用於探測微生物的存在並確定它們的生理狀態的方法和裝置的製作方法
2023-06-23 09:06:26 1
專利名稱：用於探測微生物的存在並確定它們的生理狀態的方法和裝置的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種用於檢驗空氣或液體中非活體表面上微生物(細菌、黴菌、原生動物、立克次體和/或微生物)和孢子存在的方法和裝置。
在現實世界的樣品中呼吸細胞的探測用上述方法更易於實施的原因有二。首先，用多種激發能量同時激發微生物並確保同時探測大量螢光信號減少了幹涉的機會，因為幹涉源複製大量螢光團的特徵的可能性非常小。其次，已經發現本徵代謝物以及由此導致的螢光信號的相對量落在限定的生理範圍之內。信號的分析用一種能夠有後面兩種功能的方法實現(1)把探測到的起源於任何存在的微生物的螢光信號與幹涉或背景信號和/或散射激發信號分開，和(2)滿足從微生物代謝物、微生物組份和孢子成分發出的信號強度落在生理範圍之內的要求。因此，探測樣品中微生物的基本原理由下列步驟組成第一，用細胞代謝物、微生物成分和孢子成分的多種特徵激發能同時激發樣品；第二，隨後收集大量的各個螢光團信號(與這些受激代謝物的最大和最小輻射有關)；和最後，用一種能夠消除背景螢光團並將代謝物的相對信號幅值與已知的生理範圍比較的方法分析收集到的信號。
用於微生物探測的長期建立的技術和方法依賴於由代謝反應、免疫捕獲或期望核苷酸序列的放大導致的產物的探測。因為本發明採取從微生物中探測多個本徵螢光團與分析由這些螢光團產生的信號相對量的分析結合，所以不僅可以判定微生物的存在與否，而且還能夠區分活細胞、非活細胞和孢子。這種方法和裝置不用反應試劑、不需要與樣品物理接觸，並且「實時」傳輸結果。
還有其它採用螢光的微生物探測方法。許多流式細胞計數法依賴於與作為分析物目標的免疫蛋白共軛的染料分子的螢光。在美國專利US4,745,285(Recktenwald等)中可以找到這樣的一個例子。其它的螢光法採用附加的螢光代謝染料或染料共軛物(Peeters的美國專利US4,900,934)。
有一些基於螢光的微生物探測法利用本徵細胞螢光團。一種方法(Reyes等的美國專利US5,424,959)簡單地將樣品螢光譜和頻譜庫比較。Alfano的美國專利US5,474,910中描述的一種方法將樣品表面的螢光與清潔表面比較。用在微生物探測法中的盛行的本徵螢光團是還原的吡啶核苷酸NADH。在Ho的美國專利US5,701,012中，在包含樣品的強制氣流中探測NADH螢光團並與空白試驗比較。或者，在Powers的美國專利(US5,760,406和US5,968,760)中，採用NADH螢光團與散射的激勵信號或其它螢光輻射之比。
在分別於1998年6月2日和1999年10月19日提交的並在此引為參考的美國專利US5,760,406和US5,968,760中，公開了一種探測非活體表面和樣品上的微生物的方法和設備。用波長大於350nm的電磁輻射(1)激發待檢樣品以促使存在於微生物細胞中的吡啶核苷酸激發，並且用波長小於340nm的電磁輻射(2)激發該樣品以測量其它的環境特徵。計算並比較微生物吡啶核苷酸螢光團輻射(由不同波長的激發導致)與反射的激發信號之比，作為探測和量化樣品中存在的微生物的根據。本發明能夠對非活體表面包括肉類上的微生物定位和定量。
鑑於Powers的前述發明對於單一代謝物的探測依據於螢光比率，本發明利用一種或多種螢光團的激發，結合一種減去由於散射/反射激發能導致的探測信號的算法。在設計和方法學上的這種區別使本發明比其它螢光法能夠更好地探測和量化在液體和空氣中的非活體表面的微生物。本發明在微生物的探測方面較為優越，因為多個本徵螢光團的探測減少了背景幹擾導致的假陽性結果的概率。使用前述方法和設備的微生物探測用於生物戰用毒劑探測、細胞分選、醫學診斷、滅菌檢驗、水質量測試、食物生產和製品的安全性，並且用於擔負探測、淨化汙染和公共基礎設施的保護的應激反應部隊。
隨著近來關於食物(肉食、家禽、海鮮、漿汁、水果和蔬菜)中細菌汙染的宣布，有了一種對提供可用於探測食物中、食物上和食物製品表面上的微生物汙染的方法和設備的需求。作為本發明目的的此方法和設備例如應該能在肉類和家禽生產設施中經濟且快捷的操作。
本發明的另一個目的在於提供一種用在食物上微生物汙染探測的方法和設備，其中通過電磁輻射激發吡啶核苷酸、黃素和其它協同因子以及孢子成分的螢光團，從而識別代謝反應以及食品組織中微生物的孢子成分，使得能夠不與所述食物接觸地判定食物上的微生物汙染。
根據本發明的另一個目的，提供一種可以用在探測液體和空氣中非活體表面上的微生物汙染的方法和設備。作為本發明的一個特定的目的，本方法和設備可以用於例如健康檢查設備、實驗室研究、水處理和測試站、公共建築和戰場上經濟且快捷地查找微生物和微生物汙染。
本發明的另一個目的在於提供一種用於探測非活體表面及液體和空氣中微生物汙染的方法和設備，其中通過電磁輻射激發吡啶核苷酸、黃素和其它協同因子及孢子成分的螢光團，從而從介質或散射背景中區分微生物的代謝反應和/或孢子的存在，使得能夠不與樣品接觸地確定樣品中的微生物汙染。
本發明的另一個目的在於提供一種用於在存活細胞、非存活細胞、孢子和無汙染樣品之間進行區分的方法和設備，其中通過每個具有不同相對量的本徵螢光團的電磁輻射激發吡啶核苷酸、黃素和其它協同因子以及孢子成分的螢光團，從而從介質或散射背景中區分微生物的存在。
發明概述本發明的主要方案在於提供一種用於微生物探測的方法和設備，其中樣品暴露在大量特定能量的電磁輻射之下，這種特定的能量能夠從各種代謝物、協同因子和細胞以及孢子成分中激發出螢光團。因而，其中包含的被取樣的微生物細胞和孢子(以及更具體地說是受激代謝物、協同因子和/或其它細胞、病毒和/或孢子成分)發射可以被探測的螢光。利用這樣一種方法分析收集到的螢光信號(與細胞/病毒/孢子成分發出的最大和/或最小信號有關)該方法(1)能夠消除任何背景或反射/散射激發信號，和(2)將代謝物、協同因子和孢子成分的相對螢光信號與已知的生理範圍進行比較。
因此，本發明的方法和設備提供了一種不與樣品接觸即可掃描樣品、從而探測和定量微生物汙染的經濟且快捷的方式。不接觸地評估樣品中的微生物汙染減小了引入汙染的風險。
根據本發明的此種形式，通常可以利用發射200nm以上的電磁輻射的光源。根據本發明的形式，光源發射的光限於或被濾波成通過能激發吡啶核苷酸、黃素、卟啉(porphorys)、協同因子和/或2，6-吡啶二羧酸鈣的電磁能。
根據本發明的另一實施例，可以將紫外電磁輻射能(波長在200和300nm之間)導向樣品。紫外光激發芳族胺基酸和核酸，它們的部分輻射被樣品自吸收，結果激發2，6-吡啶二羧酸鈣和吡啶核苷酸，而部分輻射被樣品自吸收，反過來激發協同因子(如黃素)，部分輻射用於激發卟啉和其它黃素。如前所述地收集並分析樣品的螢光輻射。紫外光的使用導致樣品較淺的取樣穿刺深度。
根據本發明的另一實施例，可以導向能夠激發特定的代謝物、協同因子和細胞/孢子成分的電磁輻射能以及不與微生物發生相互作用的輻射能。因此，根據本發明的本實施例，可以通過比較微生物的輻射信號與樣品的反射/散射比來測量從樣品(從微生物成分發出的螢光信號和從樣品反射/散射的螢光信號)發出的螢光信號並確定微生物的存在。
根據本發明的實踐，不僅用傳感器探測本徵螢光團產生的螢光，而且還探測反射或散射的電磁輻射。這樣對信號歸一化並補償信號中可能由於在探針和被掃描樣品之間改變距離導致的偏差以及不同樣品或表面之間的偏差。
還發現通過迅速改變以不同於60Hz的頻率導向樣品的電磁輻射可以基本上把環境光(尤其是螢光)的影響減到最小。激發能的調製還使得能夠移動傳感器，從而在基本上不影響測量微生物含量的精確度的情況下把電磁輻射導向樣品的不同部位。
大多數市場上的微生物探測器依賴於微生物培養，以獲得之後用於物種(屬)識別的不同代謝測試的應用所需的足夠大的樣品(生長物)。但是，需要細菌生長物的技術可能不能探測存活的但不能培養的細胞。反之，採用的生長介質可能對具有特定表型的細菌的生長有利。
其它的微生物探測方法依賴於微生物本身或它們的組分的免疫捕獲。最通行的免疫測定法-酶鏈免疫吸附法(ELISA)具有最好的幾百個細胞的探測極限(這遠遠低於非常強的傳染性細菌，如弗氏志賀氏菌(Shigella flexneri)的ID50)。這些技術同樣有很嚴重的問題，因為採用的抗體對pH值、離子濃度和溫度的變化非常敏感。導向微生物組分的抗體不僅在開發和製備方面很昂貴，而且在「汙穢」樣品中易於受到許多蛋白水解酶的分解。另外，附著在表面(如微孔板或磁珠)上的抗體分子的密度不象通常所需的那樣高。
更靈敏但不太迅速的鑑定方案利用聚合酶鏈式反應(PCR)放大細菌DNA或RNA以及隨後的核酸排序，以探測特殊菌種的存在。這種一般的放大和排序技術要求技術專家進行操作，並且不適於在專門的實驗室條件以外的地方使用。基於PCR的技術利用存在微生物這一結果，因為這種技術只提供對整體目標核酸序列而不一定是微生物的陽性分析。而且，在環境樣品中特定微生物的探測由於幹涉「汙穢」或真實樣品中目標DNA有效放大的材料的存在而難以進行。
在樣品溶解或熱解之後對揮發性細胞成分的質譜分析被用於探測細菌和病毒。不幸的是，因為微生物的揮發性組分的組成隨著不同的生長環境條件而變化，所以分析物的識別不可靠。
基於免疫學、質譜和PCR的方法將均不能夠斷定樣品中的微生物是否存活。基於免疫學的和PCR的方法都採用較為昂貴的需要特殊處理的反應試劑。此處所述的微生物探測法和設備能夠確定探測到的細菌、黴菌、原生動物和立克次體的生存能力。該方法和設備不需要反應試劑，不與樣品接觸，操作不昂貴，「實時」傳輸結果。通過下面對優選實施例的詳細描述以及權利要求書，本發明的這些及其它優點將變得更為明顯。
附圖簡述
圖1是本發明最基本特點的框圖；圖2是採用345nm的輻射激發時低發螢光介質中細菌(蘇雲金芽孢桿菌(Bacillus thuringiensis))溶液的發射譜，其中實線表示細菌的發射譜，虛線表示瑞利散射對該譜線所起的作用；圖3表示(背景去除後)由於在不同波長處受激的各種本徵螢光團，存活細胞、非存活細胞和孢子(蘇雲金芽孢桿菌)溶液的發射譜；圖4表示溶液中蘇雲金芽孢桿菌的存活細胞、非存活細胞和孢子之間螢光信號的分布差(背景去除後歸一到440nm的輻射)；圖5表示背景去除後22種菌種的440nm到480nm螢光輻射率的分布；圖6表示本發明實施例中還原吡啶核苷酸(RPN)螢光輻射對無菌表面上存活的和非存活的傷寒沙門氏菌(Salmonella typhi)細胞輻射的響應曲線；圖7表示火雞表面大腸埃希氏桿菌(Escherichia coli)的RPN螢光輻射的響應曲線；圖8表示紙張和各種信封樣品的螢光發射譜中的頻譜窗；圖9表示本發明實施例中背景校正的780nm的螢光通道對密封的信封中幾百萬蘇雲金芽孢桿菌孢子的響應曲線。
發明的詳細描述本發明所述設備的基本元件示於圖1中的框圖。該設備由光源、激發濾波器、聚焦光學元件、會聚光學元件、發射濾波器和探測器組成。電磁輻射從光源指向樣品，如果需要的話，經激發濾波器和聚焦光學元件激勵樣品中的本徵螢光團。散射及反射的激發輻射與發射的螢光輻射一起被會聚光學元件會聚並導向探測器。發射濾波器確保只測量到感興趣的能量。
包括不同結構並使用發散元件的本發明的各個實施例是可行的。微生物探測法的基本元件允許激發多個微生物本徵螢光團，會聚並探測發射的和反射/散射的光能量，並利用能夠校正背景幹擾和比較相對信號強度與已知生理學參數的方法分析探測到的信號。在利用此方法的任何設備中採用的結構和元件應該與應用的要求以及預料到的幹涉相匹配。
利用一種能夠提供寬帶照明的光源是可行的並且有時也是需要的。採用的光源類型受光源能產生激發感興趣的本徵微生物組分所需波長的電磁輻射的能力影響。另外，有時希望採用一種能夠在中止周期期間測量環境背景的脈衝光源。可以使用的光源包括用於所需激發能的各種燈泡(如汞、鎢、氘、氙)的燈，發光二極體(LED)和二極體雷射器。使用的光源的種類依據於必需的激發輻射的強度和所需探測範圍。
用在本發明各個實施例中的激發和發射濾波器包括幹涉濾波器、浸漬玻璃、截止濾波器系列、明膠濾波器、單色儀和光柵等。使用的發射濾波器的光截止特徵依據於其分析法可以承受的散射和反射激發輻射信號的多少或者需要怎樣的探測範圍。如果採用只有所需能量的光源，則激發濾波器可能就不是必需的；如果光源是準直的(如雷射)，則可能就不需要聚焦光學元件。(聚焦光學元件的目的是將激發輻射導向抽樣區域或空間)。注意到採用多光子激發是很重要的，它可以使用能量小於感興趣螢光團的激發能的光源。
會聚光學元件的目的是把從受激微生物螢光團發出的光以及從樣品散射和反射的光傳輸到探測器。如果用幹涉濾波器鑑別這些輻射能量，則需要為這些濾波器對匯集的光束準直以優化操作。也可以用光纖光纜把激發輻射傳輸到樣品並會聚發出的輻射，將它們導向探測器。因為許多光學元件在紫外和可見波段顯示螢光，所以有時希望並且可以利用拋光的金屬反射體、藍寶石、熔融矽、石英、MgF2、和/或CaF2光學元件。
探測器用於把發出的電磁輻射轉變成可以測量的電信號。有很多不同靈敏度的探測器可以用於
具體實施例方式光電倍增管(PMTs)、雪崩光電二極體(APDs)、針形二極體、CCD等。選擇的探測器依據於待測的輻射的能量，發射信號的強度以及設備所需的探測限度。
用一種能夠去除任何背景螢光和散射的激發輻射的方法分析被轉變成放大電信號的會聚的發射能量。用於特定實施例中的激發和發射能量的選取依據於目標微生物呵它們預期的生理狀態。表I列出了在各種微生物(和蛋白質毒物)中發現的一些更豐富的本徵螢光化合物的激發和輻射範圍並表示每種存在的可能性。(蛋白質微生物毒物可以利用本方法和設備以類似於病毒檢測的方式檢測)。
表I.微生物螢光團的激發和發射範圍
(在表I中，ATP為三磷酸腺苷，RPN指還原的吡啶核苷酸)圖2表示當用345nm的光激發時，發螢光最少的介質中細菌溶液的發射譜(蘇雲金芽孢桿菌)。實線表示觀察到的細菌發射譜，虛線表示瑞利散射對該譜線的作用。從觀察到的頻譜中減去瑞利散射背景產生由於345nm的光激發的代謝物所致的實際發射譜(圖3D)。由波長λ處的瑞利散射產生的背景量值可以由方程I＝A/λ4+C表示。(在此方程中，I是入射光強度；A由實驗條件決定；常數C的值主要由用於收集數據的儀器特徵決定)。用325nm、345nm和570nm的光激發時的細菌溶液的合併發射譜在接近515nm和850nm處最小。用在515nm和850nm處測得的螢光強度由前述方程計算未知值A和C，最終能夠從探測信號中減去背景信號。瑞利散射背景減法特別適合於液體和空氣樣品；其他的樣品介質顯示出不同的背景並且可以用合適的方法(如Mie散射等)處理。
圖3表示存活細菌、非存活細菌和孢子溶液(蘇雲金芽孢桿菌)由於在280nm(A)，315nm(B)，325nm(C)，345nm(D)，570nm(E)和660nm(F)處激發的不同本徵螢光團所產生的減去背景的發射譜。圖4表示在所述存活細胞(A)、非存活細胞(B)和孢子(C)溶液之間的螢光信號的顯著差異(減去背景散射之後歸一到440nm的發射譜)。該分析方法利用活細胞、非存活細胞和孢子溶液之間的這些差異區分這些樣品。探測到的並減去了背景散射的信號量值用於量化樣品中的微生物數量。
在本發明的實施例中，利用325nm、345nm和570nm的激發濾波器將能夠探測和區分存活細胞、死亡細胞和孢子。這些激發濾波器將能夠激發還原的吡啶核苷酸、各種黃素、2，6-吡啶二羧酸鈣、血紅素蛋白和其他成分。用於受激螢光團發射譜探測的濾波器的選擇包括那些在405nm、440nm、480nm和650nm的濾波器；這些濾波器對應於受激螢光團的發射譜的最大值。另外，其他發射濾波器(545nm和850nm)使得能夠確定反射/散射背景的量值。為了達到低的探測限度，構成下列結構。用脈衝氙燈作為具有幹涉激發濾波器的光源。加入聚焦光學元件以在到達幹涉濾波器之前準直光束。聚焦光學元件和會聚光學元件由拋光的反射光學元件構成，消除了任何背景螢光。會聚大約90％發射信號的拋物面會聚光學元件與幹涉發射濾波器、準直光學元件和PMT裝配在一起。儀器的功能、數據匯集、積分和分析由微控制器控制。
在本發明的實施例中，探測法要求探測到的和校正了背景的信號的相對比例處於一定的生理範圍之內。對不止二十種的不同菌種和孢子的500多份樣品進行的分析表明，大量的比例可以用於確保統計學顯著的鑑別。圖5隻表示22種菌種中的一個比例(減去背景之後440nm/480nm之比)，由此限定了該探測法要求的生理範圍。該方法還可以從無菌介質和其他生化緩衝液中識別包含細菌的溶液。利用各種方法和下列比例(650/405,405/440,480/440,650/440,405/480和650/480)，如Neyman-Pearson測試、模糊邏輯和訓練的神經網絡(利用多層感知器)，這些方法分別給出探測細菌存在的概率為99％、95.6％和100％。(這些探測法對500個數據點發出錯誤信息的概率為Neyman-Pearson(0.01％)，模糊邏輯(0％)，和神經網絡(0％))。
圖6表示用於玻璃載片的表面上存活和非存活傷寒沙門氏菌細胞的儀器的發射譜數據(RPN)。此螢光信號中存活細胞和非存活信號的差異很清楚。圖7表示在火雞表面上對大腸埃希氏桿菌的RPN發射響應。探測限度遠遠低於用其他微生物的探測法的探測限度，不需要反應劑或觸碰肉體表面而實時觀測。
在本發明的另一個實施例中，用以570nm和660nm為中心的LED來激發在圖3D和3F中所示孢子和死細胞中發現的成分。圖8表示當用660nm的光激發時紙張和各種信封樣品時的發射譜；圖中的箭頭表示在此激發中預期的孢子和非活體的發射位置。因為紙張和信封包含此頻譜窗，所以可以探測到紙張後面及信封內部的細菌內生孢子。作為在610nm和680nm之間激發在前述頻譜窗中發螢光的孢子成分所得的非活體細胞成分的發射譜，有時希望並且可以包括在570nm的激發譜。圖9表示信封和密封在同樣信封內部的凍幹的蘇雲金芽孢桿菌孢子樣品在780nm背景校正過的螢光信號方面的差異。利用本發明的實施例，可以迅速探測信封中的孢子，不需要反應劑、樣品處理、與樣品接觸或打開信封。
以上所述的本發明實施例意在舉例，利用上述基本原理的其他結構、變化和改型對於本領域的技術人員都是顯而易見的，不會背離本發明的實質。探測微生物的本方法和設備的範圍包括利用同時激發多個本徵微生物螢光團，隨後利用描述背景信號並要求所述信號處於生理範圍內的方法分析探測到的發射譜。所有的變化、改型和結構都將落在本發明權利要求限定的範圍之內。
權利要求
1.一種探測微生物的方法，包括a.激發至少一個具有在200nm以上電磁輻射濃長範圍的本徵微生物螢光團；由此激發包含本徵螢光團的微生物以發射螢光，和；b.探測與最大和最小的受激微生物螢光團有關的螢光信號，和；c.從探測到的受激微生物螢光團的信號中減去反射/散射激發能量和背景；由此通過探測到的螢光的大小決定微生物的數量。
2.如權利要求1所述的方法，其特徵在於確定多個探測到的背景校正過的信號之相對比例；由此根據下列要求探測微生物的生理狀態背景校正過的螢光信號的比例處於特定的生理範圍以及由相對比例處於所需範圍的探測到的信號的大小決定微生物的數量。
3.如權利要求1所述的方法，其特徵在於從以下組中選取微生物螢光團核酸聚合物、含色氨酸的蛋白質、含酪氨酸的蛋白質、三磷酸腺苷、2，6-吡啶二羧酸鈣、還原吡啶核苷酸、黃素、含卟啉的蛋白質、以及其他在610-670nm波段被激發的成分。
4.如權利要求1所述的方法，其特徵在於待測的存活微生物包括細菌、黴菌、原生動物和立克次體；用於探測微生物的本徵微生物螢光團包括核酸聚合物、含酪氨酸的蛋白質、含色氨酸的蛋白質、三磷酸腺苷還原吡啶核苷酸、黃素、含卟啉的蛋白質以及其他在610-670nm波段被激發的成分。
5.如權利要求1所述的方法，其特徵在於待測的非存活微生物包括細菌、黴菌、原生動物和立克次體；用於探測微生物的本徵微生物螢光團包括核酸聚合物、含色氨酸的蛋白質、含酪氨酸的蛋白質、還原吡啶核苷酸、黃素、含卟啉的蛋白質以及其他在610-670nm波段被激發的成分。
6.如權利要求1所述的方法，其特徵在於測待微生物是細菌內生包子，用於探測內生包子的本徵螢光團包括核酸聚合物、含酪氨酸的蛋白質、含色氨酸的蛋白質，2，6-吡啶二羧酸鈣以及其他在610-670nm波段被激發的成分。
7.如權利要求1所述的方法，其特徵在於測待微生物包括病毒，用於探測病毒的本徵螢光團包括核酸聚合物、含酪氨酸的蛋白質和含色氨酸的蛋白質。
8.一種用於探測微生物的方法，包括a.用波長在200nm～300nm範圍的紫外電磁輻射激發多個微生物本徵螢光團，由此使存在包含本徵螢光團的任何微生物受到激發，發出螢光，其中有一些螢光是自吸收的，它們反過來激發其他的微生物螢光團發射螢光。b.探測與最大和最小的受激微生物螢光團有關的螢光信號，和；c.從反射/散射激發能量中減去螢光，並從探測到的信號中減去背景；和d.確定多個處於生理範圍之內的探測到的背景校正過的信號之相對比例，由此通過相對比例處於生理範圍之內的探測到的信號大小決定微生物的數量。
9.如權利要求8所述的方法，其特徵在於所述微生物的本徵微生物螢光團包括下列成分的一種或多種核酸聚合物、含色氨酸的蛋白質、三磷酸腺苷和2，6-吡啶二羧酸鈣化合物。
10.如權利要求8所述的方法，其特徵在於二次激發的微生物螢光團包括下列成分的一種或多種2，6-吡啶二羧酸鈣、還原吡啶核苷酸、黃素，含卟啉的蛋白質以及在610～670nm波段激發的細胞成分等。
11.如權利要求8所述的方法，其特徵在於待測的存活微生物包括細菌、黴菌、原生動物和立克次體；用於探測微生物的本徵微生物螢光團包括核酸聚合物、含酪氨酸的蛋白質、含色氨酸的蛋白質、三磷酸腺苷、還原吡啶核苷酸、黃素、含卟啉的蛋白質以及其他在610-670nm波段被激發的細胞成分。
12.如權利要求8所述的方法，其特徵在於待測的非存活微生物包括細菌、黴菌、原生動物和立克次體；用於探測微生物的本徵微生物螢光團包括核酸聚合物、含酪氨酸的蛋白質、含色氨酸的蛋白酸、還原吡啶核苷酸、黃素、含卟啉的蛋白質以及其他在610-670nm波段被激發的細胞成分。
13.如權利要求8所述的方法，其特徵在於待測的微生物是細菌孢子，用於探測孢子的本徵螢光團包括核酸聚合物、含酪氨酸的蛋白質、含色氨酸的蛋白質、2，6-吡啶二羧酸鈣、以及其他在610-670nm波段被激發的孢子成分。
14.一種用於探測非活體表面上或空氣或液體中微生物的設備，包括a.用於把電磁輻射導向樣品的裝置，該裝置適於發射至少能夠激發一個本徵微生物螢光團的輻射能量；b.至少一個電磁輻射探測器，該探測器能夠把發射或反射/散射的輻射轉換成電信號，適於探測在320nm波長以上的電磁輻射，從而探測與所述微生物螢光團的螢光發射有關的最大值和最小值；和c.用於分析對應於本徵微生物螢光團的螢光的電信號以及反射/散射的激發能量以判斷微生物存在的裝置。
15.如權利要求1所述的方法，其特徵在於電磁波以時間調製脈衝導向微生物。
16.如權利要求14所述的設備，其特徵在於導引電磁波的裝置包括時間調製電磁輻射的裝置。
17.一種用於探測微生物蛋白質毒物的方法，包括a.激發至少一個具有在200nm以上電磁輻射波長範圍的本徵微生物螢光團；由此激發包含本徵螢光團的微生物以發射螢光，和；b.探測與最大和最小的受激微生物螢光團有關的螢光信號，和；c.從探測到的受激微生物螢光信號中減去反射/散射激發能量和背景；由此通過探測到的背景校正過的螢光大小決定微生物毒物的數量。
18.如權利要求17所述的方法，其特徵在於微生物螢光團選自含色氨酸的蛋白質和含酪氨酸的蛋白質。
19.一種用於探測非活體細菌和孢子的方法，包括a.激發至少一個具有特定的在550-700nm波長之間電磁輻射範圍的本徵微生物螢光團；由此激發包含本徵螢光團的微生物以發射螢光，和；b.探測與最大和最小的受激微生物螢光團有關的螢光信號，和；c.從探測到的受激微生物螢光信號中減去反射/散射激發能量和背景；由此通過探測到的背景校正過的螢光大小決定非存活細菌和孢子的數量。
20.如權利要求19所述的方法，其特徵在於確定多個探測到的背景校正過的信號之相對比例；由此根據下列要求區別孢子和非存活細菌背景校正過的螢光信號的比例處於特定的生理範圍以及由相對比例處於所需範圍的探測到的信號的大小決定微生物的數量。
21.如權利要求19所述的方法，其特徵在於用於探測非活體細菌和細菌孢子的本徵微生物螢光團從包括黃素、含卟啉的蛋白質以及其他在610-670nm波段被激發的成分的組中選取微生物螢光團。
22.如權利要求19所述的方法，其特徵在於穿過低探測紙信封的表面、內部、溶液或氣體中的非存活細菌和細菌孢子。
23.一種用於探測孢子和非活體細菌的方法，包括a.激發多個具有在550-640nm波長之間電磁輻射範圍的本徵微生物螢光團；由此激發包含本徵螢光團的孢子和非活體細菌以發射螢光，其中的部分螢光被自吸收，反過來激發其他孢子螢光團發射螢光；b.探測與最大和最小的受激微生物螢光團有關的螢光信號，和；c.從探測到的信號中減去反射/散射激發能量發出的螢光和背景；和d.判斷探測到的背景校正過的信號之相對比例處於生理範圍；由此通過相對比例處於生理範圍的探測導的信號大小決定非存活細菌和細菌孢子的數量。
24.如權利要求23所述的方法，其特徵在於所述微生物的本徵微生物螢光團包括下列成分的一種或多種黃素、含卟啉蛋白質以及其它在610nm-670nm波段區域被激發的成分。
25.如權利要求23所述的方法，其特徵在於二次激發的微生物螢光團包括在610nm-680nm波段區域被激發的本徵成分組成的組等等的一種和多種。
26.如權利要求23所述的方法，其特徵在於穿過紙探測信封表面、內部、溶液或氣體中的非存活細菌和孢子。
27.如權利要求23所述的方法，其特徵在於探測紙信封內部的非存活細菌和孢子，並且通過受激紙產品的輻射激發二次受激微生物螢光團。
全文摘要
本發明公開了一種用於探測液體、空氣中和非活體表面上微生物的方法和設備，其中樣品暴露於能夠激發各種代謝物、協同因子和細胞及孢子成分的特定能量的電磁輻射之下，待取樣的微生物細胞包含於這些成分中(更具體地說是受激的代謝物，協同因子和/或其他細胞成分)，發射出可以被測得的螢光。從微生物成分的螢光信號中減去背景信號及散射激發信號，要求本徵微生物成分的相對螢光信號處於生理範圍之內，並且用背景校正的螢光信號的大小算出樣品中的微生物含量。
文檔編號C12Q1/04GK1434285SQ0214797
公開日2003年8月6日 申請日期2002年10月31日 優先權日2002年1月22日
發明者L·S·鮑爾斯, C·R·洛伊德 申請人:微生物系統有限合夥公司