液。本試驗方法是設計用於篩選的化合物庫。通常是自動化檢測。—個理想的實例是結合化合物和多肽來進行高通量篩選，以找到有上述活性的化合物。這些化合物可作進一步傳統的試驗及實際治療。VIII.評估insm2系統的進一步說明Ngn3是表達在內分泌受體細胞中的一種重要的轉錄因子。採用來源於內分泌胰腺的細胞系(cell line)，已發現Ngn3下遊的幾個重要的轉錄因子(Murtaugh，et al., Development 2007 ；134 :427_38)。Insml就是其中之一，其對胚胎胰島的發育起關鍵作用 (Gierl，et al.，Genes Dev 2006 ；20 :2465_78)。從理論上來說，β細胞的產生可因新生細胞而出現(即從幹細胞分化而來)，也可由已有的β細胞複製而來。人胰腺非內分泌上皮細胞也具有向內分泌細胞分化的能力。Insm2主要表達在內分泌細胞如胰島細胞中。Insm2也表達在一些特殊的神經細胞中，如大腦皮層的神經細胞。本發明還有一點重要的發現，即Insm2是BHLH轉錄因子Ngn3 和NeuroDl的下遊靶標分子。Ngn3表達的增加或減少也直接導致Insm2表達的增加和減少。
以下實例表明Msn^在胰腺內分泌細胞產生和發育過程起重要作用。Insm2可標示能變成新的胰腺內分泌組織的細胞。以下實例由圖所示但不限於這些例子。實施例1人hsm2與hsml的胺基酸序列高度同源，屬於Snail/Gf il/Insml家族含C2H2型鋅指蛋白轉錄因子的新成員。人的hSm2從人胰島細胞瘤cDNA基因文庫中用 PCR 方法(引物順序5 『 -CCATCCTAATACGACTCACTATAGGGC-3 『 ；reverse, 5' -ACAGCTGAACACCTTGTCGCACTC-3『)分離出(GenBank acc. no.，NM_032594)，編碼 566 個胺基酸殘基(Protein Database acc. no.，NP_115983)，該蛋白質的分子量為60kDa、等電點為9. 46(圖1)。hsm2與hsml有51%的同一性和56%相似性。從線蟲C. elegans到人類都存在直系同源&hSmlAnSm2，提示它是一個在進化中相對保守的基因家族。(A)應用NCBI提供的BLAST程序比較人INSM2與小鼠^1細2的胺基酸序列的高度同源性。(*)表示同一胺基酸，(「)表示缺少最佳對應序列。N-端(胺基酸序列1160)包含如下幾個結構域Snag結構域(胺基酸序列1-7)；兩個富含脯氨酸的區域(胺基酸序列35-55和胺基酸序列102-115)；核定位信號(胺基酸序列199-225)。C-端包含5個鋅指結構域(胺基酸序列261-566)。INSM1/INSM2家族蛋白特徵性序列(胺基酸序列302-316)有下劃線。(B) 圖示比較INSM2和INSMl的蛋白質結構。Snag結構域(綠色圓圈)；2個脯氨酸富含區(空白格子)；NLS核定位信號序列(綠色圓圈)。正方形格子代表每一個鋅指結構域。紅色表示第一個鋅指結構域的最後一個組氨酸被精氨酸代替。兩種蛋白質的標記性序列在第二個鋅指結構域的末端(箭頭表示)。實施例2Insm2信使核糖核酸或INSM2蛋白質表達在胚胎及成年胰腺內分泌細胞採用小鼠全長hsm2 cDNA作探針，Northern印跡試驗顯示hsm2表達在小鼠胚胎時期，在胰腺發育階段的Ell. 5-E13. 5天，Insm2的表達明顯增強(圖2)。採用針對INSM2 胺基酸(5-SRQVLLLQMPLRPGC-3)特異性兔抗體，^festern印跡實驗結果顯示，Insm2蛋白質表達在成年胰腺，分子量約為60KDa (圖幻。採用hsm2特異性抗體的免疫組織化學染色，顯示INSM2蛋白質表達在胰島內分泌細胞，但在胰腺外分泌組織中未見其表達(圖幻。INSM2 蛋白質也表達在腎上腺皮質及髓質的內分泌細胞及許多腦神經細胞如腦皮質神經元，海馬回和小腦神經細胞。斑馬魚的原位雜交試驗也證實hsm2 mRNA表達在發育的胰腺和神經組織(圖4)。圖2中，(A)小鼠Insm2的信使核糖核酸(mRNA)在E6. 5-E18. 5天小鼠胚胎期的表達。Insm2信使核糖核酸的表達在Ell. 5-E13. 5期間有短期增強。以18S和28S信使核糖核酸標示每條電泳泳道的mRNA是等量的。GAPDH作為模板對照。(B) INSM2信使核糖核酸在多種成年人組織的表達水平，其中在胰腺和心臟表達較高。Insm2轉錄產物的大小標示在每幅圖像的右側。(C)用兔抗INSM2抗體進行蛋白質印跡(Western blot)分析，可見在小鼠胰腺和腦組織hsm2蛋白質的單條帶，約為60kDa(千道爾頓)。圖3中，(A)應用INSM2抗體通過免疫螢光染色發現INSM2 (綠色)在絕大多數 (或者全部)小鼠的胰島細胞中表達。(B)與此相似，胰島素抗體顯示大多數的胰島細胞為胰島素陽性的β細胞(紅色)。A和B融合圖(C)表明Insm2和胰島素均表達在β細胞中(黃色)。(D)如箭頭所示，在人胰島β細胞及α細胞中檢測到INSM2(紅色)。(E)胰高血糖素抗體顯示α細胞(綠色)。(F)D和E的融合圖表明INSM2與胰高血糖素均表達在α細胞中(黃色)。標尺為ΙΟΟμπι。圖4中(A)應用斑馬魚全長hsm2 cDNA作為探針，對胚胎整體切片作原位雜交。 檢測發現hsm2信使核糖核酸表達在斑馬魚的胚胎胰腺。早在14體節期hsm2就開始表達 (受精後14小時)，並且在20體節期(受精後19小時)表現明顯(雙箭頭所示)，右側方框有5倍的放大圖。另外，Insm2在神經系統也有明顯表達(E)，且在頭端有較強表達(箭頭所示)。a,前端；ρ,後端。實施例3Insm2基因是Ngn3和NeuroDl下遊的新靶標Notch信號的失活引起Ngn3的激活是內分泌胰腺發育開始的關鍵一步。最近的文獻表明 hsml 基因是 Ngn3 下遊的靶標(Mellitzer，et al. ,Embo J 2006 ;25 1344-52)，同時也是 NeuroDl 的靶標(Breslin，et al.，J Biol Chem 2003 ；278 :38991-7)。因為 Insm2 是化81111的同源基因，故化81112也可能是Ngn3和NeuroDl下遊的新靶標。另外，基因晶片分析Ngn3基因剔除小鼠胰胚(E18. 5天)組織表明，Insml和hsm2基因的表達均顯著降低(平均下降6. 3倍以上)(Juhl，et al. ,Diabetes 2008 ；57 =2755-61)；參見文獻附錄的資料庫資料)。Insml基因剔除小鼠胰島細胞發育障礙及胰島素或胰高血糖素的產生障礙等證據，也提示其同源基因hsm2也可能參與胰島細胞的發育及內分泌激素生成的信號傳導通路。為了判別Ngn3和NeuroDl是否調控小鼠hsm2基因的表達，Hela細胞被同時轉染hsm2啟動子和CMV-Ngn3和/或CMV-NeuroDl質粒DNA。結果證明Ngn3和NeuroDl均可以激動hsm2螢光素酶報導基因的活性(圖5)。用腺病毒-Ngn3或腺病毒-NeuroDl表達系統，轉染胰腺非內分泌細胞而使之轉型分化後，通過實時PCR證明小鼠hsm2信使核糖核酸表達的增加(圖6)。圖5中(A)上圖攜帶小鼠Msn^啟動子螢光素酶報導基因的E-box及其近端 2. 5-kb的簡圖。下圖不同長度的小鼠hsm2啟動子螢光素酶構建體的螢光素酶報導基因分析。應用每個質粒DNA (0. 5 μ g)和CMV-Ngn3或CMV-NeuroDl (有或無)進行HeLa細胞瞬時轉染(48小時)。(B)上圖0. 6-kb的hsm2啟動子螢光素酶報導基因兩個相鄰E_box 的簡圖。下圖Ngn3/E47-或NeuroDl/E47-介導的報導基因活性測定結果，0. 5μ g質粒DNA 轉染到HeLa細胞48小時單純質粒DNA轉染(第一縱行)、與E47、Ngn3、NeuroDl、Ngn3/ E47和NeuroDl/E47共轉染(第2_6縱行)。(C)左側圖示野生型或突變型構建體(包含 Insm2啟動子相鄰兩個E_box和TATA-螢光素酶報導基因)。右側圖示CMV-Ngn3/E47或 CMV-NeuroDl/E47試劑與0. 5 μ g報導基因質粒DNA共轉染結果。(A-C)螢光素酶活性的測定方法參見產品說明(ftOmega，Madison, WI, USA)。實驗結果用運載體或構建體的基本活性的倍數表示(均數士標準差)。細胞轉染三份並重複三次。(D)Ngn3和NeuroDl偶聯於 Insm2啟動子。應用MIN6小鼠胰島瘤細胞分離的染色質與Ngn3抗體，NeuroDl抗體或IgG 進行染色質免疫沉澱試驗(ChIP)。連續稀釋DNA作為PCR分析的陽性對照。引物序列的描述見材料和方法。應用Ngn3抗體或NeuroDl抗體進行hsm2基因啟動子的免疫共沉澱分析，但與免疫前IgG無免疫反應。陽性對照hsml與Ngn3或NeuroDl抗體進行共沉澱，但與陰性對照BRCAl無免疫反應。圖像代表三個獨立的實驗。每一個圖像的右側標有PCR產物的大小。圖6是Ngn3和NeuroDl誘導小鼠胰腺mPANC細胞的內源性Insm2信使核糖核酸的表達。Ngn3或NeuroDl刺激後mPANC細胞的Insm2轉錄產物增加。RT-PCR結果顯示， 腺病毒_Ngn3或腺病毒-NeuroDl轉導胰腺mPANC細胞Insm2的表達增加(第3行圖)，但是，在腺病毒_載體轉染細胞或親本mPANC細胞未檢測到。腺病毒-Ngn3轉導mPANC細胞中NeuroDl表達上調(第2行圖，帶1)。GAPDH作為樣本對照。圖中數據來自三個獨立的實驗結果。實施例4表達Insm2是Ngn3和NeuroDl的直接靶標的基因證據因為小鼠Insm2啟動子順序含有10個假定的E-盒子，Ngn3和NeuroDl有可能直接調控Insm2的表達(圖5)。同時轉染Hela細胞不同長度的Insm2啟動子區域(0. 4-2. 5_kb) 以及CMV-Ngn3和/或CMV-NeuroDl質粒DNA，過表達的結果顯示0. 6_kb的近端啟動子區域是Insm2與Ngn3或NeuroDl結合的最佳區間。突變試驗進一步證明，Insm2近端該區域內的El和E2盒子均可與Ngn3和NeuroDl結合。另外，採取染色質沉澱試驗(ChIP)也證明了 Ngn3和/或NeuroDl與Insm2的直接結合(圖5)。總之，Ngn3或NeuroDl與Insml和Insm2啟動子的結合，均是通過與後二者啟動子近端區域的E盒子特異性的結合而成。結合以上數據表明，在早期胰腺發育過程中Ngn3 的表達，激活了下遊Insm2的表達，並通過NeuroDl維持Insm2的表達在成年胰腺內分泌細胞(圖7)。圖7是Insm2在小鼠胚胎發育過程和成年胰島表達調控的模式圖。Ngn3的表達啟動了定向內胚層內分泌胰腺的發育(Murtaugh, et al.，Development2007 ；134 :427_38)。 本圖顯示Ngn3在胚胎發育第11. 5天至13. 5天，激活Insm2在胰腺內分泌細胞的顯著表達 (紅色)。同時Ngn3也激活NeuroDl的表達並通過NeuroDl維持了 Insm2在成年胰島細胞的持續表達(綠色)。Insm2的表達受到Ngn3和NeuroDl的雙重調控，Insm2表達的高峰以黑體字標示。實施例5本實施例的純化胰腺內分泌細胞的方法，包括以下步驟(a)選擇待純化分類的候選細胞群；(b)用檢測試劑檢測上述細胞群中Insm2表達陽性的細胞；所述的檢測試劑包括有抗Insm2抗體或Insm2的mRNA的互補核苷酸；(c)分離出Insm2表達陽性的細胞，純化，得到胰腺內分泌幹細胞。檢測Insm2陽性細胞可採用本領域技術人員常用的針對Insm2蛋白質或RNA的方法，如特異性抗Insm2抗體作組織化學染色或與Insm2核苷酸的互補鏈結合再與化學標記物如螢光標記，同位素標記等連接。本實施例所述識別內分泌幹細胞或前體細胞的方法，包括以下步驟(a)用Insm2特異檢測試劑接觸待識別的細胞；所述檢測試劑含有抗Insm2抗體或一種與Insm2的mRNA互補的核苷酸；(b)檢測Insm2的表達(c)發現Insm2的出現即為識別出所檢出的細胞為內分泌幹細胞或前體細胞。
上述純化胰腺內分泌細胞的方法和識別內分泌幹細胞或前體細胞的方法中的檢測試劑和檢測手段可用本領域的技術人員根據目前現有的技術而實現，也可以參考前述實施例的方法。本實施例所述識別小分子化合物(例如高通量篩查庫中的某些小分子化合物)的方法，該小分子化合物可調節內分泌細胞功能或啟動內分泌細胞增殖，該方法包括常規高通量篩查中的各個步驟如與Insm2陽性細胞接觸的化合物，以及測量該化合物對內分泌細胞功能影響。這些化合物的也可通過候選的小分子化合物等檢測試驗來實現。
本實施例所述識別Insm2活性調節因子的方法，該方法包括與純化的Insm2接觸的一組試驗的化合物，選擇與Insm2特異結合的小分子化合物，和測驗所選的化合物對內分泌細胞功能的影響。本實施例所述在個體中產生內分泌細胞的方法，該方法包括對該個體使用有效劑量的化合物或調控Insm2的表達。該化合物可選擇性地調控Insm2的表達。以上是針對本發明的可行實施例的具體說明，但該實施例並非用以限制本發明的專利範圍，凡未脫離本發明技藝精神所為的等效實施或變更，均應包含於本發明的專利範圍中。
權利要求
1.一種純化胰腺內分泌細胞的方法，其特徵在於，該方法包括以下步驟(a)選擇待純化分類的候選細胞群；(b)用檢測試劑檢測上述細胞群中Msm2表達陽性的細胞；(c)分離出Insm2表達陽性的細胞，純化，得到胰腺內分泌幹細胞。
2.根據權利要求1所述純化胰腺內分泌細胞的方法，步驟(b)所述的檢測試劑包括有抗Msm2抗體或Msm2的mRNA的互補核苷酸。
3.一種識別內分泌幹細胞或前體細胞的方法，其特徵在於，包括以下步驟(a)用Msm2特異檢測試劑接觸待識別的細胞；(b)檢測Insm2的表達；(c)發現Msm2的出現即為識別出所檢出的細胞為內分泌幹細胞或前體細胞。
4.根據權利要求3所述識別內分泌幹細胞或前體細胞的方法，其特徵在於，所述檢測試劑含有抗^sm2抗體或一種與Msm2的mRNA互補的核苷酸。
5.一種識別小分子化合物的方法，該小分子化合物可調節內分泌細胞功能或啟動內分泌細胞增殖，其特徵在於，該方法包括小分子化合物與Msm2陽性細胞接觸，以及測量該化合物對Msm2陽性細胞功能影響。
6.一種識別hs叫活性調節因子的方法，其特徵在於，該方法包括與純化的^ism2接觸的一組試驗的化合物，選擇與^sm2特異結合的小分子化合物，和檢測所選的化合物對內分泌細胞功能的影響。
7.一種在個體中產生內分泌細胞的方法，其特徵在於，該方法包括對該個體使用有效劑量的化合物或調控Msm2的表達。
8.根據權利要求7所述的方法，其特徵在於，該化合物可選擇性地調控nsm2的表達。
全文摘要
本發明公開了一種純化胰腺內分泌細胞的方法，包括以下步驟組成選擇待純化分類的候選細胞群，用檢測試劑檢測上述細胞群中Insm2表達陽性的細胞；分離出Insm2表達陽性的細胞，純化，得到胰腺內分泌幹細胞。本發明還公開了利用檢測Insm2來識別內分泌幹細胞或前體細胞。
文檔編號A61K45/00GK102321572SQ20111021500
公開日2012年1月18日 申請日期2011年7月29日 優先權日2011年1月29日
發明者蔡濤, 陳翔 申請人:餘躍紅, 蔡濤