一種製備富含多不飽和雙鍵脂肪醯基的磷脂醯絲氨酸的高品質南極磷蝦油的方法

2023-06-23 00:18:31

專利名稱：一種製備富含多不飽和雙鍵脂肪醯基的磷脂醯絲氨酸的高品質南極磷蝦油的方法
技術領域：
本發明涉及一種製備富含多不飽和雙鍵脂肪醯基的磷脂醯絲氨酸的高品質南極磷蝦油的方法，尤其涉及到一種以南極磷蝦中的磷脂醯膽鹼為原料經酶法催化製備富含多不飽和雙鍵脂肪醯基的磷脂醯絲氨酸，並將其復配得到高品質南極磷蝦油的方法。
背景技術：
現有技術中，有關磷脂醯絲氨酸的製備方法有多種，其中以提取法和酶轉化法為主。提取法是從動物磷脂中提取磷脂醯絲氨酸，主要以動物的大腦為原料。專利CN1583766A 就是以動物腦為原料提取磷脂醯絲氨酸。但由於狂牛症等原因，其產品安全性遭到懷疑， 現已被淘汰。近年來用大豆卵磷脂為原料酶法製備磷脂醯絲氨酸已經被廣泛使用，例如專利CN101230365A，但是這個專利形成的產品中並不含有多不飽和雙鍵長鏈脂肪醯基的磷脂醯絲氨酸。專利CN101818179A是以兩步酶法從普通的卵磷脂合成含多不飽和雙鍵脂肪醯基的磷脂醯絲氨酸，普通卵磷脂中的磷脂不含Omega-3多不飽和脂肪醯基，其第一步酶催化反應是採用磷脂酶Al、A2或脂肪酶催化含多不飽和雙鍵的脂肪酸與卵磷脂中的磷脂醯膽鹼生成含多不飽和雙鍵脂肪醯基的磷脂醯膽鹼，繼而採用磷脂酶D催化絲氨酸與含多不飽和雙鍵脂肪醯基的磷脂醯膽鹼的反應，最終生成含多不飽和雙鍵脂肪醯基的磷脂醯絲氨酸，該發明的不足之處在於原料卵磷脂和多不飽和脂肪酸均為複雜的混合物，其中的磷脂醯膽鹼和多不飽和脂肪酸的有效含量均不高，在未經高度濃縮的情況下，這兩種原料中的有效含量一般不超過50%，而在磷脂酶A2或特定於SN2位的脂肪酶的催化下生成目標產物SN2位為含多不飽和雙鍵脂肪醯基的磷脂醯膽鹼的概率很低，從而導致了最終生成的產物中含有的多不飽和雙鍵脂肪醯基的磷脂醯絲氨酸的濃度更低，這不利於最終產品的品質，如果要提高產品中多不飽和雙鍵脂肪醯基的磷脂醯絲氨酸的有效成份濃度，會嚴重增加生產成本。專利CN100402656C是以提取自魚肝中的磷脂為原料，專利CN101157946A以提取自魷魚中的磷脂為原料，採用磷脂酶D酶法催化魚肝中的磷脂醯膽鹼或魷魚中的磷脂醯膽鹼與L-絲氨酸反應製備富含多不飽和雙鍵脂肪醯基的磷脂醯絲氨酸，其中魚肝磷脂和魷魚磷脂中的富含多不飽和雙鍵脂肪醯基的磷脂醯膽鹼，是製備含多不飽和雙鍵脂肪醯基的磷脂醯絲氨酸的優良原料，但這兩種原料來源有限，不利於規模化生產。本發明人經多年研究探索，發現南極磷蝦中或南極磷蝦油中的磷脂類化合物含有極為豐富的二十碳五烯酸EPA和二十二碳六烯酸DHA，是Omega-3多不飽和脂肪酸的豐富來源，這些Omega-3多不飽和脂肪酸主要是結合在磷脂化合物分子的Sn2位，形成Sn2位為富含多不飽和脂肪醯基的磷脂，其中富含多不飽和脂肪醯基的磷脂醯膽鹼約佔南極磷蝦油總磷脂含量的30-40%， 而南極磷蝦總磷脂中的磷脂醯絲氨酸的含量卻很低，約只佔磷脂含量的到3%左右。因此將南極磷蝦中的富含多不飽和脂肪醯基的磷脂醯膽鹼轉化為富含多不飽和脂肪醯基的磷脂醯絲氨酸是一項非常有意義的課題。

發明內容
本發明的目的是針對現有技術不足之處而提供一種將現有南極磷蝦中的磷脂醯膽鹼轉化為磷脂醯絲氨酸的製備富含多不飽和雙鍵脂肪醯基的磷脂醯絲氨酸的高品質南極磷蝦油方法。本發明的目的還提供一種從現有南極磷蝦油製備富含多不飽和雙鍵脂肪醯基的磷脂醯膽鹼的方法。本發明的目的還提供一種製備富含多不飽和雙鍵脂肪醯基的磷脂醯絲氨酸的方法。本發明的目的通過以下措施來實現—種製備富含多不飽和雙鍵脂肪醯基的磷脂醯絲氨酸的高品質南極磷蝦油方法， 其特殊之處在於，製備經過下列步驟步驟一，對現有南極磷蝦油進行溶劑萃取得到磷脂醯膽鹼和含有維生素A、維生素 E和蝦青素的油脂；步驟二，配製酶催化反應體系，所述反應體系為水相反應體系；步驟三，將步驟二的反應體系加入到反應器中，在氮氣環境中、溫度為35 55攝氏度，投入磷脂梅D後持續機械攪拌，攪拌時間1 15小時；步驟四，將步驟三所得反應液重複萃取2 3次，過濾後將固體冷凍乾燥得富含多不飽和雙鍵脂肪醯基的磷脂醯絲氨酸；步驟五，將步驟四所得富含多不飽和雙鍵脂肪醯基的磷脂醯絲氨酸與步驟一獲得的含維生素A、維生素E和蝦青素的油脂混合得高品質南極磷蝦油，完成製備。步驟一所述萃取為現有南極磷蝦油與溶劑在反應器中混合後在氮氣環境中、0 30攝氏度下，經機械攪拌，反應0. 5 15小時，過濾後將固體冷凍乾燥得富含多不飽和雙鍵脂肪醯基的磷脂醯膽鹼。步驟一所述取得的磷脂醯膽鹼是為富含多不飽和雙鍵脂肪醯基的磷脂醯膽鹼族， 該磷脂醯膽鹼族含有十幾個磷脂醯膽鹼分子系列，其中每一個分子系列的化學結構有以下相同和不同⑴在甘油基的3位即Sn-3上都連接一個膽鹼；(2)在甘油基的1位Sn-I和 2位Sn-2上各自連接一個脂肪醯基，而在2位Sn-2上通常連接一個含多不飽和雙鍵的長鏈脂肪醯基，所述的富含多不飽和雙鍵脂肪醯基，其含義為Sn-2位連接的脂肪醯基中有高於 5%以上的脂肪醯基含有2個以上的不飽和雙鍵，或其含義為Sn-2位連接的脂肪醯基中有高於3%以上的脂肪醯基含有Omega-3不飽和雙鍵；(3)含有的不飽和雙鍵脂肪醯基含18 至22個碳原子，而雙鍵的數目通常為三至六個，所述不飽和雙鍵脂肪醯基屬Omega-3不飽和脂肪酸家族係指二十二碳六稀酸脂肪醯基和二十碳五稀酸脂肪醯基。步驟二所述水相反應體系為富含多不飽和雙鍵脂肪醯基的磷脂醯膽鹼、L-絲氨酸、鈣鹽和緩衝溶液配製成的水溶液反應體系，所述水溶液反應體系中各物質的配比關係如下磷脂醯膽鹼在每升反應液中加入的重量百分比為100，L-絲氨酸在每升反應液中加入的重量百分比為60 300，鈣鹽在每升反應液中加入的重量百分比為0. 05 10，緩衝溶液中緩衝鹽的濃度則為0 2個摩爾/升，水溶液的pH值在5. 0 8. 5內。本發明的另一個目的一種從現有南極磷蝦油製備富含多不飽和雙鍵脂肪醯基的磷脂醯膽鹼的方法，製備步驟為對現有南極磷蝦油進行溶劑萃取；所述溶劑可在下列物品中任選食品安全級的正庚烷或正己烷、食用乙醇或丙酮、或者是它們的混合物；所述萃取為現有南極磷蝦油與溶劑在反應器中混合後在氮氣環境中、0 30攝氏度下，經機械攪拌，反應0. 5 15小時，過濾後將固體冷凍乾燥得富含多不飽和雙鍵脂肪醯基的磷脂醯膽鹼。本發明的第三個目的一種製備富含多不飽和雙鍵脂肪醯基的磷脂醯絲氨酸的方法，製備經過下列步驟步驟一，對現有南極磷蝦油進行溶劑萃取或直接由市場購得磷脂醯膽鹼；所述萃取按下列步驟萃取溶劑可在下列物品中任選食品安全級的正庚烷或正己烷、食用乙醇或丙酮、或者是它們的混合物；所述萃取為現有南極磷蝦油與溶劑在反應器中混合後在氮氣環境中、0 30攝氏度下，經機械攪拌，反應0. 5 15小時，過濾後將固體冷凍乾燥得富含多不飽和雙鍵脂肪醯基的磷脂醯膽鹼；步驟二，配製酶催化反應體系，包括水相反應體系或水相與有機溶劑相組成的兩相反應體系；步驟三，將步驟二得水溶液反應體系加入到反應器中，在氮氣環境中、溫度為 35 55攝氏度，投入磷脂梅D後持續機械攪拌，繼持時間1 15小時後，將所得反應液重複萃取2 3次，過濾後將固體冷凍乾燥得富含多不飽和雙鍵脂肪醯基的磷脂醯絲氨酸，完成製備。所述水相反應體系由現有南極磷蝦油製備的富含多不飽和雙鍵脂肪醯基的磷脂醯膽鹼配製酶催化反應體系，其由富含多不飽和雙鍵脂肪醯基的磷脂醯膽鹼、L-絲氨酸、鈣鹽和緩衝溶液配製成的水溶液反應體系，所述水溶液反應體系中各物質的配比關係如下 磷脂醯膽鹼在每升反應液中加入的重量百分比為100，L-絲氨酸在每升反應液中加入的重量百分比為60 300，鈣鹽在每升反應液中加入的重量百分比為0. 05 10，緩衝溶液中緩衝鹽的濃度則為0 2個摩爾/升，水溶液的pH值在5. 0 8. 5內。所述水相與有機溶劑相組成的兩相反應體系為步驟一中市購的磷脂醯膽鹼配製酶催化反應體系，其為先把富含多不飽和雙鍵脂肪醯基的磷脂醯膽鹼溶入C5-C9烷烴有機溶劑，後再加入到含有L-絲氨酸、鈣鹽、短鏈烴醇或短鏈烴酮和緩衝溶液配製成的水溶液中，從而形成水相和有機溶劑兩相混合的反應體系，所述水溶液和有機溶劑兩相混合反應體系中各物質的配比關係如下磷脂醯膽鹼在每升混合反應液中加入的重量百分比為 100，L-絲氨酸在每升反應液中加入的重量百分比為60 300，鈣鹽在每升反應液中加入的重量百分比為0. 05 10，緩衝溶液中緩衝鹽的濃度則為0 2摩爾/升，C5-C9烷烴有機溶劑在混合反應液中佔有的體積百分比為5% 95%，短鏈烴醇或短鏈烴酮在總混合反應液中佔有體積百分比為 80%，水溶液和有機溶劑兩相混合反應體系的pH值在5. 0 8. 5 內。所述C5-C8烷烴有機溶劑為從下列物品中任選戊烷、己烷、環己烷、庚烷、辛烷、 壬烷、癸烷或它們的同分異構體中的任何一種溶劑或這些溶劑以任何比例混合形成的混合溶劑。所述短鏈烴醇或短鏈烴酮為從下列物品中任選乙醇、丙醇、丁醇、戊醇、丙酮、丁酮或它們的同分異構體中的任何一種溶劑或這些溶劑以任何比例混合形成的混合溶劑。與現有技術相比，本發明具有如下優點1)本發明的第一個優勢是利用來源於南極磷蝦油的富含多不飽和雙鍵脂肪醯基的磷脂醯膽鹼或南極磷蝦油本身為反應物，利用磷脂酶D生物轉化方法製備得到富含多不飽和雙鍵脂肪醯基的磷脂醯絲氨酸。產品原料易得，反應簡單實用。2)本發明的第二個優勢，是將多不飽和雙鍵脂肪醯基的磷脂醯絲氨酸與南極磷蝦油或提取磷脂醯膽鹼後的南極磷蝦油混合，提高南極磷蝦油產品中多不飽和雙鍵脂肪醯基的磷脂醯絲氨酸的含量。最終得到的產品可用於高級營養品和保健品，也可添加入食品、藥品或化妝品中使用。


圖1為南極磷蝦磷脂醯膽鹼與轉化形成的磷脂醯絲氨酸分子結構式的異同點。圖2為在磷脂酶D的催化下由磷脂醯膽鹼生成磷脂醯絲氨酸的反應示意圖。為更好地理解本發明的內容，先就圖1作說明圖中，Sn-1、Sn-2和Sn_3分別指南極磷蝦中的磷脂中甘油酯基團的1位、2位和3位；Rl和R2為長碳鏈脂肪醯基，Sn-I位的-Rl常見的有-C15H31、-C17H35、-C17H33,若其為-C15H31,則說明Rl來自十六碳酸或棕櫚酸，-C15H31與其相連的羰基基團構成一個十六碳脂肪醯基，表示在Sn-I位是一個十六碳酸與甘油的Sn-I位醇形成的酯；若其為-C17H35,則說明Rl來自十八碳酸或硬脂酸，-C17H35與其相連的羰基基團構成一個十八碳脂肪醯基，表示在Sn-I位是一個十八碳酸與甘油的Sn-I 位醇形成的酯；若其為-C17H33,則說明Rl來自十八碳酸或油酸，-C17H33與其相連的羰基基團構成一個十八碳脂肪醯基，表示在Sn-I位是一個十八碳酸與甘油的Sn-I位醇形成的酯。 Sn-2 位的-R2 常見的有-C17H31、-C19H29、-C19H31、-C21H31、-C17H33，若其為-C17H31，則說明 R2 來自十八碳二稀酸或亞油酸，-C17H31與其相連的羰基基團構成一個十八碳二稀脂肪醯基，表示在Sn-2位是一個十八碳二稀酸與甘油的Sn-2位醇形成的酯；若其為-C19H29,則說明R2 來自二十碳五稀酸或EPA，-C19H29與其相連的羰基基團構成一個二十碳五稀脂肪醯基，表示在Sn-2位是一個二十碳五稀酸與甘油的Sn-2位醇形成的酯；若其為-C19H31，則說明R2 來自二十碳四稀酸或花生四烯酸，-C19H31與其相連的羰基基團構成一個二十碳四稀脂肪醯基，表示在Sn-2位是一個二十碳四稀酸與甘油的Sn-2位醇形成的酯；若其為-C21H31，則說明R2來自二十二碳六稀酸，-C21H31與其相連的羰基基團構成一個二十二碳六稀脂肪醯基， 表示在Sn-2位是一個二十二碳六稀酸與甘油的Sn-2位醇形成的酯；若其為-C17H33,則說明 R2來自十八碳稀酸或油酸，-C17H33與其相連的羰基基團構成一個十八碳稀脂肪醯基，表示在Sn-2位是一個十八碳稀酸與甘油的Sn-2位醇形成的酯。Sn_3位的-X為不同的連接基團，若其為-CH2CH2N (CH3) 3，則表示該磷脂化合物為磷脂醯膽鹼；若其為-CH2CH (NH2) C00H,則該磷脂化合物為磷脂醯絲氨酸。圖2給出了在磷脂酶D的催化下由磷脂醯膽鹼生成磷脂醯絲氨酸的反應示意圖。 在本發明公開的反應條件下，磷脂酶D可以催化磷脂醯膽鹼生成磷脂醯絲氨酸，分子式的意義是指，一個分子的磷脂醯膽鹼可以和一個分子的L-絲氨酸發生反應，生成一個分子的磷脂醯絲氨酸同時生成一個分子的膽鹼。
具體實施例方式一種製備富含多不飽和雙鍵脂肪醯基的磷脂醯絲氨酸的高品質南極磷蝦油方法， 製備經過下列步驟
步驟一，對現有南極磷蝦油採用溶劑萃取得磷脂醯膽鹼和過濾液去溶劑後的油月旨。所述溶劑可在下列物品中任選食品安全級的正庚烷或正己烷、食用乙醇或丙酮、或者是它們的混合物。所述萃取為南極磷蝦油與溶劑在反應器混合後在氮氣環境中、O 30攝氏度下，經機械攪拌，反應0.5 15小時，過濾後將固體冷凍乾燥得磷脂醯膽鹼。所述取得的磷脂醯膽鹼是富含多不飽和雙鍵脂肪醯基的磷脂族，該磷脂醯膽鹼族含有十幾個磷脂醯膽鹼分子系列，其中每一個分子系列的化學結構有以下相同和不同(1)在甘油基的3位即Sn-3上都連接一個膽鹼；(2)在甘油基的1位Sn-I和2位Sn_2上各自連接一個脂肪醯基，而在2位Sn-2上通常連接一個含多不飽和雙鍵的長鏈脂肪醯基，所述的富含多不飽和雙鍵脂肪醯基，其含義為Sn-2位連接的脂肪醯基中有高於5%以上的脂肪醯基含有2個以上的不飽和雙鍵，或其含義為Sn-2位連接的脂肪醯基中有高於3%以上的脂肪醯基含有 0mega-3不飽和雙鍵；(3)含有的不飽和雙鍵脂肪醯基含18至22個碳原子，而雙鍵的數目通常為三至六個，所述不飽和雙鍵脂肪醯基屬Omega-3不飽和脂肪酸家族係指二十二碳六稀酸脂肪醯基和二十碳五稀酸脂肪醯基。步驟二，配製酶催化的反應體系。所述反應體系為水相反應體系，其由現有的南極磷蝦油製取的富含多不飽和雙鍵脂肪醯基的磷脂醯膽鹼來配製，其由富含多不飽和雙鍵脂肪醯基的磷脂醯膽鹼、L-絲氨酸、鈣鹽和緩衝溶液配製成的水溶液反應體系，所述水溶液反應體系中各物質的配比關係如下磷脂醯膽鹼在每升反應液中加入的重量百分比為100， L-絲氨酸在每升反應液中加入的重量百分比為60 300，鈣鹽在每升反應液中加入的重量百分比為0. 05 10，緩衝溶液中緩衝鹽的濃度則為0 2個摩爾/升，水溶液的pH值在 5. 0 8. 5 內。本步驟中，L-絲氨酸商品化的生物產品；鈣鹽為可溶性鈣鹽，本實施例採用的是氯化鈣和硫酸鈣，在水中的濃度可為0. 1克每升至20克每升；緩衝液為常規水緩衝液， 例如磷酸鹽水緩衝液或醋酸鹽水緩衝液，一般為0至0. 2摩爾每升鹽濃度體系。步驟三，將步驟二的反應體系加入到反應器中，在氮氣環境中、溫度為35 55攝氏度，投入磷脂梅D後持續機械攪拌，攪拌轉速為IOOrpm，攪拌時間為2 15小時。本步驟中，磷脂酶D 是一種酶，是來源於鏈黴菌和/或植物的商品化酶製劑，如 Sigma-Aldrich 公司(St. Louis,M0, U. S. Α.)出售的磷脂酶 D (phospholipase D)，該酶也可純化自鏈黴菌的發酵液。步驟四，將步驟三所得反應液重複萃取2 3次，過濾後將固體冷凍乾燥得富含多不飽和雙鍵脂肪醯基的磷脂醯絲氨酸。本步驟中萃取溶劑及萃取方法與步驟一中相同。步驟五，將步驟四所得富含多不飽和雙鍵脂肪醯基的磷脂醯絲氨酸與步驟一過濾液去溶劑後的油脂混合得高品質南極磷蝦油，完成製備。按此方法製備的高品質南極磷蝦油中的磷脂醯絲氨酸含量能高於40%。本發明的另一個目的一種從現有南極磷蝦油製備富含多不飽和雙鍵脂肪醯基的磷脂醯膽鹼的方法，製備步驟為對現有南極磷蝦油進行溶劑萃取；所述溶劑可在下列物品中任選食品安全級的正庚烷或正己烷、食用乙醇或丙酮、或者是它們的混合物；所述萃取為現有南極磷蝦油與溶劑在反應器中混合後在氮氣環境中、0 30攝氏度下，經機械攪拌，反應0. 5 15小時，過濾後將固體冷凍乾燥得富含多不飽和雙鍵脂肪醯基的磷脂醯膽鹼。
本發明的第三個目的一種製備富含多不飽和雙鍵脂肪醯基的磷脂醯絲氨酸的方法，製備經過下列步驟步驟一，與從現有南極磷蝦油製備富含多不飽和雙鍵脂肪醯基的磷脂醯膽鹼的方法相同；步驟二，配製酶催化反應體系，包括水相反應體系或水相與有機溶劑相組成的兩相反應體系；所述水相反應體系為直接由由現有的南極磷蝦油製取的富含多不飽和雙鍵脂肪醯基的磷脂醯膽鹼來配製，該步驟與製備富含多不飽和雙鍵脂肪醯基的磷脂醯絲氨酸的高品質南極磷蝦油方法的步驟二相同，所不同的是還可以採取如下措施所述水相與有機溶劑相混合而成的兩相反應體系由市購的磷脂醯膽鹼配製，其先由磷脂醯膽鹼溶入C5-C9 烷烴有機溶劑，後加入到含有L-絲氨酸、鈣鹽、短鏈烴醇或短鏈烴酮和緩衝溶液配製成的水溶液和有機溶劑兩相混合反應體系，所述水溶液和有機溶劑兩相混合反應體系中各物質的配比關係如下磷脂醯膽鹼在每升混合反應液中加入的重量百分比為100，L-絲氨酸在每升反應液中加入的重量百分比為60 300，鈣鹽在每升反應液中加入的重量百分比為 0. 05 10，緩衝溶液中緩衝鹽的濃度則為0 2摩爾/升，C5-C9烷烴有機溶劑在混合反應液中佔有的體積百分比為5% 95%，短鏈烴醇或短鏈烴酮在總混合反應液中佔有體積百分比為1 % 80%，水溶液和有機溶劑兩相混合反應體系的pH值在5. 0 8. 5內。所述C5-C8烷烴有機溶劑為從下列物品中任選戊烷、己烷、環己烷、庚烷、辛烷、 壬烷、癸烷或它們的同分異構體中的任何一種溶劑或這些溶劑以任何比例混合形成的混合溶劑。所述短鏈烴醇或短鏈烴酮為從下列物品中任選乙醇、丙醇、丁醇、戊醇、丙酮、丁酮或它們的同分異構體中的任何一種溶劑或這些溶劑以任何比例混合形成的混合溶劑。步驟三，將步驟二得反應體系加入到反應器中，在氮氣環境中、溫度為35 55攝氏度，投入磷脂梅D後持續機械攪拌，繼持時間1 15小時後，將所得反應液重複萃取2 3次，過濾後將固體冷凍乾燥得富含多不飽和雙鍵脂肪醯基的磷脂醯絲氨酸，完成製備。本發明採用下述分析條件多不飽和脂肪酸相對含量分析方法參考專利CN101818178A所述方法，具體的如下樣品經適量氯仿溶解，然後經6000rpm離心20min，將有機相層製備成20_100mg/ mL的樣品氯仿溶液，取有機相點於薄波層矽膠板上，然後經展開劑展開，展開劑為氯仿 水甲醇=63.5 3.5 25 (V V V)，經2』，7』-二氯螢光素顯色，然後連同矽膠刮下磷脂醯絲氨酸所在位置的譜帶，甲酯化後經氣相色譜儀(GC)分析，利用面積歸一法計算各種脂肪酸相對含量。色譜條件為儀器Agilent 6890氣相色譜儀檢測器氫火焰離子檢測器(FID)毛細管柱:FFAP30.OmX 2. 5mmX0. IOym進樣口溫度220°C ；柱溫200°C ；檢測器溫度250°C ；進樣量:1 μ L ；進樣分流比20 1 ；氮氣流速0. 6mL/min樣品中磷脂醯膽鹼，磷脂醯絲氨酸含量的分析方法如下磷脂醯膽鹼和磷脂醯絲氨酸標準品購買於Sigma-Aldrich公司(St. Louis, MO,U. S. Α.)，其餘試劑均為液相色譜純度級別。磷脂醯膽鹼標準曲線繪製取300mg磷脂醯膽鹼標準品溶解於3mL氯仿溶劑中，製備出5mg/mL，10mg/mL, 20mg/mL,40mg/mL,80mg/mL, lOOmg/mL磷脂醯膽鹼氯仿待測樣品，將該上述系列樣品經高相液相色譜儀(HPLC)分析，繪製出磷脂醯膽鹼質量-積分面積標準曲線。待測樣品中磷脂醯膽鹼含量測定待測樣品溶解於適量氯仿，然後與6000rpm下離心20min，將有機相層製備成 20-40mg/mL的樣品氯仿溶液，將該樣品經高相液相色譜儀(HPLC)分析，根據待測樣品中磷脂醯膽鹼峰積分面積，利用上述磷脂醯膽鹼質量-積分面積標準曲線計算待測樣品中磷脂醯膽鹼的絕對含量。具體計算方法為PCPC質量/樣品質量X 100%磷脂醯絲氨酸標準曲線繪製取300mg磷脂醯絲氨酸標準品溶解於3mL氯仿溶劑中，製備出5mg/mL，10mg/mL, 20mg/mL, 40mg/mL, 80mg/mL, lOOmg/mL磷脂醯絲氨酸氯仿待測樣品，將該上述系列樣品經高相液相色譜儀(HPLC)分析，繪製出磷脂醯絲氨酸質量-積分面積標準曲線。待測樣品中磷脂醯絲氨酸含量測定將待測樣品溶解於適量氯仿中，然後在6000rpm下離心20min，將有機相層製備成 20-40mg/mL的樣品氯仿溶液，將該樣品經高相液相色譜儀(HPLC)分析，根據待測樣品中磷脂醯絲氨酸峰積分面積，利用上述磷脂醯絲氨酸質量-積分面積標準曲線計算待測樣品中磷脂醯絲氨酸的絕對含量。具體計算方法為磷脂醯絲氨酸％=磷脂醯絲氨酸質量/樣品質量X 100%色譜條件為儀器Agilent 1200高效液相色譜儀；檢測器G1314B紫外檢測器；檢測波長205nm ；分析柱Kromasil，KR100-5SIL，(250mmX4.6mm)；柱溫30°C ；流動相乙腈甲醇85%磷酸=900 95 5(V V V)；流速1.0mL/min。以下對本發明在具體應用中的最佳實施例進行詳細說明，這些實施例並非對本發明的範圍進行約束。實施例1 富含多不飽和雙鍵脂肪醯基的磷脂醯膽鹼的萃取。稱取20公斤南極磷蝦油，其含磷脂中EPA為19. 3%，DHA為11. 5%，PC含量為 36. 3 %，磷脂醯絲氨酸含量為1. 5 %，40升丙酮，將上述兩種原料加入到100升反應器中，向反應器中充入氮氣，零攝氏度下，持續機械攪拌，80rpm,反應2至15小時，結束反應，過濾，將固體冷凍乾燥得到富含多不飽和雙鍵脂肪醯基的磷脂醯膽鹼13公斤，其中EPA為18.3%，DHA為8.1%，PC含量為47. 8 %，磷脂醯絲氨酸含量為2. 4%，另將過濾液在20攝氏度下減壓濃縮去除溶劑，得到7公斤紅棕色油脂。實施例2 富含有磷脂醯絲氨酸的精煉南極磷蝦油稱取10公斤南極磷蝦油，其含磷脂中EPA為19. 3%，DHA為11. 5%，PC含量為 36.3%,磷脂醯絲氨酸含量為1. 5%，4至6公斤L-絲氨酸，0. 1至0. 8公斤氯化鈣，20升至100升pH5. 5至pH8. 5範圍內的水緩衝液，加入到150升反應器中，在氮氣保護下，投入0. 1 至1升磷脂酶D (約2萬至50萬單位)，於45-53攝氏度範圍內，持續機械攪拌，IOOrpm,反應 2至15小時停止攪拌，結束反應，加入丙酮10到50公斤，再加入10到50公斤正庚烷，持續機械攪拌，30rpm, 0. 5小時後停止攪拌，靜置分層，取有機相，依照前述方法重複萃取2到3 次，集合有機萃取液，在20攝氏度下減壓濃縮，獲得9. 5公斤富含有磷脂醯絲氨酸的南極磷蝦油，磷脂中不飽和脂肪酸含量經GC檢測為26. 7%，其中EPA為17. 2%，DHA為9. 5%，磷脂中PC含量經HPLC檢測為2. 7%，磷脂醯絲氨酸含量為31. 8%。實施例3 富含多不飽和雙鍵脂肪醯基的磷脂醯絲氨酸精品稱取10公斤實施例1製備得到的南極磷蝦磷脂醯膽鹼，其中，磷脂中EPA為 18. 3 %，DHA為8. 1 %，PC含量為47. 8 %，磷脂醯絲氨酸含量為2. 4 %，12至20公斤L-絲氨酸，0. 4-1. 5公斤氯化鈣，50升至120升ρΗ5· 5至ρΗ8· 5範圍內的水緩衝液，加入到150升反應器中，在氮氣保護下，投入0. 1至2升磷脂酶D 100萬單位，於45-53攝氏度範圍內，持續機械攪拌，IOOrpm,反應2至15小時，結束反應，加入乙醇10到60公斤，正己烷10到60公斤，持續機械攪拌，30rpm，0. 5小時後停止攪拌，靜置分層，取有機相，依照前述方法重複進行2到4次萃取，匯集有機萃取液，在20攝氏度下減壓濃縮，獲得富含多不飽和雙鍵脂肪醯基的磷脂醯絲氨酸粗品，再加入丙酮10到50公斤，持續機械攪拌，80rpm，0. 5小時後停止攪拌，過濾，將固體冷凍乾燥得到8. 6公斤富含多不飽和雙鍵脂肪醯基的磷脂醯絲氨酸精品， 其PC含量經HPLC檢測為5. 5 %，磷脂醯絲氨酸含量經HPLC檢測為43. 9 %，磷脂中EPA經 GC 檢測為 17. 5%，DHA 為 7. 9%。實施例4 富含多不飽和雙鍵脂肪醯基的磷脂醯絲氨酸將實施例1製備得到的磷脂醯膽鹼3公斤，其中含磷脂中EPA為18. 3%，DHA為 8. 1%, PC含量為47. 8%，磷脂醯絲氨酸含量為2. 4%，4至10公斤L-絲氨酸，0. 2至0. 8 公斤氯化鈣，20升至40升pH5. 5至pH8. 5範圍內的水緩衝液，加入到100升反應器中，向反應器中充入氮氣，投入0. 1至1升磷脂酶D約2萬至50萬單位，於45-53攝氏度範圍內， 持續機械攪拌，IOOrpm,反應2至15小時，結束反應，加入丙酮5到25公斤，攪拌，再加入5 到25公斤正庚烷，持續機械攪拌，30rpm，0. 5小時後停止攪拌，靜置分層，取有機相，依照前述方法重複萃取2到3次，集合有機萃取液，在20攝氏度下減壓濃縮，獲得2. 8公斤油狀黃色富含多不飽和雙鍵脂肪醯基的磷脂醯絲氨酸，其PC含量經HPLC檢測為8. 5%，磷脂醯絲氨酸含量經HPLC檢測為36. 4%，磷脂中EPA經GC檢測為17. 1 %，DHA為7. 3%。實施例5 富含多不飽和雙鍵脂肪醯基的磷脂醯絲氨酸南極磷蝦油將實施例4製備得到的2. 8公斤磷脂醯絲氨酸和實施例1製備得到的7公斤紅棕色油脂，加入20升反應器中，向反應器中充入氮氣，0到10攝氏度下，持續機械攪拌， IOOrpm,，反應2至15小時，結束反應，得到富含多不飽和雙鍵脂肪醯基的磷脂醯絲氨酸南極磷蝦油9. 8公斤，其PC含量經HPLC檢測為10. 5 %，磷脂醯絲氨酸含量經HPLC檢測為 10.8%，磷脂醯絲氨酸中的EPA經GC檢測為17. 1%，DHA為7.3%。實施例6 富含多不飽和雙鍵脂肪醯基的磷脂醯絲氨酸精煉南極磷蝦油稱取10公斤南極磷蝦油，其中含磷脂中EPA含量為19. 3%，DHA含量為11. 5%， PC含量為36. 3%，磷脂醯絲氨酸含量為1. 5% ；由實施例3製得5公斤磷脂醯絲氨酸，其中磷脂醯絲氨酸含量為43.9%，EPA含量為17.5%，DHA含量為7.9% ；加入20升反應器中，向反應器中充入氮氣，零攝氏度下，持續機械攪拌，IOOrpm,，反應2至15小時，結束反應，得到富含多不飽和雙鍵脂肪醯基的磷脂醯絲氨酸南極磷蝦油15公斤，磷脂醯絲氨酸含量經 HPLC檢測為18. 6%，磷脂中EPA經GC檢測為17. 6%，DHA為7. 8%。實施例7 富含多不飽和雙鍵脂肪醯基的磷脂醯絲氨酸精品稱取10公斤實施例1製備得到的南極磷蝦磷脂醯膽鹼，其中EPA為18. 3%，DHA 為8. 1 %，PC含量為47. 8%，磷脂醯絲氨酸含量為2. 4%，溶入15至40升的正己烷，加入12 至20公斤L-絲氨酸、0. 4-1. 5公斤氯化鈣，5至20升的丙酮或丙醇，50升至100升pH5. 5 至pH8. 5範圍內的水緩衝液，加入到150升反應器中，在氮氣保護下，投入0. 1至2升磷脂酶D 100萬單位，於45-53攝氏度範圍內，持續機械攪拌，IOOrpm,反應2至15小時，結束反應，再加入正己烷0到50升，持續機械攪拌，30rpm，0. 5小時後停止攪拌，靜置分層，取有機相，依照前述方法重複進行2到4次萃取，匯集有機萃取液，在20攝氏度下減壓濃縮，獲得富含多不飽和雙鍵脂肪醯基的磷脂醯絲氨酸粗品，再加入乙醇10到30升，持續機械攪拌， SOrpm, 0. 5小時後停止攪拌，過濾，將固體冷凍乾燥得到8. 6公斤富含多不飽和雙鍵脂肪醯基的磷脂醯絲氨酸精品，其PC含量經HPLC檢測為5. 5%，磷脂醯絲氨酸含量經HPLC檢測為 43. 5%，磷脂中 EPA 經 GC 檢測為 17. 3%，DHA 為 7. 6%。在此說明書中，本發明已參照其特定的實施例作了描述。但是，很顯然仍可以做出各種修改和變換而不背離本發明的精神和範圍，一個有本專業知識的普通技術人員，仍可以根據本專利所傳授的技術，在本發明的範圍內產生其它的實施例，但是凡是未脫離本發明技術方案的內容，依據本發明的技術實質對以上實施例所作的任何簡單修改、等同變化與修飾，均仍屬於本發明技術方案的範圍內。
權利要求
1.一種製備富含多不飽和雙鍵脂肪醯基的磷脂醯絲氨酸的高品質南極磷蝦油的方法， 其特徵在於步驟一，對現有南極磷蝦油進行溶劑萃取得到磷脂醯膽鹼和含有維生素A、維生素E和蝦青素的油脂；步驟二，配製酶催化反應體系，所述反應體系為水相反應體系；步驟三，將步驟二的反應體系加入到反應器中，在氮氣環境中、溫度為35 55攝氏度， 投入磷脂梅D後持續機械攪拌，攪拌時間1 15小時；步驟四，將步驟三所得反應液重複萃取2 3次，過濾後將固體冷凍乾燥得富含多不飽和雙鍵脂肪醯基的磷脂醯絲氨酸；步驟五，將步驟四所得富含多不飽和雙鍵脂肪醯基的磷脂醯絲氨酸與步驟一獲得的含維生素A、維生素E和蝦青素的油脂混合得高品質南極磷蝦油，完成製備。
2.根據權利要求1所述的製備富含多不飽和雙鍵脂肪醯基的磷脂醯絲氨酸的高品質南極磷蝦油的方法，其特徵在於，步驟一所述萃取為現有南極磷蝦油與溶劑在反應器中混合後在氮氣環境中、0 30攝氏度下，經機械攪拌，反應0. 5 15小時，過濾後將固體冷凍乾燥得富含多不飽和雙鍵脂肪醯基的磷脂醯膽鹼。
3.根據權利要求1所述的製備富含多不飽和雙鍵脂肪醯基的磷脂醯絲氨酸的高品質南極磷蝦油的方法，其特徵在於，步驟一所述取得的磷脂醯膽鹼是為富含多不飽和雙鍵脂肪醯基的磷脂醯膽鹼族，該磷脂醯膽鹼族含有十幾個磷脂醯膽鹼分子系列，其中每一個分子系列的化學結構有以下相同和不同(1)在甘油基的3位即Sn-3上都連接一個膽鹼；(2) 在甘油基的1位Sn-I和2位Sn-2上各自連接一個脂肪醯基，而在2位Sn_2上通常連接一個含多不飽和雙鍵的長鏈脂肪醯基，所述的富含多不飽和雙鍵脂肪醯基，其含義為Sn-2 位連接的脂肪醯基中有高於5%以上的脂肪醯基含有2個以上的不飽和雙鍵，或其含義為 Sn-2位連接的脂肪醯基中有高於3%以上的脂肪醯基含有Omega-3不飽和雙鍵；(3)含有的不飽和雙鍵脂肪醯基含18至22個碳原子，而雙鍵的數目通常為三至六個，所述不飽和雙鍵脂肪醯基屬Omega-3不飽和脂肪酸家族係指二十二碳六稀酸脂肪醯基和二十碳五稀酸脂肪醯基。
4.據權利要求1所述的製備富含多不飽和雙鍵脂肪醯基的磷脂醯絲氨酸的高品質南極磷蝦油的方法，其特徵在於，步驟二所述水相反應體系為富含多不飽和雙鍵脂肪醯基的磷脂醯膽鹼、L-絲氨酸、鈣鹽和緩衝溶液配製成的水溶液反應體系，所述水溶液反應體系中各物質的配比關係如下磷脂醯膽鹼在每升反應液中加入的重量百分比為100，L-絲氨酸在每升反應液中加入的重量百分比為60 300，鈣鹽在每升反應液中加入的重量百分比為 0. 05 10，緩衝溶液中緩衝鹽的濃度則為0 2個摩爾/升，水溶液的pH值在5. 0 8. 5 內。
5.一種從現有南極磷蝦油製備富含多不飽和雙鍵脂肪醯基的磷脂醯膽鹼的方法，其特徵在於，對現有南極磷蝦油進行溶劑萃取；所述溶劑可在下列物品中任選食品安全級的正庚烷或正己烷、食用乙醇或丙酮、或者是它們的混合物；所述萃取為現有南極磷蝦油與溶劑在反應器中混合後在氮氣環境中、0 30攝氏度下，經機械攪拌，反應0. 5 15小時，過濾後將固體冷凍乾燥得富含多不飽和雙鍵脂肪醯基的磷脂醯膽鹼。
6.一種製備富含多不飽和雙鍵脂肪醯基的磷脂醯絲氨酸的方法，其特徵在於，採取如下步驟步驟一，對現有南極磷蝦油進行溶劑萃取或直接由市場購得磷脂醯膽鹼；所述萃取按下列步驟萃取溶劑可在下列物品中任選食品安全級的正庚烷或正己烷、食用乙醇或丙酮、或者是它們的混合物；所述萃取為現有南極磷蝦油與溶劑在反應器中混合後在氮氣環境中、0 30攝氏度下，經機械攪拌，反應0. 5 15小時，過濾後將固體冷凍乾燥得富含多不飽和雙鍵脂肪醯基的磷脂醯膽鹼；步驟二，配製酶催化反應體系，包括水相反應體系或水相與有機溶劑相組成的兩相反應體系；步驟三，將步驟二得水溶液反應體系加入到反應器中，在氮氣環境中、溫度為35 55 攝氏度，投入磷脂梅D後持續機械攪拌，繼持時間1 15小時後，將所得反應液重複萃取 2 3次，過濾後將固體冷凍乾燥得富含多不飽和雙鍵脂肪醯基的磷脂醯絲氨酸，完成製備。
7.根據權利要求6所述的製備富含多不飽和雙鍵脂肪醯基的磷脂醯絲氨酸的方法，其特徵在於，步驟二所述水相反應體系由現有磷蝦油製備的富含多不飽和雙鍵脂肪醯基的磷脂醯膽鹼、L-絲氨酸、鈣鹽和緩衝溶液配製成的水溶液反應體系，所述水溶液反應體系中各物質的配比關係如下磷脂醯膽鹼在每升反應液中加入的重量百分比為100，L-絲氨酸在每升反應液中加入的重量百分比為60 300，鈣鹽在每升反應液中加入的重量百分比為 0. 05 10，緩衝溶液中緩衝鹽的濃度則為0 2個摩爾/升，水溶液的pH值在5. 0 8. 5 內。
8.根據權利要求6所述的製備富含多不飽和雙鍵脂肪醯基的磷脂醯絲氨酸的方法，其特徵在於，步驟二所述水相與有機溶劑相組成的兩相反應體系為步驟一中市購的磷脂醯膽鹼配製酶催化反應體系，其為先把富含多不飽和雙鍵脂肪醯基的磷脂醯膽鹼溶入C5-C9烷烴有機溶劑，後再加入到含有L-絲氨酸、鈣鹽、短鏈烴醇或短鏈烴酮和緩衝溶液配製成的水溶液中，從而形成水相和有機溶劑兩相混合的反應體系，所述水溶液和有機溶劑兩相混合反應體系中各物質的配比關係如下磷脂醯膽鹼在每升混合反應液中加入的重量百分比為100，L-絲氨酸在每升反應液中加入的重量百分比為60 300，鈣鹽在每升反應液中加入的重量百分比為0. 05 10，緩衝溶液中緩衝鹽的濃度則為0 2摩爾/升，C5-C9烷烴有機溶劑在混合反應液中佔有的體積百分比為5% 95%，短鏈烴醇或短鏈烴酮在總混合反應液中佔有體積百分比為 80%，水溶液和有機溶劑兩相混合反應體系的pH值在 5. 0 8. 5 內。
9.根據權利要求8所述的製備富含多不飽和雙鍵脂肪醯基的磷脂醯絲氨酸的方法，其特徵在於，所述C5-C8烷烴有機溶劑為從下列物品中任選戊烷、己烷、環己烷、庚烷、辛烷、 壬烷、癸烷或它們的同分異構體中的任何一種溶劑或這些溶劑以任何比例混合形成的混合溶劑。
10.根據權利要求8所述的製備富含多不飽和雙鍵脂肪醯基的磷脂醯絲氨酸的方法， 其特徵在於，所述短鏈烴醇或短鏈烴酮為從下列物品中任選乙醇、丙醇、丁醇、戊醇、丙酮、 丁酮或它們的同分異構體中的任何一種溶劑或這些溶劑以任何比例混合形成的混合溶劑。
全文摘要
本發明涉及一種製備富含多不飽和雙鍵脂肪醯基的磷脂醯絲氨酸的高品質南極磷蝦油的方法。包括以下步驟1)對現有南極磷蝦油進行溶劑萃取得到磷脂醯膽鹼和含有維生素A、維生素E和蝦青素的油脂；2)配製酶催化反應體系，所述反應體系為水相反應體系；3)將反應體系加入到反應器中，投入磷脂梅D後持續機械攪拌；4)將所得反應液重複萃取，過濾後將固體冷凍乾燥得富含多不飽和雙鍵脂肪醯基的磷脂醯絲氨酸；5)將所得富含多不飽和雙鍵脂肪醯基的磷脂醯絲氨酸與步驟1獲得的油脂混合得高品質南極磷蝦油。本發明還提供從現有南極磷蝦油製備富含多不飽和雙鍵脂肪醯基的磷脂醯膽鹼的方法，以及製備富含多不飽和雙鍵脂肪醯基的磷脂醯絲氨酸的方法。
文檔編號C07F9/10GK102485899SQ201010573719
公開日2012年6月6日 申請日期2010年12月3日 優先權日2010年12月3日
發明者吳萍, 張永志, 梁水英, 沈連紅, 王秀蘭, 謝春定 申請人:張永志