人stim1基因的用途及其相關藥物的製作方法

2023-06-23 02:53:46 2

專利名稱：人stim1基因的用途及其相關藥物的製作方法
技術領域：
本發明涉及生物技術領域，更具體地涉及人STIMl基因的用途及其相關藥物。
背景技術：
RNA幹擾(RNA interference, RNAi)利用雙鏈RNA介導序列特異性的轉錄後基因沉默，已成為研究基因功能的一種新興的有效手段，並有望成為腫瘤等疾病基因治療的工具(Izquierdo M. Short interfering RNAs as a tool for cancer gene therapy. Cancer Gene Ther. 2005 ； 12 (3) :217-27.)。慢病毒(Ientivirus)載體是高效的基因轉導工具，較逆轉錄病毒載體有更廣的宿主範圍，可將外源的髮夾結構RNA(short hairpin RNA, shRNA) 序列穩定導入非周期性和有絲分裂後的細胞。shRNA在細胞內會自動被加工成為小幹擾 RNA (small interferingRNA, si RNA)，引起具有相同序列的mRNA發生降解。由於慢病毒載體具有具有攜帶基因片段容量大、轉染效率高、不易誘發宿主免疫反應等優點，已被廣泛應用於基因治療、疫苗生產以及科學研究等領域(Sinn PL, Sauter SL,McCray PB. Gene therapy progress and prospects :development of improved lentiviral and retroviral vectors-design, biosafety, and production. Gene Ther 2005 ； 12 1089-98.)。內質網的鈣離子信號參與很多重要生理活動，如基因轉錄、細胞凋亡等，並在腫瘤發展和進程中發揮重要作用(Feng M，Grice DM，Faddy HM, Nguyen N，Leitch S， Wang Y，Muend S，Kenny PA, Sukumar S，Roberts-Thomson SJ, Monteith GR, Rao R. Store-independent activation of Orai 1 by SPCA2 in mammary tumors. Cell. 2010 ； 143(1) :84-98.)。因此調節鈣離子進入細胞的精確反饋機制至關重要。基質相互作用分子 l(stromal interaction molecule 1, STIM1)編碼分子量約為77KDa的I型膜蛋白，主要定位在內質網膜上Oiang SL, Yu Y，Roos J，Kozak JA, Deerinck TJ, Ellisman MH, Stauderman KA, Cahalan MD. STIMl is a Ca2+sensor that activates CRAC channels and migrates from the Ca2+store to the plasma membrane. Nature. 2005 ；437 (7060) :902-5.)，少量分布於細胞膜上(Manji SS, Parker NJ, Williams RT, van Stekelenburg L, Pearson RB, Dziadek M, Smith PJ. STIMl :a novel phosphoprotein located at the cell surface. Biochim Biophys Acta. 2000 ； 1481(1) :147-55. )。STIMl被認為是哺乳動物細胞的內質網膜鈣離子感受器(Liou J， Kim ML, Heo WD, Jones JT, Myers Jff, Ferrell JE Jr, Meyer Τ. STIM is a Ca2+sensor essential for Ca2+-store-depletion-triggered Ca2+influx.Curr Biol.2005 ； 15(13) :1235-41. Roos J, DiGregorio PJ, Yeromin AV, Ohlsen K, Lioudyno M, Zhang S, Safrina 0, Kozak JA, Wagner SL, Cahalan MD, Velicelebi G, Stauderman KA. STIMl, an essential and conserved component of store-operated Ca2+channel function. J Cell Biol. 2005 ；169 (3) :435-45.)。當細胞內鈣內存被損耗時，STIMl能感受到內質網內鈣離子的損耗並向細胞膜方向移動，激活Orail從而形成鈣池操縱的鈣通道(store-operated calciumchannel, S0C)，介導細胞夕卜 丐離子的進入(Hewavitharana T, Deng X，SoboloffJ,Gill DL. Role of STIM and Orai proteins in the store-operated calcium signaling pathway. Cell Calcium. 2007 ；42 (2) :173-82.)。 人染色體11ρ15區域聚集著大量的抑癌基因，該區域的缺失與腎母細胞瘤、橫紋肌肉瘤、腎上腺癌、肝母細胞瘤、膀胱癌、肺癌、卵巢癌及睪丸癌的發生密切相關(Zhao B， Bepler G. Transcript map and complete genomic sequence for the 310 kb region of minimal allele loss on chromosome segment 1 lpl5.5 in non—small_cel1 lung cancer. Oncogene.2001 ；20(56) :8154-64. Parker NJ, Begley CG, Smith PJ, Fox RM. Molecular cloning of a novel human gene(D11S4896E)at chromosomal region llpl5. 5. Genomics. 1996 ；37 (2) :253-6. Williams RT，Manji SS，Parker NJ，Hancock MS， Van Stekelenburg L，Eid JP，Senior PV，Kazenwadel JS，Shandala T，Saint R，Smith PJ, Dziadek MA. Identification and characterization of the STIM(stromal interaction molecule)gene family :coding for a novel class of transmembrane proteins. Biochem J. 2001 ;357 (Pt3) :673-85.)。而 STIMl 基因恰好位於 llpl5. 5 區域，因此該基因在腫瘤中的調控功能格外引人注目。然而，在不同的腫瘤細胞株中，STIMl可能引起不同的生物學效應。研究發現STIMl在橫紋肌肉瘤細胞系和橫紋肌樣瘤細胞系中低表達或者不表達，過表達 STIMl 可導致細胞生長阻滯(Sabbioni S, Barbanti-Brodano G，Croce CM, Negrini Μ· GOK :a gene at llpl5involved in rhabdomyosarcoma and rhabdoid tumor development. Cancer Res. 1997 ；57 (20) :4493-7. Sabbioni S，Veronese A，Trubia M， Taramelli R,Barbanti-Brodano G，Croce CM，Negrini M. Exon structure and promoter identification of STIMl(alias GOK)， a human gene causing growth arrest of the human tumor cell lines G401 and RD. Cytogenet Cell Genet. 1999 ；86 (3-4) :214-8.)， 提示STIMl作為一個重要的抑癌基因，在橫紋肌肉瘤發生和發展中發揮作用。在內皮細胞中降低該基因的表達後，細胞內的鈣離子濃度降低，細胞周期發生改變，從而使細胞增殖減 ■ (Abdullaev IF, Bisaillon JM, Potier M， Gonzalez JC, Motiani RK, Trebak Μ. Stim land Orai lmediate CRAC currents and store-operated calcium entry important for endothelial cell proliferation. Circ Res. 2008 ;103 (11) : 1289-99.)；也有報導表明內皮細胞中該基因的高表達，會促進細胞的凋亡(Chiu WT，Tmg MJ，Jao HC，Shen MR. Soft substrateup-regulates the interaction of STIMl with store-operated Ca2+channels that lead to normal epithelial cell apoptosis. Mol Biol Cell. 2008 ； 19(5) :2220-30.)。此外，還發現STIMl與在惡性腫瘤的轉移有關。在乳腺癌細胞中通過阻斷STMl和Orail這兩個基因可以抑制腫瘤血管的生成，抑制腫瘤細胞擴散和轉移 (Yang S, Zhang JJ, Huang XY. Orail and STIMl are critical for breast tumor cell migration and metastasis. Cancer Cell. 2009 ；15 (2) :124-34.)。在宮頸癌中 STIMl 表達降低抑制宮頸癌細胞增生，使細胞周期停留在G2/M期；在重度免疫缺失小鼠中皮下注射不同STIMl表達水平的宮頸癌細胞株，發現高表達STIMl的細胞株促進腫瘤生成及增加血管密度，而低表達STIMl的細胞株則延遲腫瘤生長並降低血管密度；在子宮頸癌臨床樣本中STIMl過表達，STIMl的表達水平與腫瘤大小、骨盆淋巴結轉移這兩個不良預後因素呈正相關性(沈孟儒.基質交互分子(STIMl)對癌細胞增生及轉移的重要性。成大研發快訊， 第十六卷第一期)。另外，在膠質瘤組織中也檢測到STIMl基因的高表達(Scrideli CA,Carlotti CG Jr，0kamoto OKiAndrade VSiCortez MAiMotta FJ,Lucio-Eterovic AKiNeder L，Rosemberg S，Oba—Shinjo SM, Marie SK, Tone LG. Gene expression profileanalysis of primary glioblastomas and non—neoplastic brain tissue -identification of potential targetgenes by oligonucleotide microarray and real-time quantitative PCR. J Neurooncol. 2008 ；88 (3) :281-91.)。此外，已經有文獻報導 STIMl 的 SiRNA 能夠抑制人 MDA-MB-231 乳腺癌細胞的增長和轉移。(Ymg SY, Zhang JL, Huang XY. Orail and STIMl Are Critical for Breast Tumor Cell Migration and Metastasis，Cancer Cell， 2009 ；15 (2) :124-134))綜上所述，STIMl在腫瘤進程中發揮著具有重要的角色，但關於該基因在除膠質瘤、宮頸癌和乳腺癌外其他腫瘤細胞增殖中的功能研究尚無深入報導。

發明內容
本發明的目的在於公開與人STIMl基因相關的治療方法及藥物。為了深入研究 STIMl在腫瘤發生中的調節功能，本發明選取人肺癌H1299細胞、肝癌SMMC-7721細胞、乳腺癌MCF-7細胞、前列腺癌PC-3細胞和胰腺癌Panc-I細胞為模型，以RNAi為手段研究STIMl 在上述腫瘤細胞的存活和凋亡命運中的作用。本發明第一方面，公開了將人STIMl基因用於製備或篩選腫瘤治療藥物，或者將人STIMl基因用於製備腫瘤診斷藥物。人STIMl基因用於製備或篩選腫瘤治療藥物包括兩方面的內容其一，將人STIMl 基因作為藥物或製劑針對腫瘤細胞的作用靶標應用於製備腫瘤治療藥物或製劑；其二，將人STIMl基因作為藥物或製劑針對腫瘤細胞的作用靶標應用於篩選腫瘤治療藥物或製劑。所述將人STIMl基因作為藥物或製劑針對腫瘤細胞的作用靶標具體是指將人 STIMl基因作為藥物或製劑針對腫瘤細胞產生RNA幹擾作用的靶標，從而能降低腫瘤細胞人STIMl基因的表達水平。所述將人STIMl基因作為藥物或製劑針對腫瘤細胞的作用靶標應用於篩選腫瘤治療藥物或製劑具體是指將人STIMl基因作為作用對象對藥物或製劑進行篩選，以找到可以抑制或促進人STIMl基因表達的藥物作為腫瘤治療備選藥物。如之後所述的人STIMl 基因小分子幹擾RNA即是以人STIMl基因為作用對象篩選獲得的，可用作具有抑制腫瘤細胞增殖作用的藥物。諸如抗體藥物，小分子藥物等也可將STIMl基因作為作用對象。所述將人STIMl基因用於製備腫瘤診斷藥物，是指將人STIMl基因表達產物作為一項腫瘤診斷指標應用於腫瘤診斷藥物的製備。所述的腫瘤可以為其腫瘤細胞的增殖與人STIMl基因的表達相關的任一種腫瘤， 更進一步的，為一種惡性腫瘤，例如選自肺癌、肝癌、前列腺癌、乳腺癌和胰腺癌所述腫瘤治療藥物可以為小分子化學藥，抗體藥，也可以為核酸類藥物。進一步的，所述腫瘤治療藥物能降低人STIMl基因的表達水平從而抑制腫瘤細胞的增殖。採用前述腫瘤治療藥物治療腫瘤的方法，主要是通過降低人STIMl基因的表達水平抑制腫瘤細胞的增殖來達到治療目的的。具體的，治療時，將能有效降低人STIMl基因表達水平的物質給藥於患者。進一步的，所述的能有效降低人STIMl基因表達水平的物質，包括能夠特異性沉默人STIMl基因表達的小分子幹擾RNA(siRNA)。該小分子幹擾RNA(siRNA)可以起到特異性沉默腫瘤細胞中內源STIMl基因的表達的作用。進一步的，所述小分子幹擾RNA以選自SEQ ID NO :1巧4之任一的序列作為特異性沉默人STIMl基因表達的靶點序列。所述小分子幹擾RNA以選自SEQ ID NO 1-54之任一的序列作為特異性沉默人 STIMl基因表達的靶點序列是指該小分子幹擾RNA能與SEQ ID NO :1巧4中的任一種序列所編碼的mRNA片段特異性結合，並特異性沉默人STIMl基因的表達。進一步的，所述能夠特異性沉默人STIMl基因表達的小分子幹擾RNA (SiRNA)經由慢病毒載體表達。具體而言，這個過程包括將編碼所述人STIMl基因小分子幹擾RNA的 DNA片段克隆入慢病毒載體獲得人STIMl基因幹擾慢病毒載體，進而利用該人STIMl基因幹擾慢病毒載體經過病毒包裝成為有感染力的病毒顆粒後，感染腫瘤細胞並最終表達所述 SiRNA0人STIMl基因幹擾慢病毒載體為將編碼所述人STIMl基因小分子幹擾RNA的DNA 片段克隆入慢病毒載體後獲得，能產生人STIMl基因小分子幹擾RNA。進一步的，所述的慢病毒載體可選自pLK0. 1-puro、pLKO. 1-CMV-tGFP、 pLKO.1-puro-CMV-tGFP、 pLKO.I-CMV-Neo, pLKO.l_Neo、 pLKO.l-Neo-CMV_tGFP、 pLKO. 1-puro-CMV-TagCFP、pLKO. l-puro-CMV_TagYFP、pLKO. l-puro-CMV_TagRFP、 pLKO. l-puro-CMV-TagFP635, pLKO. 1-puro-UbC-TurboGFP, pLKO. l-puro-UbC_TagFP635、 pLKO-puro-IPTG-lxLacO、pLK0-puro-IPTG_3xLac0、ρ LP U pLP2、pLP/VSV-G、pENTR/U6、 pLenti6/BL0CK-iT-DEST、pLenti6-GW/U6-laminshrna、pcDNAl. 2/V5_GW/lacZ、pLenti6. 2/ N-Lumio/V5-DEST、pGCSIL-GFP 或 pLenti6. 2/N-Lumio/V5-Gff/lacZ 中的任一種慢病毒載體，本發明實施例具體列舉了以PGCSIL-GFP為載體。慢病毒載體可在慢病毒包裝質粒、細胞系的輔助下，經過病毒包裝成為有感染力的病毒顆粒。本發明第二方面，公開了一種分離的人STIMl基因小分子幹擾RNA (SiRNA)靶標片段，其序列為SEQ ID NO :1-54中任意一條序列。所述分離的人STIMl基因小分子幹擾RNA(SiRNA)靶標片段可應用於人STIMl基因小分子幹擾RNA的篩選與製備。本發明第三方面，公開了一種人STIMl基因小分子幹擾RNA(SiRNA)，能夠特異性沉默人STIMl基因的表達。所述人STIMl基因小分子幹擾RNA以選自SEQ ID NO 1-54之任一的序列作為特異性沉默人STIMl基因表達的靶點序列。進一步的，所述人STIMl基因小分子幹擾RNA包含正義RNA片段和反義RNA片段， 所述正義RNA片段和所述反義RNA片段互補，所述正義RNA片段含有SEQ ID中之任一序列編碼的RNA。所述正義RNA片段和反義RNA片段存在於兩條不同的RNA鏈上或者存在於同一條 RNA鏈上。所述正義RNA片段和反義RNA片段的長度均為15_27個核苷酸；較佳的，長度均為 19-23個核苷酸；最佳的，長度均為19、20或者21個核苷酸。
進一步的，所述人STIMl基因小分子幹擾RNA為髮夾型單鏈RNA，包括正義RNA片段、莖環片段和反義RNA片段，正義RNA片段和反義RNA片段中間由莖環片段分隔；其中，正義RNA片段和反義RNA片段互補，正義RNA片段的序列選自SEQ ID NO 1-54之任一。所述莖環片段結構包括6個或9個鹼基。進一步的所述莖環片段的序列選自以下任一 UUCAAGAGA、AUG、CCC, UUCG, CCACC, CTCGAG, AAGCUU、CCACACC。本發明具體列舉了以 UUCAAGAGA 為莖環。如實施例列舉的，所述人STIMl基因小分子幹擾RNA的序列為SEQ ID NO 55 :(XU GGAUGAUGUAGAUCAUAAUUCAAGAGAUUAUGAUCUACAUCAUCCAGG。本發明第四方面，公開了一種人STIMl基因幹擾核酸構建體，包含編碼前述人 STIMl基因小分子幹擾RNA的基因片段，能表達前述人STIMl基因小分子幹擾RNA。所述的人STIMl基因幹擾核酸構建體可以是將編碼前述人STIMl基因小分子幹擾 RNA的基因片段克隆入已知載體獲得。進一步的，所述人STIMl基因幹擾核酸構建體為人STIMl基因幹擾慢病毒載體，為將編碼所述人STIMl基因小分子幹擾RNA的基因片段克隆入慢病毒載體後獲得，能產生人 STIMl基因小分子幹擾RNA。所述慢病毒載體可以選自pLK0.1-puro、pLKO. 1-CMV-tGFP、 pLKO.1-puro-CMV-tGFP、 pLKO.I-CMV-Neo, pLKO.l_Neo、 pLKO.l-Neo-CMV_tGFP、 pLKO. 1-puro-CMV-TagCFP、pLKO. l-puro-CMV_TagYFP、pLKO. l-puro-CMV_TagRFP、 pLKO. l-puro-CMV-TagFP635, pLKO. 1-puro-UbC-TurboGFP, pLKO. l-puro-UbC_TagFP635、 pLKO-puro-IPTG-lxLacO、pLK0-puro-IPTG_3xLac0、ρ LP U pLP2、pLP/VSV-G、pENTR/U6、 pLenti6/BL0CK-iT-DEST、pLenti6-GW/U6-laminshrna、pcDNAl. 2/V5_GW/lacZ、pLenti6. 2/ N-Lumio/V5-DEST、pGCSIL-GFP 或 pLenti6. 2/N-Lumio/V5-Gff/lacZ 中的任一。本發明實施例具體列舉了以pGCSIL-GFP為載體構建的人STIMl基因幹擾核酸構建體,命名為 pGCSIL-GFP-STIMl-shRNA。進一步的，編碼所述人STIMl基因小分子幹擾RNA的基因片段的序列含有SEQ ID NO 1-54中之任一序列及其互補序列。本發明的人STIMl基因小分子幹擾RNA可用於抑制腫瘤細胞的增殖，進一步地可以用作治療或診斷腫瘤的藥物或製劑。人STIMl基因幹擾核酸構建體則可用於製備所述人 STIMl基因小分子幹擾RNA。當用作治療腫瘤的藥物或製劑時，是將安全有效量的人STIMl基因小分子幹擾 RNA施用於哺乳動物。當然，具體劑量還應考慮給藥途徑、病人健康狀況等因素，這些都是熟練醫師技能範圍之內的。本發明第五方面，公開了一種人STIMl基因幹擾慢病毒，由前述人STIMl基因幹擾慢病毒載體在慢病毒包裝質粒、細胞系的輔助下，經過病毒包裝而成。該慢病毒可感染腫瘤細胞並產生人STIMl基因小分子幹擾RNA，從而抑制腫瘤細胞的增殖。本發明第六方面，還公開了一種藥物組合物，含有治療有效量的人STIMl基因小分子幹擾RNA或人STIMl基因幹擾慢病毒。進一步的，所述藥物組合物含有1 99wt%如前所述的人STIMl基因小分子幹擾 RNA或人STIMl基因幹擾慢病毒，以及藥學上可接受的載體、稀釋劑或賦形劑。
在製備這些組合物時，通常將活性成分與賦形劑混合，或用賦形劑稀釋，或包在可以膠囊或藥囊形式存在的載體中。當賦形劑起稀釋劑作用時，它可以是固體、半固體或液體材料作為賦形劑、載體或活性成分的介質。因此，組合物可以是片劑、丸劑、粉劑、溶液劑、糖漿劑、滅菌注射溶液等。合適的賦形劑的例子包括乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨醇、甘露醇、澱粉、微晶纖維素、聚乙烯吡咯烷酮、纖維素、水、等。製劑還可包括溼潤劑、乳化劑、防腐劑 (如羥基苯甲酸甲酯和丙酯)、甜味劑等。綜上所述，本發明設計了針對人STIMl基因的M個RNAi靶點序列，構建相應的 STIMlRNAi 載體，其中編碼序列 SEQ ID NO 40 的 RNAi 載體 pGCSIL-GFP_STIMl_shRNA 能夠顯著下調STIMl基因在mRNA水平和蛋白水平的表達。使用慢病毒(lentivirus，簡寫為Lv) 作為基因操作工具攜帶RNAi載體pGCSIL-GFP-STIMl-shRNA能夠靶向地將針對STIMl基因的RNAi序列高效導入人肺癌H1299細胞、肝癌SMMC-7721細胞、乳腺癌MCF-7細胞、前列腺癌PC-3細胞和胰腺癌Panc-I細胞，降低STIMl基因的表達水平，顯著抑制上述腫瘤細胞的增殖能力。因此慢病毒介導的STIMl基因沉默是惡性腫瘤潛在的臨床非手術治療方式。本發明提供的SiRNA或者包含該SiRNA序列的核酸構建體、慢病毒能夠特異性抑制人STIMl基因的表達，尤其是慢病毒，能夠高效侵染靶細胞，高效率地抑制靶細胞中 STIMl基因的表達，進而抑制腫瘤細胞的生長，促進腫瘤細胞凋亡，在腫瘤治療中具有重要
眉、ο


圖1表示pGCSIL-GFP質粒DNA圖譜圖2表示表示STIMlshRNA慢病毒侵染5天後，人肺癌H1299細胞、肝癌SMMC-7721 細胞、乳腺癌MCF-7細胞和前列腺癌PC-3細胞中的STIMl mRNA的表達水平降低圖3表示STIMl shRNA慢病毒侵染5天後，人肺癌H1299細胞的增殖能力被抑制圖4表示STIMl shRNA慢病毒侵染5天後，人肝癌SMMC-7721細胞的增殖能力被抑制圖5表示STIMl shRNA慢病毒侵染5天後，人乳腺癌MCF-7細胞的增殖能力被抑制圖6表示STIMl shRNA慢病毒侵染5天後，人前列腺癌PC_3細胞的增殖能力被抑制圖7表示STIMl shRNA慢病毒侵染5天後，人胰腺癌Panc-I細胞的增殖能力被抑制圖8使用STIMl抗體在腫瘤組織樣本上的免疫組化檢測結果.a為乳腺癌，b、c為肺癌，d為胰腺癌
具體實施例方式本發明基於STIMl的相關的研究，認為STIMl可能參與了除乳腺癌外其他惡性腫瘤的發生和發展。本發明涉及了一組針對人STIMl基因的小分子幹擾RNA(SiRNA)序列、RNA幹擾載體和RNA幹擾慢病毒。選取人STIMl mRNA編碼區序列作為siRNA的靶位點，根據靶位點中連續的10-30(優選15-27，更優選19-23)個鹼基序列設計siRNA靶點序列。通過基因克隆，構建表達上述siRNA的核酸構建體，包裝表達上述siRNA的慢病毒。細胞實驗證明，上述siRNA序列能夠特異性沉默人腫瘤細胞中內源STIMl基因的表達。發明人發現，採用RNAi方法下調人STIMl基因的表達後可有效地抑制腫瘤細胞的增殖，這一研究成果表明STIMl基因是原癌基因，可作為腫瘤治療的靶點。發明人進一步合成和測試了多種針對STIMl基因的siRNA，篩選出了可有效抑制STIMl的表達進而抑制人肺癌H1299細胞、肝癌SMMC-7721細胞、乳腺癌MCF-7細胞和前列腺癌PC-3細胞增殖和生長的siRNA，在此基礎上完成了本發明。本發明提供了一系列幹擾人STIMl基因的小幹擾RNA(siRNA)序列，構建了可特異性沉默STIMl基因表達的慢病毒。本發明研究發現，針對人STIMl基因設計的小幹擾RNA及 RNAi慢病毒，穩定並特異地下調STIMl基因的表達，並有效地抑制人腫瘤細胞的增殖。本發明表明STIMl基因可促進腫瘤細胞生長，有望成為腫瘤早期診斷和治療的靶點。而且，通過 RNAi方式沉默STIMl基因的表達，可作為抑制腫瘤發展的有效手段。本發明的設計思路為本發明通過如下方法來篩選獲得一種人STIMl基因RNAi慢病毒從Genbank中調取人STIMl基因序列；預測siRNA位點；合成針對STIMl基因的有效的siRNA序列，兩端含酶切位點粘端的雙鏈DNA Oligo ；慢病毒載體雙酶切後與雙鏈DNA Oligo連接，構建表達 STIMl基因siRNA序列的RNAi質粒；將RNAi質粒和慢病毒包裝需要的輔助載體(Packing Mix, Sigma-aldrich公司)共轉染人胚腎細胞^3T，產生重組慢病毒顆粒，即可製得高效沉默STIMl基因的慢病毒。基於上述方法，本發明提供了 M個幹擾STIMl基因的有效靶點(具體如SEQ IDNO 1-54所示)，構建了特異幹擾人STIMl基因的慢病毒。同時本發明還公開一種人STIMl基因RNAi慢病毒RNAi及其製備與應用。本研究發現，利用慢病毒介導的RNAi方法，在降低STIMl基因在腫瘤細胞中的表達後，可以有效抑制腫瘤細胞的增殖。本研究表明，STIMl基因是一個原癌基因，可促進腫瘤細胞增殖，在腫瘤發生和發展中具有重要的生物學功能，STIMl基因可以為腫瘤治療的靶標，慢病毒介導的STIMl基因特異性沉默可作為腫瘤治療的一種新手段。下面結合實施例進一步闡述本發明。應理解，實施例僅用於說明本發明，而非限制本發明的範圍。實施例中未註明具體條件的實驗方法及未說明配方的試劑均為按照常規條件，如[美]Sambrook. J等著；黃培堂等譯。分子克隆試驗指南，第三版。北京科學出版社 2002中所述的條件或者製造商建議的條件進行或配置。實施例1 針對人STIMl基因RNAi慢病毒的製備1.篩選針對人STIMl基因的有效的siRNA靶點從Genbank調取STIMl (匪003156)基因信息；利用上海吉凱基因化學技術有限公司的設計軟體Genechem設計針對STIMl基因的有效的siRNA靶點。在STIMl基因的編碼序列(CDQ區域內，每隔一個鹼基起始獲得21個鹼基的序列，表1列出了其中M條針對 STIMl基因的有效siRNA靶點序列。表1靶向於人STIMl基因的siRNA靶點序列
權利要求
1.人STIMl基因在製備或篩選肺癌、肝癌、前列腺癌、乳腺癌和胰腺癌的腫瘤治療藥物，或者在製備肺癌、肝癌、前列腺癌、乳腺癌和胰腺癌之任一腫瘤診斷藥物中的用途。
2.一種分離的人STIMl基因小分子幹擾RNA靶標片段，其序列為SEQ ID NO :1_54中任意一條序列。
3.一種人STIMl基因小分子幹擾RNA，能夠特異性沉默人STIMl基因的表達，所述人 STIMl基因小分子幹擾RNA以選自SEQ ID NO 1巧4之任一的序列作為特異性沉默人STIMl 基因表達的靶點序列。
4.如權利要求3所述人STIMl基因小分子幹擾RNA，其特徵在於，所述人STIMl基因小分子幹擾RNA包含正義RNA片段和反義RNA片段，所述正義RNA片段和所述反義RNA片段互補，所述正義RNA片段含有SEQ ID NO :1_54中之任一序列編碼的RNA。
5.如權利要求4所述人STIMl基因小分子幹擾RNA，其特徵在於，所述正義RNA片段和反義RNA片段的長度均為15-27個核苷酸。
6.如權利要求5所述人STIMl基因小分子幹擾RNA，其特徵在於，所述人STIMl基因小分子幹擾RNA為髮夾型單鏈RNA，所述正義RNA片段和所述反義RNA片段中間由莖環片段分隔。
7.如權利要求6所述人STIMl基因小分子幹擾RNA，其特徵在於，所述莖環片段的序列選自以下任一 UUCAAGAGA、AUG、CCC、UUCG、CCACC、CTCGAG、AAGCUU、CCACACC。
8.如權利要求3所述人STIMl基因小分子幹擾RNA，其特徵在於，所述人STIMl基因小分子幹擾RNA的序列為SEQ ID NO :55。
9.一種人STIMl基因幹擾核酸構建體，包含編碼權利要求3-8任一權利要求所述人 STIMl基因小分子幹擾RNA的基因片段，能表達人STIMl基因小分子幹擾RNA。
10.如權利要求9所述人STIMl基因幹擾核酸構建體，其特徵在於，所述人STIMl基因幹擾核酸構建體為人STIMl基因幹擾慢病毒載體。
11.如權利要求10所述人STIMl基因幹擾核酸構建體，其特徵在於，所述慢病毒載體選自pLK0. 1-puro、pLKO. 1-CMV-tGFP、pLKO. l-puro-CMV-tGFP、pLKO. I-CMV-Neo, pLKO. l-Neo、pLK0. l-Neo-CMV-tGFP、pLKO. l-puro-CMV-TagCFP、pLKO. l-puro-CMV-TagYFP、 pLKO. 1-puro-CMV-TagRFP、pLKO. l-puro-CMV-TagFP635, pLKO. 1-puro-UbC-TurboGFP、 pLKO. l-puro-UbC-TagFP635> pLK0-puro_IPTG-lxLac0、pLK0-puro-IPTG_3xLac0、pLPl、 pLP2, pLP/VSV-G, pENTR/U6, pLenti6/BL0CK-iT-DEST, pLenti6-Gff/U6-laminshrna, pcDNAl. 2/V5-GW/lacZ、pLenti6. 2/N-Lumio/V5_DEST、pGCSIL-GFP 或pLenti6. 2/N-Lumio/ V5-Gff/lacZ 中的任一。
12.—種人STIMl基因幹擾慢病毒，由權利要求9-11任一權利要求所述人STIMl基因幹擾慢病毒載體在慢病毒包裝質粒、細胞系的輔助下，經過病毒包裝而成。
13.一種藥物組合物，含有治療有效量的權利要求3-8任一權利要求所述人STIMl基因小分子幹擾RNA或權利要求12所述人STIMl基因幹擾慢病毒，以及藥學上可接受的載體、 稀釋劑或賦形劑。
14.如權利要求13所述藥物組合物，其特徵在於，所述藥物組合物用於治療肺癌、肝癌、前列腺癌、乳腺癌和胰腺癌之任一腫瘤。
全文摘要
本發明公開了人STIM1基因的用途及其相關藥物。本發明公開了人STIM1基因在腫瘤治療、腫瘤診斷及藥物製備中的用途。本發明還進一步構建了人STIM1基因小分子幹擾RNA、人STIM1基因幹擾核酸構建體、人STIM1基因幹擾慢病毒並公開了他們的用途。本發明提供的siRNA或者包含該siRNA序列的核酸構建體、慢病毒能夠特異性抑制人STIM1基因的表達，尤其是慢病毒，能夠高效侵染靶細胞，高效率地抑制靶細胞中STIM1基因的表達，進而抑制腫瘤細胞的生長，促進腫瘤細胞凋亡，在腫瘤治療中具有重要意義。
文檔編號C12N15/867GK102433383SQ20111042591
公開日2012年5月2日 申請日期2011年12月19日 優先權日2011年12月19日
發明者孫琴, 曹躍瓊, 沈浩, 瞿紅花, 金楊晟, 韓海雄, 顧雪峰 申請人:上海吉凱基因化學技術有限公司