聚乙二醇修飾的降纖酶的製作方法

2023-06-21 15:25:26

專利名稱：聚乙二醇修飾的降纖酶的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種降纖酶，具體地說是一種聚乙二醇修飾的降纖酶。
背景技術：
蛋白質藥物臨床應用的安全性和有效性一直是人們關注和研究的熱點。蛋白質藥物由於穩定性差，血漿清楚率高，體內半衰期短，易產生抗原抗體反應，因此在臨床治療中受到很大的限制。因此研究人員採用了各種藥物傳遞技術來提高蛋白質藥物的療效，包括採用不同的給藥途徑(如口服，鼻腔給藥，透皮吸收)，不同的載體(如微球，脂質體，紅細胞，單克隆抗體)，不同高分子材料(如多糖)，不同藥物釋放技術(如控釋緩釋技術，前藥)。而目前在藥物傳遞技術中研究最為廣泛的就是聚乙二醇(polyethylene glycol，PEG)修飾技術，這是近三十年來發展起來的一種用於改進蛋白質類藥物體內藥動學性質的新技術，它將活化的聚乙二醇分子鍵合到蛋白質分子表面上，影響蛋白質的空間結構，最終導致蛋白質各種生物化學性質的改變。研究證實，通過共價鍵用PEG來修飾蛋白質表面的胺基酸殘基可以有效降低蛋白質的免疫原性，提高血漿半衰期，減少給藥次數。
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本發明所涉及的蛋白質是從江浙尖吻蝮蛇蛇毒或東北白眉蝮蛇蛇毒中提純的降纖酶(Defibrase，Df)，它屬蛇毒類凝血酶((thrombin-like enzymes，TLE))中的一種，同生理凝血酶(Thrombin，Tb)相似，同時具有精氨酸酯酶活性，但不激活血漿中的XIII因子，因此進入人體後僅形成鬆散的、可溶性的纖維蛋白凝膠，易從血液中清除，易被吞噬細胞系統或纖溶酶作用分解，從而達到使紅細胞和血小板解聚、降低血液粘度和去纖、溶栓的作用。
降纖酶在國內臨床上有廣泛的應用，其去纖、抗凝、降脂、擴張血管和改善微循環等治療功能得到了充分的肯定，但是在使用過程中同樣具有蛋白質藥物所共有的特點，如具有免疫原性，半衰期短，穩定性差等。從1997年到現在，已有多篇文章報告降纖酶的臨床不良反應，其中最常見的不良反應是引起過敏反應。(鄭萬剛.降纖酶不良反應12例分析.蛇志[J].1998，(3)32.童延清，童世清，陳旭.降纖酶致蕁麻疹1例.卒中與神經疾病[J].2002，9(1)5.王峰，張華，李成建.去纖酶的不良反應.醫藥導報[J].2002，21136.)為此，如何獲得低免疫原性的降纖酶，改善該蛋白酶的藥物動力學以提高耐受性及給藥便利程度，一直是研究的重點。
目前大多數的研究是將多肽分子中的氨基作為修飾位點。製備蛋白質和聚乙二醇結合物的最常用的方法是利用PEG活化後形成的親電子基團和蛋白質上的氨基進行反應，反應後可以在一個球蛋白分子上共價連接數個聚合物長鏈，聚合物長鏈的數目取決於蛋白質分子上可供結合的位點數(自由氨基和其他親電子基團)、修飾劑的化學性質，修飾劑的過量比例及反應條件。PEG的衍生物有芳化試劑(含氯化芳基基團，可以與蛋白質上的親核基團反應)、醯化試劑(含醯基，與蛋白質通過醯基鍵相連)或烷化試劑(與蛋白質上的氨基形成仲氨連接)。上述方法還存在活化的PEG對產物的多位點修飾，修飾產物的生物活性保留較低和修飾後產物難於純化的不足，不能滿足降纖酶在臨床應用方面的要求。

發明內容
本發明需要解決的技術問題是公開一種聚乙二醇修飾的降纖酶及其製備方法，以滿足降纖酶在臨床應用方面的需求。
本發明的具體的技術方案如下一種聚乙二醇修飾的降纖酶，其結構通式如下 其中m為單甲氧基(monomethoxy)的縮寫，n＝0～3；R代表去除一個氨基(NH2)的降纖酶分子。
本發明的特點是在降纖酶上連接聚乙二醇鏈。
所說的降纖酶包括從蛇毒中提取或用基因工程手段製備的重組降纖酶；所說的聚乙二醇鏈的分子量為2000～100000。
本發明的聚乙二醇修飾的降纖酶的製備方法包括如下步驟在降纖酶溶液中，加入磷酸氫二鈉溶液，調節其pH值在4.5-9.5，然後加入活化的聚乙二醇或其衍生物，反應溫度為4-40℃，反應時間為5～120分鐘，反應中活化的聚乙二醇或其衍生物與降纖酶的摩爾比為0.1～100，將反應混合液採用凝膠過濾色譜柱進行色譜分離，流動相為含NaCl的磷酸鹽緩衝液，即可得聚乙二醇修飾的降纖酶。
製備反應按下式進行
其中R-NH2為降纖酶。mPEG為CH3O-(CH2CH2O)n-CH2CH2OH其中m＝單甲氧基(monomethoxy)的縮寫，n＝44～2200；R代表代表去除一個氨基(NH2)的降纖酶分子。
所說的活化的聚乙二醇或其衍生物是本領域一般技術人員所公知的，並且描述於例如Robert MJ等，先進的藥物傳遞評論(Advanced DrugDilivery Reviews)(2002；54459-476)。最優選地，使用丙酸甲氧基聚乙二醇琥珀醯亞胺酯或丁酸甲氧基聚乙二醇琥珀醯亞胺酯，可採用美國NektarTherapeutics公司生產的產品。
本發明的聚乙二醇修飾的降纖酶可用於製備高效低毒的抗凝溶栓藥物。
本發明的聚乙二醇修飾的降纖酶能夠基本保持降纖酶的生物活性，同時它比未修飾的降纖酶有較低的免疫原性和更好的穩定性，因此作為抗凝溶栓藥物，它比未修飾的降纖酶有更大的優越性。本發明的聚乙二醇修飾的降纖酶的製備方法，簡單易行。


圖1是SDS-PAGE電泳檢測圖。
圖2是Superdex-75TM75 HR 10/30柱分析聚乙二醇修飾的降纖酶的層析圖。
圖3是Superdex-75TM75 HR 10/30柱分析降纖酶的層析圖。
具體實施例方式
實施例1丙酸甲氧基聚乙二醇琥珀醯亞胺酯5000(mPEG-SPA-5000)對降纖酶修飾條件的選擇反應溫度的選擇取0.8mg/ml的降纖酶溶液2ml，加2ml磷酸鹽緩衝液使溶液的pH值為6.5，再加入mPEG-SPA-5000固體0.12mg，溶解，混勻，各取0.3ml置於4支帶塞試管中，然後分別置於4℃、10℃、25℃和37℃反應30min後終止反應。比較修飾率，確定修飾條件。結果表明在這些溫度下都能得到聚乙二醇修飾的降纖酶，其中25℃的修飾率最高。
反應時間的選擇取0.8mg/ml的降纖酶溶液2ml，加2ml磷酸鹽緩衝液使溶液的pH值為6.5，再加入mPEG-SPA-5000固體0.12mg，溶解，混勻，各取0.3ml置於4支帶塞試管中，然後於25℃分別反應5、15、30、60、120min後終止反應。比較修飾率，確定修飾條件。結果表明在這些條件下都能得到聚乙二醇修飾的降纖酶，其中30min後的修飾率沒有明顯提高。
mPEG-SPA-5000同降纖酶的摩爾比的選擇反應溫度的選擇取0.8mg/ml的降纖酶溶液2ml，加2ml磷酸鹽緩衝液使溶液的pH值為6.5，各取0.3ml置於4支帶塞試管中，然後分別加入mPEG-SPA-5000固體0.0012、0.012、0.12、1.2mg(相當於mPEG-SPA-5000同降纖酶的摩爾比在0.1～100)，溶解，混勻，反應30min後終止反應。比較修飾率，確定修飾條件。結果表明在這些條件下都能得到聚乙二醇修飾的降纖酶，當mPEG-SPA-5000同降纖酶的摩爾比在10時修飾率已達到最高，進一步增加mPEG-SPA-5000的量修飾率也沒有明顯地增加。
反應pH值的選擇各取0.1mg/ml的降纖酶溶液2ml，置於6支帶塞試管中，分別加2ml不同pH值的磷酸鹽緩衝液使溶液的pH值為4.5、5.5、6.5、7.5、8.5、9.5，再加入mPEG-SPA-5000固體0.20mg，溶解，混勻，於25℃反應30min後終止反應。比較修飾率，確定修飾條件。結果表明在這些條件都能得到聚乙二醇修飾的降纖酶，其中pH值為6.5時修飾率最高。
實施例2修飾產物的分離純化與鑑定取1.1mg/ml的降纖酶溶液2ml，加磷酸鹽緩衝液使溶液的pH值為6.5，再加入mPEG-SPA-5000固體8.5mg，溶解，混勻，於25℃反應30min，加入3g甘氨酸固體終止反應。
取上述反應液，用截流分子量為10000的超濾膜濃縮至2ml，上柱分離。色譜條件如下層析填料Superdex 75 pre grade柱規格1.6×60cm流動相0.05M Na2HPO4-NaH2PO4，pH7.0流速0.5ml/min檢測波長215nm收集每管3ml結果得到兩個洗脫峰，分別為聚乙二醇修飾的降纖酶和降纖酶。
將上述兩個洗脫峰適當透析、濃縮，採用SDS-PAGE電泳檢測，分離膠10％，濃縮膠5％。結果見圖1，圖中，1為蛋白質分子量的標樣；2為降纖酶；3為聚乙二醇修飾的降纖酶，其表明各組分呈單一條帶。同時，用凝膠過濾分析柱(Superdex-75TM75 HR 10/30)檢測，各組分也為單一峰，結果見圖2-1和圖2-2。因此，確定得到了單一組分的聚乙二醇修飾的降纖酶。
實施例3 修飾產物的生物活性(比活力)測定(國家食品藥品監督管理局國家藥品標準降纖酶)用降纖酶標準品作為對照，測定標準品和樣品凝固纖維蛋白原的初凝時間，然後計算樣品的比活力(U/mg)。結果見表1。
表1降纖酶及聚乙二醇修飾的降纖酶的生物活性樣品比活力(U/mg)降纖酶 2500聚乙二醇修飾的降纖酶1500
實施例4聚乙二醇修飾的降纖酶穩定性的研究熱穩定性取降纖酶和聚乙二醇修飾的降纖酶(在液體狀態，無任何保護劑)，分別置於25℃、37℃、45℃、60℃條件下，定時取樣測定其生物活性。結果表明，降纖酶在60℃下15min內活性不變，而聚乙二醇修飾的降纖酶在90min內活性不變。在25℃時降纖酶5天內活性不變，而聚乙二醇修飾的降纖酶在15天內活性不變。因此，可以初步認為聚乙二醇修飾的降纖酶可以明顯增加降纖酶的熱穩定性。
酶穩定性取0.1％胰蛋白酶溶液(pH7.8)2.7ml，分別加入0.3ml降纖酶和聚乙二醇修飾的降纖酶樣品，37℃水浴，於0、0.5、1、2、4h取樣0.3ml，測定樣品的生物活性。結果表明降纖酶在0.5h內活性迅速降到原來的30％，而聚乙二醇修飾的降纖酶在1h內活性僅降到原來的40％。因此，聚乙二醇修飾的降纖酶能明顯增加降纖酶抵抗胰蛋白酶水解的能力。
實施例5聚乙二醇修飾的降纖酶對實驗動物的去纖維蛋白作用的研究對兔和大鼠兩種實驗動物分別由靜脈注射降纖酶和聚乙二醇修飾的降纖酶，在注藥前及注藥後1、3、6、12、24、36、48h靜脈採血，測量纖維蛋白原值。兩種降纖酶均為對兔靜脈一次給藥，劑量為1.25U/kg；對大鼠也為一次給藥，劑量為8U/kg。
兔給藥前纖維蛋白原的濃度為226±16.25mg/dl，給藥降纖酶後3h降至110±15.23mg/dl(降至原來的50.9％)，給藥後12h開始回升，24h回升至正常；給藥聚乙二醇修飾的降纖酶後3h降至108±16.72mg/dl(降至原來的47.8％)，給藥後24h開始回升，36h回升至正常。
大鼠給藥前纖維蛋白原的濃度為290±18.35mg/dl，給藥降纖酶後3h降至102±17.62mg/dl(降至原來的35.2％)，給藥後12h開始回升，24h回升至正常；給藥聚乙二醇修飾的降纖酶後3h降至91±16.26mg/dl(降至原來的31.4％)，給藥後24h開始回升，36h回升至正常。
以上結果表明聚乙二醇修飾的降纖酶在體內不但保留了降纖酶降低纖維蛋白原濃度的生理作用，而且能延長其作用時間。因此，預期在人體內聚乙二醇修飾的降纖酶會有更好的溶栓抗凝的效果。
實施例6聚乙二醇修飾的降纖酶對實驗動物免疫原性的研究以家兔作為製備抗血清的實驗動物，採用福氏佐劑免疫法，並分別以降纖酶和聚乙二醇修飾的降纖酶作為抗原，劑量均為5U/kg/次，每周1次，共5次。
分別以降纖酶和聚乙二醇修飾的降纖酶作為抗原，用雙向免疫擴散法測定它們各自抗血清的效價，測定結果為降纖酶組抗血清的效價為1∶16；聚乙二醇修飾的降纖酶組抗血清的效價測不出。
分別以降纖酶和聚乙二醇修飾的降纖酶作為抗原，然後用降纖酶組的抗血清作為第一抗體，再以辣根過氧化酶(HRP)標記的羊抗兔IgG作為第二抗體，用酶聯免疫吸附法(ELISA)測定它們各自的免疫原性，測定結果為降纖酶組為陽性，聚乙二醇修飾的降纖酶組為陰性。
以上結果表明，同降纖酶比較，聚乙二醇修飾的降纖酶的免疫原性顯著降低。
實施例7用丙酸甲氧基聚乙二醇琥珀醯亞胺酯2000(mPEG-SPA-2000)、丙酸甲氧基聚乙二醇琥珀醯亞胺酯10000(mPEG-SPA-10000)、丙酸甲氧基聚乙二醇琥珀醯亞胺酯20000(mPEG-SPA-20000)或丙酸甲氧基聚乙二醇琥珀醯亞胺酯30000(mPEG-SPA-30000)代替實施例1中的mPEG-SPA-5000，得到了實施例中1-6相似的結果。
實施例8用丁酸甲氧基聚乙二醇琥珀醯亞胺酯2000(mPEG-SBA-2000)、丁酸甲氧基聚乙二醇琥珀醯亞胺酯10000(mPEG-SBA-10000)、丁酸甲氧基聚乙二醇琥珀醯亞胺酯20000(mPEG-SBA-20000)或丁酸甲氧基聚乙二醇琥珀醯亞胺酯30000(mPEG-SBA-30000)代替實施例1中的mPEG-SPA-5000，得到了實施例中1-6相似的結果。
權利要求
1.一種聚乙二醇修飾的降纖酶，其特徵在於，結構通式如下 其中m為單甲氧基(monomethoxy)的縮寫，n＝0～3；R代表去除一個氨基(NH2)的降纖酶分子。
2.根據權利要求1所述的聚乙二醇修飾的降纖酶的製備方法，其特徵在於，在降纖酶溶液中，加入磷酸氫二鈉溶液，調節其pH值在4.5-9.5，然後加入活化的聚乙二醇或其衍生物，反應溫度為4-40℃，反應時間為5～120分鐘，然後採用凝膠過濾色譜柱進行色譜分離，即可得聚乙二醇修飾的降纖酶。
3.根據權利要求2所述的方法，其特徵在於，所說的降纖酶包括從蛇毒中提取或用基因工程手段製備的重組降纖酶。
4.根據權利要求2所述的方法，其特徵在於，所說的聚乙二醇鏈的分子量為2000～100000。
5.根據權利要求2所述的方法，其特徵在於，反應中活化的聚乙二醇或其衍生物與降纖酶的摩爾比為0.1～100。
6.根據權利要求2所述的方法，其特徵在於，採用凝膠過濾色譜柱進行色譜分離，流動相為含NaCl的磷酸鹽緩衝液。
7.根據權利要求2所述的方法，其特徵在於，活化的聚乙二醇或其衍生物為丙酸甲氧基聚乙二醇琥珀醯亞胺酯或丁酸甲氧基聚乙二醇琥珀醯亞胺酯。
8.根據權利要求1所述的聚乙二醇修飾的降纖酶的應用，其特徵在於，用於製備高效低毒的抗凝溶栓藥物。
全文摘要
本發明公開了一種聚乙二醇修飾的降纖酶及其製備方法。在降纖酶溶液中，加入磷酸氫二鈉溶液，然後加入活化的聚乙二醇或其衍生物進行反應，將反應混合液採用凝膠過濾色譜柱進行色譜分離，即可得聚乙二醇修飾的降纖酶。發明的聚乙二醇修飾的降纖酶能夠基本保持降纖酶的生物活性，同時它比未修飾的降纖酶有較低的免疫原性和更好的穩定性，因此作為抗凝溶栓藥物，它比未修飾的降纖酶有更大的優越性。本發明的聚乙二醇修飾的降纖酶的製備方法，簡單易行。所述聚乙二醇修飾的降纖酶，其結構通式如上。
文檔編號A61K38/43GK1563367SQ200410017779
公開日2005年1月12日 申請日期2004年4月20日 優先權日2004年4月20日
發明者馮軍, 趙文杰 申請人:上海醫藥工業研究院