一種死谷芽孢桿菌的發酵培養方法及微生物肥料生產方法
2023-06-23 02:37:16 3
專利名稱：一種死谷芽孢桿菌的發酵培養方法及微生物肥料生產方法
技術領域：
本發明涉及一種微生物的發酵培養方法，具體涉及一種芽孢桿菌的發酵培養方法、及由該發酵液製得微生物肥料的方法。
背景技術：
近年來，極端天氣狀況頻發，尤其是乾旱氣候，全國各地幾乎都不能倖免。2009年連續3個多月，華北、黃淮、西北、江淮等地15個省、市未見有效降水，冬小麥告急，大小牲畜告急，農民生產生活告急；2011年，受長江中下遊50年來最嚴重旱情影響，長江水位走低， 使上海在5月份出現了原本在冬季才會出現的罕見嚴重鹹潮，部分供水區域因之告急。乾旱對農業生產的影響顯而易見，雖然國家出臺各種有效措施來平抑物價過快上漲，但是旱情猶如「蝴蝶效應」，對主要農產品價格的推高作用逐漸顯現。此外，全國大範圍推廣節水灌溉農業，「十二五」規劃中已明確，未來五年將完成70%以上的大型灌區和50%以上的重點中型灌區續建配套和節水改造任務；淨增農田有效灌溉面積4000萬畝；新增高效節水灌溉面積5000萬畝。但是如何提高土壤田間持水量和植物對水分的利用率，僅僅靠改變灌溉方式是不夠的。所以開展抗旱、保水農業研究不僅勢在必行，而且已經迫在眉睫。Y-聚穀氨酸(簡稱Y-PGA)是自然界中微生物發酵產生的水溶性多聚胺基酸， 其結構為穀氨酸單元通過α-氨基和Y-羧基形成肽鍵的高分子聚合物，分子量分布在 IOOkDa到IOOOOkDa之間。、-PGA具有優良的水溶性、超強的吸附性和生物可降解性，降解產物為無公害的穀氨酸，是一種優良的保水劑。另外，Y-PGA可以作為植物增產營養素， 在淹水條件下，Y -PGA會在植株根毛表層形成一層薄膜，不但具有保護根毛的功能，更是土壤中養份、水份與根毛親密接觸的最佳輸送平臺，能很有效率的提高肥料中養分的溶解、存儲、輸送與吸收；阻止硫酸根、磷酸根、草酸根與金屬元素產生沉澱作用，使作物能更有效的吸收土壤中磷、鈣、鎂及微量元素；促進作物根系的發育，加強抗病性。Y-PGA還可以平衡土壤酸鹼值，避免長期施用化學肥料所造成的酸性土質；有效螯合有毒重金屬；增強植物抗病及抗逆能力；可使茶葉、瓜果、蔬菜等農產品快速增產，增產量可達10 20%。肥料與保水劑複合一體化使用是水肥調控的重要技術，是肥料研究的國際前沿。 目前，多數研究集中在將保水劑與無機礦物和尿素結合，製成保水緩控釋化肥。毛小雲等利用澱粉_丙烯酸鹽接枝共聚物和無機礦物複合，製成有機_無機複合保水肥，不僅有助於作物對營養的吸收，更減少了礦質元素的淋溶作用。有機抗旱肥料BGA是一種由城鄉有機廢棄物經資源化處理後製得的有機肥料，其抗旱機理主要是增加土壤中有機碳，促進了土壤中有機無機複合膠體的形成，以膠體的吸水性來提高土壤中水分含量。對於保水型生物肥料的研究，在國內外都尚少。但是農業生產長期過分依賴於化學肥料，造成大量不可再生能源的浪費，農田土質變壞，肥力下降，農作物產品殘留、品質降低以及食品和環境汙染的問題日益突出。因此，單一依靠保水劑與無機肥料結合生產保水緩控釋肥料，不能滿足可持續農業和綠色農業發展的要求。y -PGA生產菌株按照是否需要外源性的L-穀氨酸，可分成L-穀氨酸依賴型和L-穀氨酸非依賴型。我國目前的研究對象主要是L-穀氨酸依賴型菌株。L-穀氨酸作為 Y-PGA發酵生產的前體，對發酵液中Y-PGA的積累具有重要的影響。目前，產Y-PGA的菌株主要集中在芽孢桿菌不同菌株之間，如枯草芽孢桿菌IF03335和TAM-4以及部分短小芽孢桿菌和地衣芽孢桿菌菌株。Y -PGA產生菌大部分是從豆製品等材料中獲得的芽孢桿菌， 而從土壤和胺基酸廢料堆中篩選的並不多見。中國專利申請2010102585 17. 2公開了一種從土壤中分離得到的死谷芽孢桿菌以及其發酵培養方法，用這種方法得到的發酵液中菌體含量彡 lX109f/mL。
發明內容
因此，本發明要解決的技術問題是提供一種可以得到更大菌體含量的死谷芽孢桿菌的發酵培養方法。本發明的技術方案是，一種死谷芽孢桿菌的發酵培養方法，包括種子培養和發酵培養其特徵在於在所述發酵培養工序中，培養基的初始pH為6. 0 7. 0，菌株溫度30°C 37°C，氮源用量為5 10g/L，碳源用量為15 25g/L。所述死谷芽孢桿菌的培養基採用常規的基礎培養基，一般為穀氨酸鈉10g/L， MgS04 · 7H20 0. 25g/L, CaCl2 · 2H20 0. lg/L, K2HPO4 2g/L。上述死谷芽孢桿菌(Bacillus vallismortis)在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏，保藏號為CGMCC No. 3478 (在專利申請201010258517. 2中首次提及)。主要生物學特性為菌株為長杆狀，有莢膜和鞭毛，芽孢中生，革蘭氏染色為陽性，具有葡萄糖產酸，好氧，接觸酶陽性，石蕊牛奶還原陽性，明膠液化，分解酪素，不分解酪氨酸。根據本發明所述的死谷芽孢桿菌的發酵培養方法，優選的是，所述氮源為酵母膏。根據本發明所述的死谷芽孢桿菌的發酵培養方法，優選的是，所述碳源為蔗糖或糖化玉米粉。優選的是，所述發酵培養工序中的裝液量為20% 30%。該裝液量可以更好地保持發酵罐的通氣性。優選的是，48h發酵液中活菌或芽孢為3. 4 5. 1 X 1010CFU/mL以上。本發明要解決的另一個技術問題是提供一種利用上述死谷芽孢桿菌生產微生物肥料的方法。一種含死谷芽孢桿菌的微生物肥料的生產方法，包括原料的處理和菌劑與原料的混合，該方法包括以下步驟(1)原料的處理將水解渣敲碎成粉末或小顆粒，與鹼性物質混合，使處理後的水解渣原料PH達到5. 5-8. 0 ；(2)採用上述的發酵培養方法發酵死谷芽孢桿菌，得到的發酵液用吸附介質吸附後得到菌劑，與步驟⑴所得的水解渣按菌劑水解渣=1-30 100的質量比混合。上述步驟⑴用鹼性物質的作用是調節水解渣原料的pH值，使其達到微生物肥料的範圍。該鹼性物質優選為石灰、KOH或NaOH的一種。根據本發明所述的含死谷芽孢桿菌的微生物肥料的生產方法，優選的是，所述水解渣為胺基酸生產過程的發酵產物。進一步地，所述步驟(2)中還可加入無機肥料和/或微量元素肥料。如果需要製造更高養分含量或者含微量元素的微生物肥料，可以在上述得到的微生物肥料中加入無機肥料或微量元素肥料，也可以同時加入無機肥料和微量元素肥料。胺基酸生產過程中的發酵產物水解渣(水解濾餅)由於其強酸性，隨水流失或棄於土壤會造成水質、土壤酸化而造成汙染，國家嚴禁排放；同時強酸性亦使得其無法有效利用而造成積壓。由於其產出量大，堆放場地大，是長期困擾胺基酸生產企業的難題。經過檢測，水解渣除酸性強外，還含有大量的有機質、穀氨酸、腐殖酸和中微量元素，其中穀氨酸是生產Y-PGA的重要前體，因此，胺基酸水解渣是生產保水型微生物肥料的優質原料。本發明的技術原理是利用可產Y-PGA菌株發酵特性獲得大量菌體，與其他微生物複合成為保水型複合微生物菌劑，再與含有大量穀氨酸的有機原料混合成為保水型複合微生物肥料。施入土壤後，除保水型微生物肥料中本身所含Y-PGA外，微生物在土壤中利用有機物料以及養分繼續代謝過程，尤其是位於根際的微生物。這些微生物活動不斷產生
Y-PGA，從而增加土壤保水抗旱能力。本發明的發酵培養方法通過優化發酵培養參數，可使發酵產生最大菌量，較以往芽孢桿菌48h發酵菌株量大約為1.0 5. OX 109CFU/mL增加了一個數量級。上述保水型複合微生物肥料是根據根際土壤微生態學和植物營養學原理，以產Y-PGA菌株為核心，與多種有益微生物(固氮菌、解磷菌、鉀細菌)複合，以優質胺基酸有機質為載體，再配以少量的無機養分及微量元素加工而成的具有無汙染、無公害，適於生產綠色食品的新型抗旱肥料。本發明較現有技術的優勢在於(1)從胺基酸廢料堆及其堆放土壤中篩選產Y -PGA菌株，並首次用於生產胺基酸微生物肥料，使微生物在與自然態相似的環境中定殖，解決了菌株難以存活的問題，也為微生物肥料生產提供了新的菌種資源。(2)通過對菌株PGA23發酵條件優化，保證菌株發酵過程可以高效獲得大量菌體。 以大量菌株為基礎，確保在肥料施入土壤後有充足的微生物進行代謝活動以獲得Y-PGA。(3)以富含穀氨酸的水解渣作為生產保水型複合微生物肥料的原料，確保微生物有充足穀氨酸前體利用。肥料中所含微生物在土壤中，可以利用穀氨酸為前體，代謝產生
Y-PGA，從而達到增加土壤水分含量，抗旱保水的作用。(4)保水型複合微生物肥料養分全面，不僅供給作物適量的無機營養，而且提供有效活菌、有機質、胺基酸、腐殖酸以及礦質元素。在為作物生長提供全面營養物質的同時，還起到抗旱、防病、促生和改良土壤的作用。(5)以味精生產廢料作為複合微生物原料，為胺基酸廢料資源化提供了一條嶄新的處置途徑，而且可獲得附加值較高的保水型複合微生物肥料，從而降低了水解渣處置成本。
圖1是胺基酸水解渣的製造工藝流程圖。圖2是保水型微生物菌劑的製備流程圖。圖3是粉狀保水型微生物肥料的製備流程圖。
具體實施方式
實施例11、菌株發酵基礎培養基為穀氨酸鈉 10g/L, MgSO4 · 7H20 0. 25g/L，CaCl2 · 2H20 0. lg/L，K2HPO4 2g/L時，死谷芽孢桿菌菌株發酵條件為溫度32°C，裝液量為20%，培養基初始PH為6. 5，以酵母膏為氮源，用量為5g/L，糖化玉米粉為碳源，用量為15g/L時發酵，發酵48h後可獲得菌量為3. 9X 101(lCFU/mL ；2、胺基酸廢料取樣水解渣取自河南省蓮花胺基酸股份有限公司；3、pH調理在水解渣中加入氫氧化鉀8%混合，用鏈條粉碎機碎至80目後堆放 8-12h，讓其充分反應。處理後水解渣的基本性狀見表1 ；表1處理後水解渣(粉狀)的基本性狀
權利要求
1.一種死谷芽孢桿菌的發酵培養方法，包括種子培養和發酵培養工序，其特徵在於 在所述發酵培養工序中，培養基的初始PH為6. 0 7. 0，菌株溫度30°C 37°C，氮源用量為 5 10g/L，碳源用量為15 25g/L。
2.根據權利要求1所述的死谷芽孢桿菌的發酵培養方法，其特徵在於所述氮源為酵母膏。
3.根據權利要求1所述的死谷芽孢桿菌的發酵培養方法，其特徵在於所述碳源為蔗糖或糖化玉米粉。
4.根據權利要求1所述的死谷芽孢桿菌的發酵培養方法，其特徵在於所述發酵培養工序中的裝液量為20% 30%。
5.根據權利要求1所述的死谷芽孢桿菌的發酵培養方法，其特徵在於48h發酵液中活菌或芽孢為3. 4 5. 1 X 1010CFU/mL以上。
6.一種含死谷芽孢桿菌的微生物肥料的生產方法，包括原料的處理和菌劑與原料的混合，其特徵在於該方法包括以下步驟(1)原料的處理將水解渣敲碎成粉末或小顆粒，與鹼性物質混合，使處理後的水解渣原料PH達到5. 5-8. 0 ；(2)採用權利要求1-5任一項所述的發酵培養方法發酵死谷芽孢桿菌，得到的發酵液用吸附介質吸附後得到菌劑，與步驟(1)所得的水解渣按菌劑水解渣=1-30 100的質量比混合。
7.根據權利要求6所述的含死谷芽孢桿菌的微生物肥料的生產方法，其特徵在於所述鹼性物質為石灰、KOH或NaOH的一種。
8.根據權利要求6所述的含死谷芽孢桿菌的微生物肥料的生產方法，其特徵在於所述水解渣為胺基酸生產過程的發酵產物。
9.根據權利要求6所述的含死谷芽孢桿菌的微生物肥料的生產方法，其特徵在於所述步驟(2)中還可加入無機肥料和/或微量元素肥料。
全文摘要
本發明提供了一種死谷芽孢桿菌的發酵培養方法，包括種子培養和發酵培養工序，在所述發酵培養工序中，培養基的初始pH為6.0～7.0，菌株溫度30℃～37℃，氮源用量為5～10g/L，碳源用量為15～25g/L。此外，還提供了用發酵得到的菌液利用水解渣為原料生產微生物肥料的方法。本發明的發酵培養方法得到的48h發酵液中活菌或芽孢為3.4～5.1×1010CFU/mL以上，比常規方法至少高一個數量級，且微生物肥料的生產方法有效地利用了廢棄資源，具有環保、經濟的優點。
文檔編號C12N1/20GK102492641SQ201110425478
公開日2012年6月13日 申請日期2011年12月16日 優先權日2011年12月16日
發明者閆龍翔, 陳芳, 陳露 申請人:上海綠樂生物科技有限公司