一種鑑定樣品中細菌的方法

2023-06-23 10:16:51 2

專利名稱：一種鑑定樣品中細菌的方法
一種鑑定樣品中細菌的方法本發明的背景本發明描述了一種用於鑑定細菌的方法。特別是，本發明涉及使用流式細胞儀從痰液樣本中鑑定分枝桿菌並進行定量計數的方法。進一步描述了使用流式細胞儀從痰液派生的樣本中來鑑定和定量結核分枝桿菌，並以此來驗證，校準和/或建立用於診斷結核病(TB)的過程中的質量控制體系。儘管一個多世紀以來，檢驗出的結核分枝桿菌被認為是引起結核病的原因，在資源貧乏的國家，特別是在愛滋病毒感染人群中，診斷結核病仍然是一個挑戰。結核病是由結核分枝桿菌感染引起的疾病，結核分枝桿菌感染是引起發病率和死亡率的一個重要原因，每年有超過900萬的新發病例和約180萬的死亡人數。由於疾病的傳染性，快速鑑定病原對於減少疾病在社區和衛生保健中心的個體之間的傳播至關重要。在大多數國家診斷結核病的最常用方法是塗片鏡檢，該方法成本較低，相對容易 執行，但是檢測靈敏度適中(35 80%)。在撒哈拉以南的許多非洲國家中，其感染愛滋病病毒的成人和兒童佔全國人口的大多數，此種情況下塗片鏡檢的靈敏度特別低。被認可的結核病診斷的黃金標準是體外培養結核分枝桿菌，這是高靈敏度的方法，而且能夠鑑定結核分枝桿菌，並且分離其藥物敏感株和藥物耐受株，但是這種方法仍然有很多的局限性。最大的局限性是體外培養結核分枝桿菌需要2-6周的周期，從而降低了它在臨床決策中的應用。另一個局限性是，要進行結核分枝桿菌的體外培養，必須在生物安全水平(BSL2 3)，並在特定的實驗室運行要求下進行，這個條件在邊遠的條件缺乏的地方是不容易達到的。即使是使用如BACTEC MGIT960和MGIT DST (BD診斷系統)的液體培養方法仍然存在不足之處，從方法學上來說，仍然是「人力資源」密集的，昂貴的，並且容易出現汙染。因此，特別是在愛滋病流行之後，為預防結核病感染，研發新的結核病診斷方法的進度在近期得到了加快。根據StopTB Partnership (http://www. stoptb. org/),現有的和新型的技術被用於診斷髮病期和潛伏期的結核病，這些技術被應用於參考實驗室，臨床外周實驗室(POC)，而且這些實驗室含有不同類型的技術。這些技術包括(i)診斷和分類分析多重耐藥性結核菌株(MDR-TB)的核酸擴增試驗(NAAT)，比如 GenoType MTBDR 和 MTBDRplus(HainLifeSciences)，INNO-LiPARif. TB(CapiliaTB-Neo), GeneXpert MTB/RIF (Cepheid),環介導等溫擴增技術(TB-LAMP, Eiken ChemicalCo)，COBAS TaqMan MTB(Roche Molecular Systems), Gen-Probe 擴增結核分枝桿菌直接試驗(AMTD)和增強型AMTF(E-AMTF，Gen-Probe), LightCyclerTM結核分枝桿菌檢測試劑盒(LCTB, Roche Applied Science), Seeplex TB 檢測試劑盒(Seegene, Korea),BD-ProbeTecTM 直接和半自動化 ProbeTecTMET 系統(Becton Dickinson)和 AbbottLCx(Abbott Molecular)ο(ii)用於診斷潛伏性的結核分枝桿菌感染的Y-幹擾素釋放試驗(QuantiFERON -TB Gold In Tube, T-SP0T. TB )，TB斑貼試驗同樣用於診斷潛伏期感染。
(iii)抗原檢測，如脂阿拉伯甘露聚糖(LAM)和呼吸分析篩查試驗來檢測結核病。(iv)噬菌體試驗用來快速診斷多重抗藥性-結核病(MDR-TB)。(V)其他用來檢測藥物耐受結核分枝桿菌的方法包括量熱氧化還原指示劑法，顯微鏡觀察藥物敏感性(MODS)，硝酸還原酶試驗，薄層瓊脂培養、漂白顯微鏡、痰液過濾、痰液染色的重要螢光劑染色用於改進後的塗片鏡檢，發光二極體(LED)螢光顯微鏡用於改進後的直接塗片鏡檢。對撒哈拉以南非洲愛滋病流行地區的患者的研究表明，感染愛滋病病毒人群的結核病的發病率比未感染人群聞出8. 3倍。愛滋病病毒陽性的人的塗片鏡檢結核分枝桿菌的結果多為陰性，難以診斷。世界衛生組織已經針對愛滋病病毒陽性的人的陰性結核分枝桿菌塗片鏡檢結果建立了算法，用以診斷結核病。對痰液樣品進行PCR分析，相對塗片鏡檢來說，提高了靈敏度，雖然其數值有所變動，靈敏度為O. 85 (範圍為O. 36-1. 00)，特異性為O. 97 (範圍為O. 54-1. 00)。一種從C印heid發展而來的新的PCR方法，叫做GeneXpert MTB/RIF，其第一例報導的靈敏度和特異性，塗片鏡檢陽性、結核分枝桿菌培養陽性的患者為·98. 2%，塗片鏡檢陰性、結核分枝桿菌培養陽性的患者為72. 5%，該方法對檢驗給出了極大的保證。此外，Witwatersrand生殖健康中心和愛滋病研究中心針對成人肺結核病門診病人進行的一項研究表明，其中70%的結核病病人同時感染愛滋病病毒，顯示單個GeneXpertMTB/RIF試驗相對於單個BACTEC MGIT培養法的靈敏度為86%。此方法是一種以實時PCR為基礎的體系，只需要2分鐘的動手時間，就可以在2小時內得出檢測結果，結果中還包括對利福平的敏感性或抗藥性。該系統可以隨時隨地由「非技術熟練」人員操作完成，並且不需要生物安全級別的基礎設施。然而，這種方法的局限性是成本較高，並且依賴於當前的模塊格式，即儀器目前設置只有1-16，32和48的模塊，該模塊目前只限於低通量隨時檢測和小型實驗室檢測；在高通量實驗室，尤其是較高愛滋病/結核病發病率的中心，這仍然是迫切需要解決的問題。儘管存在這些局限性，世界衛生組織已經批准在結核病流行的國家使用GeneXpert MTB/RIF試驗來檢測結核病，並認定該方法是全球結核病診斷的一個重要裡程碑。為了響應全球健康的原則,流行病國家衛生系統實施GeneXpert MTB/RIF試驗,而功能性實施該試驗有很多方面需要注意。這包括確定與GeneXpert MTB/RIF實施相關的主要物流和操作有關問題(例如，藥筒的供應，GeneXpert裝置的停機時間)；建立樣品資料庫用來校準和驗證安裝的每個GeneXpert儀器得到的結果(在儀器被認可具備出具病人檢驗結果的資質之前)；生成合適的外部質量評估(EQA)程序以確保實驗室和非實驗室環境的持續性質量檢測。在特定的GeneXpert MTB/RIF檢測特性的基礎上，可以預測，驗證和EQA程序需要滿足如下標準1)測試材料必須包含完整的結核桿菌，以便於在GeneXpertMTB/RIF藥筒中捕捉信號；2)運輸EQA材料的過程必須是安全的；3)測試過程必須是安全的，而且與GeneXpert MTB/RIF當前測試方法相符合，非實驗室技術熟練的衛生工作者必須能夠在非實驗室環境中進行測試，作為國家級的方案測試程序需要具有成本效益和可持續發展性。除了上面描述的技術及其相關的不足之處，在愛滋病流行地區通過鑑定和定量結核分枝桿菌來診斷結核病有一些附加的併發症和影響=HIV感染往往導致痰液量的減少和痰液質量的降低。這將導致結核分枝桿菌培養陽性而其痰液塗片鏡檢陰性結果的增加。這反過來又導致結核病確診的延誤，進而導致疾病傳播風險的增加。此外，對愛滋病毒攜帶者進行結核病篩查以有助於合適的評估預防性治療以及對診斷為結核病的人群適於抗逆轉錄治療都需要診斷試驗。因此，結核病診斷的解決方案可能會成為多因素有關的，臨床算法，以及在不同場合不同類型的測試都可能需要。特別是，需要一個快速檢測方法來鑑定取自病人體內的樣品中含有結核分枝桿菌(即，該方法可以在24小時內提供結果)，而此方法應該相對容易進行，並且比較容易負擔得起。更進一步，有必要建立一種可靠的方法，與GeneXpert MTB/RIF檢測方法一起使用，用於建立樣本資料庫來校準和驗證通過該方法得到的結果，並進一步產生一個持續的外部質量控制評估。發明概述根據本發明的第一實施方案，本發明提供了一種鑑定細菌存在與否的方法，該方 法包括如下步驟從受試者採取的痰液樣本通過流式細胞儀進行檢測；在樣品中鑑別是否存在這樣的區域，相對於背景碎片區域，此區域內存在角螢光強度增加以及側散射(SS)增加或者前向散射(FS)增加。相對於背景碎片的存在角螢光增加以及角側散射增加或者前向散射增加的區域出現在螢光強度對角側(或者前向)散射圖上的約40-50°的角度區域，優選在約45°的角度區域。相對於背景碎片，存在角螢光增加以及角側散射增加或者前向散射增加的區域，說明樣品中含有細菌，最可能是分枝桿菌，比如結核分枝桿菌，恥垢分枝桿菌，牛分枝桿菌，鳥分枝桿菌和偶發分枝桿菌等，最有可能的分枝桿菌是結核分枝桿菌。相對於背景碎片的區域，不存在角螢光增加以及角側散射增加或者前向散射增加的區域，說明受試者可能不患有結核病。相對於背景碎片的區域，存在角螢光增加以及角側散射增加或者前向散射增加的區域，說明受試者可能患有結核病。所述受試者可以是人或者其他動物。背景碎片包括裂解的細胞，粘液，唾液或者類似物，這些是典型的同時存在於來源於結核病陽性和陰性受試者的痰液中的。在使用流式細胞儀進行檢測之前，對痰液樣本進行液化和/或淨化和/或滅活處理。優選地，痰液樣品被滅活。滅活劑可能選自包括如下的組中肌苷二磷酸(IDP)、Xpert SR緩衝液、加熱和加入溶菌酶。痰液樣品可以用核酸結合染料進行處理，比如金胺O、SYTO染料和碘化丙啶。流式細胞儀可以使用磁珠。細菌預先用包含螢光標記的磁珠、配體和/或者特異性抗體進行標記，並且用流式細胞儀進行檢測，來檢測角區域出現的情況。 本方法可以還包括在流式細胞儀檢測之前對痰液樣品進行液化和/或淨化和/或滅活處理。在進行液化和/或淨化和/或滅活處理之前亦可對痰液樣本進行體外培養。本方法還可以包括對鑑定到的細菌進行定量的步驟。
優選地，將定量液化的和/或淨化的和/或滅活處理的痰液樣本點樣到吸附性材料上。所用的吸附性材料可以選自以下的組中過濾卡片、濾紙、拭子、磁珠、樣品池和棉花。理想地，附性材料含有細菌野生株，參考菌株或者陰性對照。所述的吸附性材料可以與任何結核病診斷方法配合使用。特別地，所述的吸附性材料可以用作驗證結核病診斷方法，校準結核病診斷方法和/或作為外部質量控制評估(EQA)的工具。診斷方法選自由如下方法組成的組中，GenoType MTBDR和MTBDRplus ，INN0-LiPA Rif. TB, GeneXpert MTB/RIF,和環介導等溫擴增技術，COBAS TaqMan MTB, Gen-Probe 擴增結核分枝桿菌直接試驗(Gen-Probe Amplified MycobacteriumTuberculosis Direct Test) (AMTD)和增強型 AMTF (E-AMTF), LightCycler 結核分枝桿菌檢測試劑盒(LightCycler Mycobacterium Tuberculosis Direct Test) (LCTB), SeeplexTB 檢測試劑盒(Seeplex TB Detection Kit), BD-ProbeTec 直接和半自動化 ProbeTec ET系統和 Abbott LCx (BD-ProbeTec Direct and the semi-automated ProbeTec ETsystemand the bbott LCx)。特別是，該診斷方法是GeneXpert MTB/RIF試驗。·根據本發明的第二實施方式，本發明提供了一種製備含有細菌的吸附性材料的方法，該方法包括如下步驟i)根據上述方法鑑定並定量細菌；ii)將鑑定並且定量的細菌點樣至吸附性材料。細菌優選包括野生株、參考菌株或者陰性對照。根據本發明的第三實施方式，提供了一種吸附型材料，其中包含用上述方法製備的細菌。根據本發明的第四實施方式，提供了一種鑑定是否存在細菌的方法，並且在存在細菌的情況下，進行細菌定量。該方法包括如下步驟i)將從受試者採取的痰液樣本通過流式細胞儀進行檢測；ii)在樣品中鑑別是否存在這樣的區域，相對於背景碎片區域，此區域內存在角螢光強度增加以及角側散射增加或者前向散射增加；iii)如果樣本中存在相對於背景碎片區域，角螢光強度增加以及角側散射增加或者前向散射增加的區域，對細菌進行定量；iv)將定量的細菌點樣於用於疾病診斷的任何方法的吸附性材料上。相對於背景碎片區域存在角螢光增加以及角側散射增加或者前向散射增加的區域出現在螢光強度對側(或者前向)散射圖上的約40-50°的角度區域被，優選是大約
45。處。相對於背景碎片存在角螢光增加以及角側散射增加或者前向散射增加的區域，說明樣品中可能含有細菌，更可能是分枝桿菌，比如結核分枝桿菌，恥垢分枝桿菌，牛分枝桿菌，鳥分枝桿菌和偶發分枝桿菌等，最有可能的分枝桿菌是結核分枝桿菌或葡萄球菌或梭菌。相對於背景碎片的區域不存在角螢光增加以及角側散射增加或者前向散射增加的區域，說明受試者不患有結核病相對於背景碎片的區域存在角螢光增加以及角側散射增加或者前向散射增加的區域，說明受試者患有結核病受試者可能是人或者其他動物。背景碎片包括裂解的細胞，粘液，唾液或者類似物，這些是典型的同時存在於來源於結核病陽性和陰性受試者的痰液中的。在使用流式細胞儀進行檢測之前，對痰液樣本進行液化和/或淨化和/或滅活處理。優選地，痰液樣品被滅活。滅活劑可能選自IDP，Xpert SR緩衝液，加熱和加入溶菌酶。痰液樣品可以用核酸結合染料進行處理，比如金胺0，SYTO染料和碘化丙啶。 流式細胞儀可以使用磁珠。細菌預先用包含螢光標記的磁珠、配體和或者特異性抗體進行標記，並且用流式細胞儀進行檢測，來檢測角區域可能出現的情況。本方法可以還包括在流式細胞儀檢測之前對痰液樣品進行液化和/或淨化和/或滅活處理。痰液樣本在進行液化和/或淨化和/或滅活處理之前可以進行培養。所用的吸附性材料可以選自過濾卡片、濾紙、拭子、磁珠、樣品池和棉花。理想地，吸附性材料含有細菌野生株，參考菌株或者陰性對照。特別地，上述的吸附性材料可以用來驗證結核病診斷方法，校準結核病診斷方法和/或作為外部質量控制評估(EQA)的工具。診斷方法可以選自，GenoType MTBDR 和 MTBDRplus ，INN0-LiPA Rif.TB, GeneXpert MTB/RIF, GeneXpert MRSA, GeneXpert 艱難梭菌(GeneXpert C. difficule)和環介導等溫擴增技術，COBAS TaqMan MTB, Gen-Probe擴增結核分枝桿菌直接試驗(AMTD)和增強型AMTF(E-AMTF) ,LightCycler 結核分枝桿菌檢測試劑盒(LCTB)，Seeplex TB檢測試劑盒，BD-ProbeTec 直接和半自動化ProbeTec ET系統和Abbott LCx。圖的簡單描述圖I:流式細胞儀的散點圖，顯示了恥垢分枝桿菌的螢光強度I(FLl)對側散射
(SS)的圖，恥垢分枝桿菌為結核分枝桿菌近支。圖中顯示了細菌群的典型的角形狀，即存在螢光強度I(FLl)和側散射(SS)的增加特性。圖2:流式細胞儀散點圖用來鑑定塗片鏡檢陽性、培養陽性的痰液樣品，根據與背景碎片對比，採用基於增加的螢光強度I(FLl)和增加的側散射(SS)特性的角區域確定分枝桿菌的存在。圖3:流式細胞儀散點圖，用同樣的方法來鑑定塗片鏡檢陰性、培養陰性的樣品。一個圖顯示角區域沒有增加，另一個樣品顯示不存在角區域，說明沒有細菌存在，只有碎片。圖4:顯示了在過濾卡片上和在含有乾燥劑袋的塑料轉移袋中的乾燥培養點(DCS)樣品。通過藍色染料染色，可見四個過濾卡片上的乾燥培養點(DCS)含有滅活的結核分枝桿菌培養物。圖5:顯示了採用了側向散射閾值的流式細胞儀的散布圖，並根據金胺角螢光增加和入射雷射角側散射增加來計算B區域中鑑定的細菌。除了 B區域之外的其他區域顯示為最低的背景碎片。圖6 :顯示了 H37Rv結核分枝桿菌單細胞培養物的Xpert MTB/RIF擴增循環閾值(縱軸)相對於流式細胞儀計算的培養物濃度(橫軸)的圖。圖7 :顯示了三批乾燥培養點(DCS)的探針A的Ct值的頻率分布圖與其標準曲線相重疊。Ct值的標準差和平均值見圖示。本發明的詳細描述申請人:已經開發出一種細菌的快速鑑定方法。本領域的技術人員將會意識到這種鑑定方法可以延伸用於所有的革蘭氏陽性細菌，包括放線菌，厚壁菌(Firrmicutes)和無壁菌(tenericutes)。特別是，申請人發明了一種鑑定放線菌，更具體地說是分枝桿菌，以用於診斷結核病(TB)的方法，該方法包括通過流式細胞儀檢測來自受試者的痰液樣品並分析其側散射或前向散射區域及其螢光特性。分枝桿菌(如結核分枝桿菌，恥垢分枝桿菌，牛分枝桿菌，鳥分枝桿菌和偶發分枝桿菌等等)能夠通過這個高通量檢測平臺直接從痰液中被檢測，並且可以在當天或者24小時內得到鑑定結果。受試者可以是人或者動物(動物舉例如牛類、家畜、鳥類、豬、牛、犬和野生動物，比如水牛、鹿和獅子)。
流式細胞儀是一種用來鑑別顆粒的技術，比如血紅細胞、白細胞、細菌和完全懸浮的染色體。通過利用聚焦的雷射光源，根據每個物體或顆粒幹擾雷射束時散射的入射光的量可以檢測這些顆粒。這個方法的優點是分析鑑定的速度以及可以對不可見的滅活微生物進行檢測。每秒可以檢測分析幾千個顆粒。流式細胞儀目前被用在病理學檢測上，比如CD4計數，人體的CD4細胞數可以用來表徵個體的免疫狀態，測定愛滋病病毒感染者的發病到愛滋病的程度。這項技術被廣泛應用在南非的約60個三級和二級(地區醫院)醫療機構的國家實驗室內。因此，使用新的結核病診斷方法不需要任何額外的設備或高級技術人員，從而醫療機構能夠承擔得起這項技術並且比較容易配備此技術。流式細胞儀只能夠對自由懸浮顆粒進行檢測分析，而且對於使用流式細胞儀對細菌進行檢測這方面的信息已經有了幾次的描述(2，8)，最新的是在鑑定結核分枝桿菌中的應用(1，3-7)。然而，這些研究大多數描述的是鑑定體外培養的分離的細菌，而沒有直接從痰液樣品中鑑定細菌並用以快速診斷的相關研究。本發明是直接從痰液樣品中鑑定分枝桿菌，而痰液樣品中含有其他的細胞和顆粒。鑑定從培養物中分離的分枝桿菌的流式細胞儀檢測圖譜為典型的角形狀，該角形狀具有增強的螢光強度I (FLl)和側散射(SS)(或者前側散射(FS))特徵；此外，申請人可以用同樣的方法在低至10個細菌/毫升的細菌濃度條件下能夠鑑定恥垢分枝桿菌和結核分枝桿菌(圖I)。申請人:已經發現，使用角區域，含有細菌的樣品相對於背景細胞而言具有變化的增強的螢光強度，以及變化和增加的側散射或前向散射，以及這兩者相結合再加上角區域的特徵可以用來鑑定痰液樣品中存在細菌。總體而言，痰液中的細菌的螢光強度，側散射或前向散射的參數(特別是FLl)大於背景碎片(比如溶解的細胞和粘液)的螢光強度和側散射模式。更特別的是，在螢光強度對側向散射的散點圖中，在約40-50°角區域，優選為大約在45°處，畫出的角狀圖譜，可以用作鑑定痰液樣品中存在的細菌。痰液樣品中可以加入磁珠。磁珠的直徑範圍是約O. 8 μ m-12 μ m，優選是約I μ m。痰液樣品可以用染料進行處理，比如金胺O、SYTO染料、碘化丙啶或者其他合適的核酸結合染料，和/或標記的配體，和/或標記的抗體。其他的參數可以用來提高痰液樣品中細菌的檢測效率，包括
使用貝克曼庫爾特公司(Beckman Coulter)的Gallios流式細胞儀,該儀器能夠增加檢測特徵，比如廣角前向散射螢光用來提高小顆粒的檢出率；使用Gallios流式細胞儀，該流式細胞儀可以檢測顆粒的飛行時間(TOF)用來從雙峰顆粒中區分單顆粒；使用直徑為I μ m的磁珠來設定顆粒大小的閾值；以及包括一個陰性活柵極-同時設定一個角度，來消除由碎片區域 產生的信號。 在不限制本申請在其他儀器平臺中的應用的基礎上，後者可以改善本發明的檢測靈敏度。除了這些儀器參數，對於該方法，還有一些其他的能夠增加針對背景碎片的檢測細菌的靈敏度的特徵。例如，流式細胞儀樣品管中的背景碎片可以通過下面方法來減少，防止核酸結合染料和磷酸鹽緩衝液之間的沉澱，防止過氧乙酸和染料或者緩衝液之間的沉澱。本發明的方法從痰液樣品中鑑定細菌用圖2來說明，其中5張圖都是結核病痰液樣品實例，其塗片鏡檢和培養均為陽性。X-軸是側散射(SS)，Y-軸是螢光強度I (FLl)。相對於背景痰液碎片，圖中畫出的角狀區域說明了細菌的存在。細菌(此處為結核分枝桿菌)很容易被鑑定，只要此區域存在增加的角螢光強度和增加的角側散射。在上述角狀區域之外的區域是痰液樣品的背景碎片。圖3進一步證明，對塗片鏡檢和培養均為陰性的樣品進行檢測，流式細胞儀檢測圖譜中沒有上述的特徵，證實了樣品中沒有細菌的存在。儘管本發明目前是非特異性的，並且不能夠識別細菌尤其是結核分枝桿菌，或者檢測藥物敏感性，但此方法可以用作高通量篩選方法。一旦準備好樣品，32個樣品可以同時被加入到流式細胞儀進行檢測，並且可以在40分鐘內完成對所有32個樣品的分析。對於HIV臨床醫師來說這個方法特別有用，在對愛滋病病人開始抗逆轉錄治療(ART)之前需要確保病人為非結核病患者。此外，此方法不依賴於擴增進行檢測，其費用與PLG(NHLS標準測試)的CD4細胞計數方法的花費相同或者比之更少。本發明的方法可以用來作為一種篩選試驗，以鑑定在痰液樣品中是否存在細菌。那些「標記」的或者陽性的結果可以進一步用GeneXpert進行分析從而得到結核分枝桿菌陽性的結論及其對利福平的抗藥性/敏感性的結論。總體而言，這樣可以減少基於PCR技術的GeneXpert藥筒的消耗，並且僅僅用在證實陽性結果包括利福平的抗藥性/敏感性。因此，無需塗片鏡檢和細胞培養試驗，目前可以進行CD4流式細胞儀檢測的實驗中心均可以使用本方法來診斷分散的結核病病例。儘管無法鑑定特定類型的細菌，本發明使用流式細胞儀的方法能夠鑑定任何存在的細菌，然後可以由細菌類型特定的方法作進一步分析。t匕如，葡萄球菌和梭菌也可以用這種方法進行鑑定，儘管已經發明了了 GeneXpert MRSA和GeneXpert C. difficule 這兩種方法。很明顯，相對傳統的鑑定方法，按照本發明通過流式細胞儀來鑑定細菌，具有如下的優點i)流式細胞儀能夠快速(> 1000個/秒)鑑定整個的滅活的單個完整的細菌樣品，從而規避了傳統的耗時的菌落形成及計數方法；同時ii)低濃度(< 10個/μ I)的細菌樣品可以被精確計數(使用校準微球)，即流式細胞儀單個細菌計數可以低於最低麥克法蘭濃度(1x107細菌/ml)下進行。本發明進一步描述了由分子醫學系和血液研究所診斷科(約翰尼斯堡的威特沃特斯蘭德大學)正在進行的一項研究，主要用以解決GeneXpert MTB/RIF試驗的實際應用的相關問題。特別是如下的方法，建立一個樣品資料庫用來校準和驗證安裝在不同地區的GeneXpert儀器所獲得的結果，同時生成EQA程序以確保穩定持續的檢測質量。特別地，本發明描述了在樣品中鑑定分枝桿菌的用途，尤其是依據本發明使用流式細胞儀對結核分枝桿菌的鑑定和計數。此處被檢測的結核分枝桿菌可以直接來自於痰液樣品或者來自於收穫的細胞培養物。結核分枝桿菌在點樣於過濾卡片上之前，根據標準方法進行滅活，再使用流式細胞儀進行定量。使用這些乾燥培養點(DCS)具有明顯優勢，容易操作，降低了生物危害性的風險，可以被運送到任何的GeneXpert MTB/RIF檢測點，可以將每個病人的樣本分離開來進行測試。乾燥培養點(DCS)可以被收集開並分配給具備診斷結核病的GeneXpertMTB/RI試驗條件的每個中心。尤其是，獲得的乾燥培養點(DCS)可以用於校準和/或維持和/或驗證 進行檢測的GeneXpert設備及其獲得的實驗結果。各種臨床(和美國菌種保藏中心(ATCC))菌株，非結核分枝桿菌(NTM)和陰性對照所得到的乾燥培養點(DCS)可以用在每月/每年的EQA監測中。這個方案具有滿足全國範圍以及周邊國家的診斷需求的潛力。在全國範圍內實施Xpert MTB/RIF試驗面臨的一個挑戰是安裝儀器的地點及其後續的結果驗證和持續性能監測檢驗。作為南非國家衛生實驗室服務(NHLS)國家優先項目推出GeneXpert MTB/RIF計劃的一部分，全國各地所有的9個省份在2011年的3_4月期間安裝了 31臺GeneXpert (Gx)儀器。這個總額為286的Gx模塊在被認可具備「適合目的(fit for purpose) 」的資質之前,還需要進行驗證。申請人:設想，實現這一目標的唯一途徑是通過EQA計劃。這個計劃的難處在於結核病感染性的測試材料。這是一個巨大的挑戰，申請人通過使用滅活的結核分枝桿菌和乾燥培養點(DCS)這種運輸簡便的材料，克服了這個挑戰。然而，使用滅活結核分枝桿菌培養材料的難處在於無法對細菌濃度進行定量(cfu/ml)，因為滅活的細菌是沒有辦法再次培養的。申請人通過使用流式細胞儀對細菌進行計數從而再次克服了這個困難。因此，申請人通過如下途徑獲得了成功⑴開發了乾燥培養點(DCS)(包括其穩定性)材料來建立結核分枝桿菌的EQA程序；(2)增加新的Xpert MTB/RIF檢測點(通過驗證)；(3)擴大規模以滿足持續的EQA活動；(4) 一旦開發，NHLS可以提供常規服務。現在，將參照下面描述的實施例對本發明進行更加詳細的描述。無論如何，這些實施例都不會以任何方式限制本發明的範圍。比如，除了使用側向散射和螢光強度I (FLl)，也可以使用前向散射(FS)，例如在使用另一種染料的情況下使用另一個螢光通道進行檢測。此外，可以理解的是術語「過濾卡片」包括任何材料，分枝桿菌可以點樣於其上並乾燥，並且具有吸附性的能夠保留點樣細菌的任何表面。典型地，術語過濾卡片可能包括拭子、紙、棉花、樣品池、棉紙或者類似物。
實施例I.使用流式細胞儀對結核分枝桿菌進行定量的概述a)從受試者採集痰液樣品。b)標準方法，使用氫氧化鈉(NaOH) -N-乙醯基_L_半胱氨酸(NALC)-檸檬酸鈉溶液來液化和淨化痰液樣品。
c)隨後用過氧乙酸滅活細菌1倍體積的處理過的痰液樣品加入I倍體積4%過氧乙酸使得過氧乙酸終濃度為2%。d)在層流櫃(Bioflow)中室溫保溫30分鐘後，將試管從層流櫃下移出並放在實驗臺上進行下一步工作。e)通過水洗的方法除去過氧乙酸，即離心後用水再次懸浮。f) 50 μ I的這種溶液加入到Iml金胺O染料(核酸結合染料)中，並且保溫5_10分鐘。g)根據下面的試驗設計使用流式細胞儀檢測樣品I.使用直徑為I μ m的流式細胞儀磁珠，這個閾值的大小被設定在僅略低於I μ m的水平，因此磁珠在前向散射和側散射雙重圖譜上均可見。·
ii.在第二張圖上，FLl (Y軸的螢光I)相對於側散射(X軸)的圖譜上，45°處的區域被認為是存在細菌的證明。這個區域被用來證明細菌的存在，這個區域具有變化的(增加的)側散射和變化是(增加的)螢光強度，因此是一個45°的角狀區域。這個角狀區可以清晰地將細菌從背景碎片分離出來。背景碎片由痰液樣品中溶解的細胞、粘液等組成。2.結核分枝桿菌在液體培養基中的生長用來進行培養的結核分枝桿菌有三個來源(I)合同實驗室服務(CLS，約翰尼斯堡，南非)分離得到的RIF臨床敏感株的微生物生長培養管(MGIT)中的匯集樣品，並且通過MTBDRplus (海恩生命科學(Hain Life Sciences))線性探針分析檢測;⑵來自ATCC(美國菌種保藏中心)的S-MYCTU-02-P2和MYCTU 15菌株的匯集的微生物生長培養管；(3)實驗室菌株H37Rv (美國菌種保藏中心/ATCC)用作單細胞生物懸浮液的培養物。MGIT方法使用改良的米德爾布魯克(Middlebrook) 7H9肉湯培養基為基礎，力口入MGIT生長補充劑和PANTA (Becton Dickinson公司)，並在一個BACTEC安全櫃中，37°C培養42天。陽性培養物進行ZeihlNeelsen染色以確定其存在抗酸桿菌(AFB)。對於單細胞懸浮液，實驗室凍存的H37Rv菌株培養在8ml米德爾布魯克(Middlebrook) 7H9肉湯培養基(Difco實驗室，底特律，密西根)中，培養基中加入O. 2%甘油，米德爾布魯克(Middlebrook)油酸-白蛋白葡萄糖-過氧化氫酶(0ADC，Merck)富集物，和O. 05%吐溫80以防止細胞結塊，在25ml的細胞培養瓶(Greiner Bio-one)中培養5天。然後，該預培養物接種到含有200ml上述培養基的550ml組織培養瓶中，並且在37°C靜止生長10天。3.培養的結核分枝桿菌的滅活細菌使用一定量的化學和酶活化劑進行處理，包括IDP，Xpert SR緩衝液，加熱，低濃度溶菌酶，或者這些方法的組合，以確保完全破壞維持細胞結構和組成的組織，並必須確保流式細胞儀對細菌的一致的精確計數。由於PCR需要整個細菌，此操作對於結合使用GeneXpert MTB/RIF試驗至關重要。例如，簡單地說，實驗室S-MYCTU-02-P2和MYCTU15以及臨床分離的菌株的MGIT培養後，培養基被倒出(與細菌分開)，離心分離細胞，用40ml PBS緩衝液再次懸浮，然後加入80ml (緩衝液細菌培養物為2 DGeneXpert樣品反應劑(SR)緩衝液(試劑盒中提供的)。對H37Rv株，200ml培養物通過在室溫下以3500Xg離心10分鐘收穫菌體，並重新懸浮於滅菌的PBS緩衝液至終體積為40ml，隨後加入80ml SR緩衝液(緩衝液細菌為2 I)。MGIT培養物或者H37Rv菌株培養物在SR緩衝液中在室溫下保溫2小時，並通過間歇性混合以確保所有菌的滅活狀態及其安全性，在不影響細菌大小的情況下便於流式細胞儀的檢測。滅活的菌用無菌的PBS緩衝液洗滌兩次，再用PBS緩衝液懸浮至終體積為IOml (MGIT)和40ml (H37Rv)。如果使用金胺O染料，滅活的結核分枝桿菌用蒸餾水洗滌並懸浮，因為SR緩衝液會引起染料的沉澱和粹滅。為了確認已經滅活，將洗滌過的培養物(0.5ml)重新接種到新的MGIT培養管中。將滅活的分散的培養物通過流式細胞儀計數前，將MGIT培養物在BACTEC安全櫃中培養最多42天以確認樣品是否已經滅活。4.流式細胞儀對細菌進行定量如果細菌存在任何可視的結塊，10次通過26號針頭並在一個桌面頂部探頭超聲清洗系統(Fisher Scientific)超聲破碎處理2分鐘，將其打散(32)。SR滅活的，清洗並濃縮的結核分枝桿菌(10 50 μ I)加入到含有Iml PBS的藍色流式細胞儀試管(Beckman Coulter)。每個流式細胞儀試管中隨後加入100 μ I金胺O染料(Diagnostic MediaProduction, NHLS, South Africa), 50 μ I 流式計數微球(10 μ m) (Beckman Coulter)，然後根據製造商說明立刻在FC500流式細胞儀(Beckman Coulter)上進行分析。作為初步試驗，Iym的微球(Beckman Coulter)用以設定大小閾值(鑑別器)和光散射參數的放大增益。在流式細胞儀計數之前，用PBS緩衝液對細菌培養物進行稀釋(I : 4到I : 200倍稀釋)。二維散點圖設定為前向散射(FS)(垂直軸)對側散射(SS)(水平軸)用以鑑定接近I μ m大小的細菌；第二張圖螢光I (FLl) (530nm)對側散射(SS)在螢光增加的情況下用以確定樣品中存在細菌；第三張圖FS線性對螢光2(FL2) (570nm)用以鑑定流式微球數，並利用CXP軟體(Beckman Coulter)達到自動計數的目的。存在上述現象的區域被認定含有細菌。一旦流式細胞儀確定了滅活的結核分枝桿菌培養物的濃度，使用Xpert MTB/RIF試驗分析不同濃度。5. Xpert MTB/RIF 試驗Xpert MTB/RIF 半巢式實時 PCR試驗(C印heid，Sunnyvale，CA)擴增 507-533 區域的rpo B基因的RIF抗性決定區域(RRDR)的81bp片段。由於實時PCR特性，Xpert MTB/RIF得到的結果是定性和半定量的。前者描述了是否存在結核分枝桿菌並測定了是否存在RIF抗性。後者描述了 5個探針(A-E)的循環閾值(Ct)和內部對照。Ct值在6Ct的半定量類別報告中報導，其值為非常低、低、中和高。滅活、清洗並計數的結核分枝桿菌培養物稀釋後加入2. Oml SR緩衝液並直接放入Xpert MTB/RIF藥筒樣品端孔，藥筒放入GeneXpert儀器進行處理。根據製造商說明和試驗的特異性，半定量類別的Ct值的範圍是高 28。Xpert MTB/RIF探針A的Ct值與流式細胞儀計數打分進行比較，產生中等Ct值(Ct值在16-22之間)定量Xpert MTB/RIF結果的稀釋物隨後用於準備乾燥培養點(DCS)。6.準備和評價乾燥培養點(DCS)DCS按照以下方法製備25μ I的滅活培養物點樣到Whatman903過濾卡片，同時每個樣品點加入2 μ I DNA加樣染料(Sigma-Aldrich)用來顯示樣品(圖4)，並在室溫乾燥至少I小時。在分配到監測點之前，每批製造的乾燥培養點(DCS)的樣品點用XpertMTB/RIF進行檢測。乾燥培養點(DCS)的卡片被放置在密封的含有乾燥劑袋的塑膠袋(Sigma-Aldrich)中並快遞(η = 16),或者運輸(η = 9),或者郵寄(將乾燥培養點送至4個站點)至每個Xpert MTB/RIF的檢測點。在每個檢測點，每個乾燥培養點(DCS)使用無菌剪刀進行切割並放入一個50ml標準實驗室Nunc離心管(AEC Amersham)，離心管中同時加入2. 8ml SR緩衝液(確保在乾燥培養點接種後有足量的2ml SR緩衝液可以轉移至XpertMTB/RIF藥筒)。離心管用渦旋振蕩器振蕩(或者用力手搖振蕩)進行混合，並在室溫下保溫15分鐘，保溫的同時根據樣品處理所述進行間隙性混合。15分鐘保溫之後，2ml混合物轉移至XpertMTB/RIF藥筒中並根據製造商說明在GeneXpert測試進行檢測。在測試點檢測完每個GeneXpert模塊之後，選擇每個模塊所得到的結果進行存檔，並且生成GeneXpert存檔文件(.gxx)通過郵件發送至中心協調員進行驗證。一旦協調員收到這些結果，這些結果被輸入到當地的GeneXpert資料庫，隨後輸出逗號分隔值(.csv)文件並達到數據收集和報告的目的。一份詳細的SOP被傳播至檢測點，為EQA程序描繪了存檔和郵寄過程。7.統計分析XpertMTB/RIF試驗得到的定性和定量的Ct值記錄了每一批乾燥培養點(DCS)的··每個GeneXpert測試模塊。每批使用的探針，在其首次達到擴增循環閾值時，計算得出平均值、標準偏差和變異係數。這些同樣在頻率分布圖中得到體現。流式細胞儀檢測計數的分值和XpertMTB/RIF試驗的Ct值之間的關係可以通過線性回歸法進行定量。8.結核分枝桿菌分散培養物的製備、滅活以及流式細胞儀計數用來製備乾燥培養點(DCS)的所有培養物在與SR緩衝液保溫2小時後，在MGIT中保溫42天亦無生長，確認了培養物已經被滅活。由於其聚集(cording)特性，製備的MGIT培養物樣品池出現了結核分枝桿菌的結塊，需要在流式細胞儀檢測之前用超聲波處理；而當培養基中含有甘油和吐溫80時，培養物不需要用超聲波預處理即可得到單細胞懸浮液，更加容易通過流式細胞儀進行鑑定(圖5)。流式細胞分析使用了側散射(SS)閾值，相對於使用前向散射(FS)閾值，能夠得到更好的計數的分值。如圖6所示，對於H37Rv單細胞懸浮液分散培養物的檢測，流式細胞儀計數和使用探針A的Xpert MTB/RIF擴增的Ct值具有很好的相關性(R2 = O. 948)。SR緩衝液確實引起沉澱(流式細胞儀檢測到更多的背景碎片)和引起螢光染料金胺的粹滅，該染料在流式細胞儀檢測時用來鑑定細菌。因此在加入金胺染料和流式細胞儀檢測之前，必須用蒸餾水清洗並再懸浮細菌培養物。SR緩衝液保溫2小時滅活細菌並不影響細菌的大小，而且Iym的磁珠可以用在流式細胞儀檢測中以精確鑑定存在的結核分枝桿菌。9.使用乾燥培養點(DCS)對測試點的Gene Xpert儀器運行Xpert MTB/RIF進行驗證三批乾燥培養點(DCS)被製備並用來驗證31臺Gene Xpert儀器{Gx-Infinity-48 (η = I) ；Gxl6 (η = 9) ；Gx4 (η = 21)}。總共 286 份乾燥培養點(DCS)被送至檢測點，最終回收了 274份乾燥培養點(DCS)的檢測結果。其中有6份檢測錯誤的報告，其餘268份乾燥培養點(DCS)的檢測結果與預期相一致，為100%的結核分枝桿菌陽性和Rif敏感性(表I給出了一個匯總的結果)。六個錯誤報告為GeneXpert錯誤代碼5011 (η=5)和5007 (η = I)。這個總體錯誤概率為2. 19% (6/274)來自於用戶錯誤(加入試劑量不正確)和藥筒錯誤(液體傳輸失敗或者管壓消失)的結合導致的錯誤編碼，而且這些並不代表乾燥培養點(DCS)方法的失敗。兩個檢測點在錯誤模塊上重複了乾燥培養點(DCS)的測試，並且得到了陽性的結果(通過)，額外的乾燥培養點(DCS)被發送至其他需要模塊重複測試的檢測點。探針A是達到擴增循環閾值的第一探針，並具有一個平均的Ct值為22，在中/低邊界的上限。6個Ct值的範圍確定了探針A的類別(從低至中等)，而且三批乾燥培養點的標準差為< 3. 47Ct，說明乾燥培養點(DCS)批次之間的高精度和低變異。圖4的頻率分布圖說明三批乾燥培養點(DCS)的Ct值分布在探針A的Ct值的平均值附近。單細胞培養物中，批次V005具有最大的變量(14. 4% CV)。除了乾燥培養點(DCS)對GeneXpert模塊驗證的定量結果之外，乾燥培養點(DCS)的方案還確定了其他問題，這些有助於協助實施的進行(詳見表3)。在EQA報告中，不能提交正確文件格式(存檔的.GXX格式)的檢測點被認定為不符合要求。實施乾燥培養點 (DCS)的方案不需要破壞含有乾燥培養點(DCS)的濾紙材料，但是嘗試破壞含有乾燥培養點(DCS)的濾紙材料的3個檢測點在結果上沒有任何差異，除了其探針A的平均Ct值較低。較低的Ct值可能是由於SR緩衝液對細菌的重懸浮引起更多的細菌用於擴增。沒有返回結果的檢測點表明這些檢測點需要調查整體的Gx操作程序並與標準操作程序保持一致。表I.在268Gx模塊上三批乾燥培養點(DCS)的檢測結果
I
烹養點(DCS)V002V004V005
批次號____
結核分枝桿菌分散培MGIT臨床對照結ii H37實驗室菌株結
m忮分忟g囷 _ 概
用乾燥培養點(DCS)拓右抝韋奸拔公173，所有均為結核..拓右抝鬥妹訪公
測試的 GeneXpert 模分枝桿菌 RIF 敏感τ οπ mm
塊的數目__枝桿菌—敏感 (161臟結蜀枝桿菌RIF敏感
錯誤數目1(5011)(2%)50^(11)1] %I (5011), 1.6%
進行統計分析的乾燥
培養點(DCS)的數4815763
J____
非常低:0%非常低:5.1%非常低:6.25%
任何定性類別的百分低:26.53%低:47.13%低:42.19%
比中等:69.39%中等:47.77%中等:48.44%
__高:2.04%__高:0%__高:1.56%
探針 A 的平均 Ct 值— A: 20.75A: 22.58A: 21.89
A: 2.20A: 2.76A: 3.47
隻____
=A 的Ct值的變化10.6%12.22%15.86%
係數____
南非面臨著巨大的醫療保健挑戰，目前超過一百萬的愛滋病感染者正在接受抗逆轉錄病毒治療，2009年報導結核病的發病率是每10萬人口 941例，其中9070例為多重耐藥性結核病(MDR TB)。2010年全國9個省份的244個NHLS實驗室進行的痰液塗片鏡檢的測試總數為約四百七十萬(平均每名患者2個塗片鏡檢)。基於這個全國範圍的數據，GeneXpert試驗實施的30臺Gx儀器僅僅只有11. I %的覆蓋率，達到完全的覆蓋率則需要大於250臺Gx儀器。通過資格預審核平臺的建立和20個新的實驗室監測點總計約50臺HIV病毒載量的分子檢測儀器，這個國家HIV病毒載量檢測的成規模的快速(I年以內)發展路徑，通過吸取這個經驗，GeneXpert實施計劃也可以得到快速發展。結核病的EQA程序所遇到的主要挑戰是用來測試的材料的傳染性特徵。申請人已經表明，通過使用滅活的結核分枝桿菌同時使用乾燥培養點(DCS)這樣易於運輸的材料，在實驗室和臨床檢測點可以提供安全的Xpert MTB/RIF方法的EQA程序。乾燥培養點(DCS)材料在驗證Gx儀器被證明是100%成功的。乾燥培養點(DCS)還可以標識錯誤代碼及其頻率，根據Gx模塊的性能，國家計劃預期其最低的錯誤率(2.1%)已包括在計劃成本中。其他需要監測的方面，比如從接受標本到報告結果的周期，也可以通過此乾燥培養點(DCS) 程序監測，並找出有問題的檢測點。申請人:設想，未來對Xpert MTB/RIF試驗的EQA程序組件的設計，可以類似地基於LPA程序,使用一種泛敏感(pansusceptible)菌株,一種攜帶常用的rpoB基因突變的RIF單抗性菌株，一種多重抗藥性的菌株，一種NTM菌株和一個陰性對照。使用乾燥培養點(DCS)，這些菌株可以被點樣在同一張過濾卡片上，並在3個月或者6個月分發給每個檢測點(根據正在進行的乾燥培養點(DCS)穩定性測試結果)，每個點樣點含有一種不同的菌株。此外，申請人將目前的技術作為形成平臺來發展Xpert MTB/RIF試驗的EQA程序的其他方面。這些方面包括對於每批試劑監測無效檢測率，RIF變異率(或混合藥物耐藥/敏感性)和測試的標本目錄(和技術員/健康護理人員操作該測試)。這些方法需要創新的信息技術方案，由於Gene Xpert儀器需要接口連接實驗室信息系統，因此這還可以是將沒有被實驗室信息系統接收的EQA結果返回的通道。參考文獻I. Burdz, T. V.，J. Wolfe, and A. Kabani. 2003. Evaluation of sputumdecontamination methods for Mycobacterium tuberculosis using viable colonycounts and flow cytometry. Diagn Microbiol Infect Dis 47 :503-9.2. Ibrahim，P.，A. S. Whiteley，and M. R. Barer. 1997. SYT016 labelling and flowcytometry of Mycobacterium avium. Lett Appl Microbiol 25 :437-41.3. Moore, A. V.，S. M. Kirk, S. M. Callister, G. H. Mazurek, and R. F. Schell. 1999.Safe determination of susceptibility of Mycobacterium tuberculosis toantimycobacterial agents by flow cytometry. J Clin Microbiol 37 :479-83.4. Pina-Vaz, C.，S. Costa-de-Oliveira，and A. G. Rodrigues. 2005. Safesusceptibility testing of Mycobacterium tuberculosis by flow cytometry with thefluorescent nucleic acid stain SYTO 16.J Med Microbiol 54 :77-81.5. Pina-Vaz, C.，S. Costa-Oliveira，A. G. Rodrigues, and A. Salvador. 2004.Novel method using a laser scanning cytometer for detection of mycobacteria inclinical samples. J Clin Microbiol 42 :906-8.6. Reis, R. S.，I. Neves, Jr.，S. L. Lourenco , L. S. Fonseca , andM. C. Lourenco. 2004. Comparison of flow cytometric and Alamar Blue tests with theproportional method for testing susceptibility of Mycobacterium tuberculosis torifampin and isoniazid. J Clin Microbiol 42:2247-8.7. Soejima，T.，K. Iida，T. Qin，H. Taniai，and S. Yoshida. 2009. Discriminationof live, anti-tuberculosis agent-injured, and dead Mycobacterium tuberculosisusing flow cytometry. FEMS Microbiol Lett 294 :74-81.8. Steen, H. B.，E. Boye，K. Skarstad, B. Bloom，T. Godal, and S. Mustafa. 1982. Applications of flow cytometry on bacteria cell cycle kinetics，drug effects，and quantitation of antibody binding. Cytometry 2 :249-57.
權利要求
1.一種鑑定存在或者不存在細菌的方法，該方法包括如下步驟 i)用流式細胞儀檢測受試者痰液樣本； ii)在樣品中鑑定是否存在這樣的區域相對於背景碎片區域，此區域內存在角螢光強度增加以及角側散射增加或者前向散射增加。
2.根據權利要求I的所述方法，其中相對於所述的背景碎片區域存在所述角螢光增加以及角側散射增加或者前向散射增加的區域，出現在螢光強度對側(或者前向)散射圖上的約40-50°的角度區域。
3.根據權利要求I的所述方法，其中相對於所述的背景碎片區域存在所述角螢光增加以及角側散射增加或者前向散射增加的區域，出現在螢光強度對側(或者前向)散射圖上的45°的角度區域。
4.根據權利要求I至3中任一項所述的方法，其中所述的細菌為分枝桿菌。
5.根據權利要求4所述的方法,其中所述的分枝桿菌選自於如下種屬結核分枝桿菌，恥垢分枝桿菌，牛分枝桿菌，鳥分枝桿菌和偶發分枝桿菌。
6.根據權利要求5所述的方法，其中所述的分支桿菌為結核分枝桿菌。
7.根據權利要求I至6中任一項所述的方法，其中相對於所述背景碎片區域，不存在角螢光增加以及角側散射增加或者前向散射增加的區域，說明受試者不患有結核病。
8.根據權利要求I至6中任一項所述的方法，其中相對於所述背景碎片區域，存在角螢光增加以及角側散射增加或者前向散射增加的區域，說明受試者患有結核病。
9.根據權利要求I至8中任一項所述的方法，其中所述的背景碎片包括裂解的細胞，粘液或者唾液。
10.根據權利要求I至9中任一項所述的方法，其中所述的痰液用核酸結合染料進行處理，該染料選自金胺O、SYTO染料和碘化丙啶。
11.根據權利要求I至10中任一項所述的方法，其中所述的細菌用磁珠、配體或者抗體進行預先標記。
12.根據權利要求11所述的方法，其中所述的磁珠、配體或者抗體包含螢光標記。
13.根據權利要求I至12中任一項所述的方法，該方法還包括在使用流式細胞儀檢測之前，對所述痰液樣本進行液化和/或淨化和/或滅活處理的步驟。
14.根據權利要求13所述的方法，其中在對所述痰液樣本進行液化和/或淨化和/或滅活處理之前，培養所述痰液樣品。
15.根據權利要求I至14中任一項所述的方法，該方法還包括對所述鑑定的細菌進行定量的步驟。
16.根據權利要求13至15中任一項所述的方法，其中對所述的痰液樣本進行液化和/或/淨化和/或滅活處理的步驟是將所述痰液樣本點樣到吸附性材料上。
17.根據權利要求16所述的方法，其中所述的吸附性材料選自如下幾種材料過濾卡片、濾紙、拭子、磁珠、樣品池和棉花。
18.根據權利要求16或者17所述的方法，其中所述的吸附性材料中含有細菌野生株、參考菌株或者陰性對照。
19.根據權利要求16至18中任一項所述的方法，其中所述的吸附性材料與任何結核病診斷方法配合使用。
20.根據權利要求16至19中任一項所述的方法，其中所述的吸附性材料與任何結核病診斷方法配合使用，用來驗證此結核病診斷方法和/或校準此方法和/或作為外部質量控制評估(EQA)的工具。
21.根據權利要求19或者20所述的方法，其中所述的診斷方法選自=GenoType⑧MTBDR 和 MTBDRplus 、INNO-LiPA Rif. TB、GeneXpert MTB/RIF、環介導等溫擴增技術、COBAS TaqMan MTB, Gen-Probe擴增結核分枝桿菌直接試驗和增強型Gen-Probe擴增結核分枝桿菌直接試驗、LightCycIer 結核分枝桿菌檢測試劑盒、Seeplex TB檢測試劑盒、BD-ProbeTec 直接和半自動化 ProbeTec ET 系統和 Abbott LCx0
22.根據權利要求21所述的方法，其中所述的診斷方法是GeneXpertMTB/RIF試驗。
23.製備含有細菌的吸附性材料的方法，該方法包括以下步驟 i)根據權利要求I至22中任一項的方法鑑定和定量細菌；並且 )將鑑定和定量的細菌點樣至所述吸附性材料上。
24.根據權利要求23所述的方法，其中所述的細菌包括野生株、參考菌株和陰性對照。
25.一種含有細菌的吸附性材料，該吸附性材料是根據權利要求23或者24所述的方法的。
26.鑑定是否存在細菌並且在存在細菌的情況下定量細菌的方法，該方法包括以下步驟 i)通過流式細胞儀對受試者的痰液樣本進行檢測； )在樣品中鑑定是否存在這樣的區域相對於背景碎片區域，角螢光增加以及角側散射增加或者前向散射增加； iii)任選地，如果樣本中存在相對於所述背景碎片角螢光強度增加以及角側散射或者前向散射增加的區域，對細菌進行定量； iv)將定量的細菌點樣於用於進行任何疾病診斷的吸附性材料上。
27.根據權利要求26所述的方法，其中相對於所述背景碎片區域存在所述角螢光增加以及角側散射增加或者前向散射增加的區域，出現在螢光強度對側(或者前向)散射圖上的約40-50°的角度區域。
28.根據權利要求26所述的方法，其中相對於所述背景碎片區域存在所述角螢光增加以及角側散射增加或者前向散射增加的區域，出現在螢光強度對側(或者前向)散射圖上的約45°的角度區域。
29.根據權利要求26至28中任一項所述的方法，其中所述的細菌為分枝桿菌。
30.根據權利要求29所述的方法，其中所述的分枝桿菌來自於如下種屬結核分枝桿菌、恥垢分枝桿菌、牛分枝桿菌、鳥分枝桿菌和偶發分枝桿菌。
31.根據權利要求30所述的方法，其中所述的分支桿菌為結核分枝桿菌。
32.根據權利要求26至28中任一項所述的方法，其中所述的細菌為葡萄球菌或梭菌。
33.根據權利要求26至32中任一項所述的方法，其中相對於所述的背景碎片區域不存在所述角螢光增加以及角側散射增加或者前向散射增加的區域，說明所述受試者不感染疾病。
34.根據權利要求26至32中任一項所述的方法，其中相對於所述的背景碎片區域存在角螢光增加以及角側散射增加或者前向散射增加的區域，說明所述受試者感染疾病。
35.根據權利要求26至34中任一項所述的方法，其中所述的背景碎片包括裂解的細胞，粘液或者唾液。
36.根據權利要求26至35中任一項所述的方法，其中所述的痰液用核酸結合染料進行處理，該核酸結合染料選自如下幾種金胺O、SYTO染料和碘化丙啶。
37.根據權利要求26至36中任一項所述的方法，其中所述的細菌用磁珠、配體或者抗體進行預先標記。
38.根據權利要求37所述的方法，其中所述的磁珠、磁珠、配體或者抗體包含螢光標記。
39.根據權利要求26至38中任一項所述的方法，在使用流式細胞儀檢測之前，對所述痰液樣本進行液化和/或淨化和/或滅活處理。
40.根據權利要求39所述的方法，其中在對所述痰液樣本進行液化和/或淨化和/或滅活處理之前，培養痰液樣品。
41.根據權利要求26至40中任一項所述的方法，其中所述的吸附性材料選自如下幾種材料過濾卡片、濾紙、拭子、磁珠、樣品池和棉花。
42.根據權利要求26至41中任一項所述的方法，其中所述的吸附性材料含有細菌野生株、參考菌株或者陰性對照。
43.根據權利要求26至42中任一項所述的方法，其中所述的診斷方法選自GenoType MTBDR 和 MTBDRplus 、INNO-LiPA Rif. TB、GeneXpert MTB/RIF、GeneXpert MRSA, GeneXpert 艱難梭菌和環介導等溫擴增技術、COBAS TaqMan MTB, Gen-Probe擴增結核分枝桿菌直接試驗和增強型Gen-Probe擴增結核分枝桿菌直接試驗、LightCyclerTM結核分枝桿菌檢測試劑盒、Seeplex TB檢測試劑盒、BD-ProbeTec 直接和半自動化ProbeTec ET 系統和 Abbott LCx。
44.根據權利要求43所述的方法,其中所述的診斷方法是GeneXpertMTB/RIF試驗。
全文摘要
本發明描述了一種用於鑑定細菌的方法。特別是，本發明涉及使用流式細胞儀從受試者痰液樣本中鑑定分枝桿菌並進行定量的方法。進一步描述了使用流式細胞儀從痰液派生的樣本中鑑定和定量結核分枝桿菌。一旦確定存在結核分枝桿菌並定量，樣本將被點樣於過濾卡片上，用來驗證現有的診斷方法，校準現有的診斷方法，以及/或建立與這些診斷方法結合使用的外部質量控制體系。在一種實施方式中，該方法被用於診斷結核病(TB)。
文檔編號C12Q1/04GK102947464SQ201180028024
公開日2013年2月27日 申請日期2011年5月6日 優先權日2010年5月6日
發明者萊斯利·埃裡卡·斯科特 申請人:約翰尼斯堡威特沃特斯蘭德大學