高純度可溶性血栓調節蛋白的製造方法

2023-06-20 07:37:36

專利名稱：：高純度可溶性血栓調節蛋白的製造方法
技術領域：
：本發明涉及實質上不含有能夠在酸性下生成的可溶性血栓調節蛋白的變性體的高純度可溶性血栓調節蛋白的製造方法。
背景技術：
：血栓調節蛋白作為通過與凝血酶特異性結合來阻斷凝血酶的血液凝固活性，同時顯著促進凝血酶的蛋白c活化能的物質而被已知，還己知其具有強力的血液凝固阻斷作用。己知其延長基於凝血酶作用的凝固時間以及抑制基於凝血酶作用的血小板聚集。蛋白c是在血液凝固-纖溶系統中起到重要的作用的維生素K依賴性的蛋白質，在凝血酶的作用下被活化，而成為活化蛋白C。己知該活化蛋白C在生物體內使血液凝固系統因子的活性型第V因子以及活性型第VIII因子失活，並且還已知其參與具有血栓溶解作用的纖溶酶原激活劑的產生(非專利文獻1)。因此認為，血栓調節蛋白利用該凝血酶來促進蛋白C的活化，作為抗血液凝固劑或血栓溶解劑是有用的，另外還有動物實驗的報告指出血栓調節蛋白在伴隨凝固亢進的疾病的治療、預防中是有效的(非專利文獻2)。以往，血栓調節蛋白是作為在以人為首的各種動物種的血管內皮細胞上表達的糖蛋白質而被發現得到的，其後，克隆成功。即，利用基因工程方法，從人肺cDNA文庫中對含有信號肽的人血栓調節蛋白前體的基因進行克隆，並且對血栓調節蛋白的全基因序列進行解析，解明含有信號肽(通常例舉出18個胺基酸殘基)的575個殘基的胺基酸序列(專利文獻l)。信號肽被切斷的成熟血栓調節蛋白由以下5個區域構成從其成熟肽的N末端側起的N末端區域(1_226號表示認為信號肽為18個胺基酸殘基時的位置，下同)、具有6個EGF樣結構的區域(227-462號)、O型糖鏈增加區域(463-498號)、膜貫通區域(499-521號)、以及細胞質內區域(522-557號)，並且作為具有與全長的血栓調節蛋白相同的活性的部分(即最小活性單元)，已知在具有6個EGF樣結構的區域之中主要是由從N末端側起的第4、5、6號的EGF樣結構構成的部分(非專利文獻3)。全長的血栓調節蛋白如果沒有表面活性劑的存在則難以溶解，作為製劑，必須添加表面活性劑，相對於此，存在即使沒有表面活性劑的存在也能很好地溶解的可溶性血栓調節蛋白。只要使可溶性血栓調節蛋白至少不含有膜貫通區域的一部分或全部來進行製備即可，例如，僅由N末端區域、具有6個EGF樣結構的區域和O型糖鏈增加區域這3個區域構成(即，由序列編號1的第19516位的胺基酸序列構成)的可溶性血栓調節蛋白可通過應用重組技術來獲得，並且該重組可溶性血栓調節蛋白具有天然的血栓調節蛋白的活性(專利文獻l)。此外，作為可溶性血栓調節蛋白的例子也有一些報告(專利文獻29)。或者作為天然型也例舉出了來自人尿的可溶性血栓調節蛋白等(專利文獻IO、11)。順便提及，在基因中，通過自然的變異或取得時的變異，如多數情況所確認的那樣，在人中也發現了多形性變異，上述的由575個殘基的胺基酸序列構成的人血栓調節蛋白前體的第473位的胺基酸為Val的和為Ala的是現在被確認的。在編碼該胺基酸的鹼基序列中，分別相當於在第1418位上的T變異和C變異(非專利文獻4)。但是，在活性和物性方面，完全相同，能夠判定兩者實質上相同。有報告指出血栓調節蛋白在DIC的治療上具有效果(非專利文獻5)。作為血栓調節蛋白的用途，除了上述以外，例如，還期待其用於急性冠狀動脈症候群(ACS)、血栓症、末梢血管閉塞症、閉塞性動脈硬化症、血管炎、心臟手術繼發的功能性障礙、臟器移植併發症、心絞痛、暫時性月茵缺血發作、妊娠中毒症、糖尿病、肝VOD(Liverveno-occlusivedisease;急性肝炎和骨髓移植後的肝靜脈閉塞症)、深部靜脈血栓症(DVT;Deepvenousthrombosis)等；以及成人呼吸窘迫綜合症(ARDS;Adultrespiratorydistresssyndrome)的疾病的治療和預防。作為血栓調節蛋白的變性體，已知在冷凍乾燥工序中生成的聚集體和在冷凍乾燥狀態下長期保存中生成的聚集體(專利文獻1216)。考慮到在藥品中的利用，作為以工業水平製造可溶性血栓調節蛋白的方法，例如已知如下方法高純度可溶性血栓調節蛋白的製造方法，該高純度可溶性血栓調節蛋白實質上不含有血清衍生物和抗體衍生物，該方法的特徵在於，作為精製工序，使用負載了針對血栓調節蛋白的抗體的親和色譜法的方法，進而將通過親和色譜法得到的該可溶性血栓調節蛋白在傳導率為2534ms/cm、pH為34的條件下與陽離子交換體接觸，在該工序中，以流通級分的形式得到該可溶性血栓調節蛋白(專利文獻17);血栓調節蛋白的精製方法，該方法的特徵在於，用凝血酶結合親和色譜法預精製含有人尿血栓調節蛋白的試樣，接下來利用以羥基磷灰石作為吸附劑的吸附色譜法進行精製(專利文獻18)。專利文獻l:日本特開昭64-6219號公報專利文獻2:日本特開平2-255699號公報專利文獻3:日本特開平3-133380號公報專利文獻4:日本特開平3-259084號公報專利文獻5:日本特開平4-210700號公報專利文獻6:日本特開平5-213998號公報專利文獻7:WO92/00325號公報專利文獻8:WO92/03149號公報專利文獻9:W093/15755號公報專利文獻10:日本特開平3-86900號公報專利文獻11:日本特開平3-218399號公報專利文獻12:日本特開平6-321085號公報專利文獻13:日本特許第3007785號公報專利文獻14:日本特開平11-1717卯號公報專利文獻15:W095/16460號公報專利文獻16:日本特許第3822383號公報專利文獻17:日本特開平11-341990號公報專利文獻18:日本特許第3745805號公報非專利文獻1:鈴木宏治，醫學Ofc^&，第125巻，901頁(1983年)非專利文獻2:K.Gomi等，Blood75.1396-1399(1990)非專利文獻3:M.Zushi等，J.Biol.Chem.，246，10351-10353(1989)非專利文獻4:D.Z.Wen等，Biochemistry,26,4350-4357(1987)非專利文獻5:S.M.Bates等，Br.J.Pharmacol"144，1017-1028(2005)
發明內容本發明的課題在於提供一種以高生產率製造實質上不含有可溶性血栓調節蛋白的變性體的血栓調節蛋白的方法。本發明人在以工業水平製造可溶性血栓調節蛋白的過程中，還在利用包括於酸性下病毒滅活的工序的製造方法來製造可溶性血栓調節蛋白的過程中，發現了如下新課題可溶性血栓調節蛋白置於酸性下的情況下生成該可溶性血栓調節蛋白的變性體，需要將其高效地去除。本發明人為了去除該可溶性血栓調節蛋白的變性體，對凝膠過濾色譜法(GFC)、尺寸排阻色譜法(SEC)等的利用進行了研究。但是，發現凝膠過濾色譜法(GFC)、尺寸排阻色譜法(SEC)的處理容量少，通常是柱容積的5%以下，因此需要增大柱容積或者需要進行多次循環。另外，作為提高效率的方法，可以考慮加快層析線速度的方法，但是加快線速度導致分離能力降低，因此認為該方法是不恰當的。另外，作為其他方法，還可以考慮提高處理蛋白質的濃度的方法，但是存在要增加用來提高蛋白質濃度的濃縮工序的問題以及以由高蛋白濃度帶來的高粘性為主要原因的分離能力的降低等問題。於是，本發明人基於上述新課題，認為為了以工業水平製造可溶性血栓調節蛋白，重要的是利用解決了上述問題的生產率高的方法來分離該可溶性血栓調節蛋白的變性體。本發明人為了解決上述新課題，利用各種色譜載體對各種條件進行了深入研究，結果通過使用陰離子交換體或羥基磷灰石作為載體，在各載體中發現了適當的條件，由此成功地發現了高效且穩定地分離該可溶性血栓調節蛋白的變性體的方法。艮P，本發明可以給出如下技術方案。〔Al〕可溶性血栓調節蛋白的製造方法，該可溶性血栓調節蛋白實質上不含有能夠由可溶性血栓調節蛋白在酸性下生成的該可溶性血栓調節蛋白的變性體，其中，該方法包括如下工序(1)將含有或疑似含有該可溶性血栓調節蛋白的變性體的該可溶性血栓調節蛋白含有物供給於陰離子交換體或羥基磷灰石；以及(2)在能夠將該可溶性血栓調節蛋白和該可溶性血栓調節蛋白的變性體分離的分離條件下，得到包含實質上不含有該可溶性血栓調節蛋白的變性體的可溶性血栓調節蛋白的級分。〔A2〕如上述〔Al〕記載的製造方法，該方法是製造實質上不含有能夠由可溶性血栓調節蛋白在酸性下生成的該可溶性血栓調節蛋白的變性體的可溶性血栓調節蛋白的方法，其中，該方法包括如下工序(0)將該可溶性血栓調節蛋白置於pH為5以下的酸性下；(1)將經上述工序(O)得到的含有或疑似含有該可溶性血栓調節蛋白的變性體的該可溶性血栓調節蛋白含有物供給於陰離子交換體或羥基磷灰石；以及(2)在能夠將該可溶性血栓調節蛋白和該可溶性血栓調節蛋白的變性體分離的分離條件下，得到包含實質上不含有該可溶性血栓調節蛋白的變性體的可溶性血栓調節蛋白的級分。(A2-2〕如上述〔Al〕記載的製造方法，該方法是製造實質上不含有能夠由可溶性血栓調節蛋白在酸性下生成的該可溶性血栓調節蛋白的變性體的可溶性血栓調節蛋白的方法，其中，該方法包括如下工序(*)精製可溶性血栓調節蛋白；(0)將該可溶性血栓調節蛋白置於pH為5以下的酸性下；(1)將經上述工序(O)得到的含有或疑似含有該可溶性血栓調節蛋白的變性體的該可溶性血栓調節蛋白含有物供給於陰離子交換體或羥基磷灰石；以及(2)在能夠將該可溶性血栓調節蛋白和該可溶性血栓調節蛋白的變性體分離的分離條件下，得到包含實質上不含有該可溶性血栓調節蛋白的變性體的可溶性血栓調節蛋白的級分。〔A2隱3〕如上述〔Al〕、〔A2〕或〔A2畫2〕任意一項記載的製造方法，其中，將該可溶性血栓調節蛋白含有物供給於陰離子交換體或羥基磷灰石的工序是將該可溶性血栓調節蛋白含有物供給於陰離子交換體的工序。〔A2-4〕如上述〔Al〕、〔A2〕或〔A2-2〕任意一項記載的製造方法，其中，將該可溶性血栓調節蛋白含有物供給於陰離子交換體或羥基磷灰石的工序是將該可溶性血栓調節蛋白含有物供給於羥基磷灰石的工序。〔A3〕如上述〔Al)〔A2-4〕任意一項記載的製造方法，其中，相對於可溶性血栓調節蛋白含有物中的全蛋白，可溶性血栓調節蛋白的含量為80%以上。需要說明的是，如上述〔Al〕〔A2-4〕那樣引用的項編號以範圍來表示，在該範圍內配置具有(A2-2)等分支編號的項的情況下，意味著具有〔A2-2〕等分支編號的項也被引用。下同。〔A3-2〕如上述〔Al〕〔A2-4〕任意一項記載的製造方法，其中，相對於可溶性血栓調節蛋白含有物中的全蛋白，可溶性血栓調節蛋白的含量為90%以上。〔A3-3〕如上述〔Al〕(A2-4〕任意一項記載的製造方法，其中，相對於可溶性血栓調節蛋白含有物中的全蛋白，可溶性血栓調節蛋白的含量為95%以上。〔A3-4〕如上述〔Al〕〔A2-4〕任意一項記載的製造方法，其中，相對於可溶性血栓調節蛋白含有物中的全蛋白，可溶性血栓調節蛋白的含量為99%以上。(A4〕如上述(Al〕〔A3-4〕任意一項記載的製造方法，其中，工序(2)是通過進行線性或分段、或者線性和分段的組合的梯度洗脫來得到包含實質上不含有該可溶性血栓調節蛋白的變性體的可溶性血栓調節蛋白的洗脫級分的工序。需要說明的是，如上述〔Al〕〔A3-4〕那樣引用的項編號以範圍來表示，在該範圍內配置具有(A3-2〕等分支編號的項的情況下，意味著具有〔A3-2〕等分支編號的項也被引用。下同。〔A5〕如上述〔Al〕〔A3-4)任意一項記載的製造方法，其中，工序(2)是得到流通級分的工序，該工序中得到包含實質上不含有該可溶性血栓調節蛋白的變性體的可溶性血栓調節蛋白的級分。〔A6〕如上述〔Al)(A3-4〕任意一項記載的製造方法，其中，工序(2)是通過進行等度洗脫來得到包含實質上不含有該可溶性血栓調節蛋白的變性體的可溶性血栓調節蛋白的洗脫級分的工序。〔A7〕如上述〔Al〕〔A3-4)任意一項記載的製造方法，其中，工序(1)中，使用pH為49的緩衝液，將該可溶性血栓調節蛋白含有物供給於陰離子交換體；工序(2)中，使用pH為59且鹽濃度為0lM的緩衝液，進行線性或分段、或者線性和分段的組合的梯度洗脫，(a)預先確認可溶性血栓調節蛋白的洗脫級分的位置，得到包含實質上不含有該可溶性血栓調節蛋白的變性體的可溶性血栓調節蛋白的洗脫級分；或者(b)一邊確認在洗脫級分中是否存在可溶性血栓調節蛋白，一邊得到包含實質上不含有該可溶性血栓調節蛋白的變性體的可溶性血栓調節蛋白的洗脫級分。〔A7畫2〕如上述〔A7〕記載的製造方法，其中，工序(a)或(b)是工序(a)。〔A7-3〕如上述〔A7〕記載的製造方法，其中，工序(a)或(b)是工序〔A8〕如上述〔Al〕〔A3-4〕任意一項記載的製造方法，其中，工序(1)中，使用pH為58且鹽濃度為0.10.2M的緩衝液，將該可溶性血栓調節蛋白含有物供給於陰離子交換體；工序(2)中，通過使用pH為58且鹽濃度為0.10.2M的緩衝液得到流通級分，從而得到包含實質上不含有該可溶性血栓調節蛋白的變性體的可溶性血栓調節蛋白的級分。〔A9〕如上述〔Al〕〔A3-4〕任意一項記載的製造方法，其中，工序(1)中，使用pH為69且磷酸鹽濃度為8mM以下的緩衝液，將可溶性血栓調節蛋白含有物供給於羥基磷灰石；工序(2)中，使用pH為69且磷酸鹽濃度為00.5M的緩衝液，進行線性或分段、或者線性和分段的組合的梯度洗脫，(a)預先確認可溶性血栓調節蛋白的洗脫級分的位置，得到包含實質上不含有該可溶性血栓調節蛋白的變性體的可溶性血栓調節蛋白的洗脫級分；或者(b)—邊確認在洗脫級分中是否存在可溶性血栓調節蛋白，一邊得到包含實質上不含有該可溶性血栓調節蛋白的變性體的可溶性血栓調節蛋白的洗脫級分。〔A9-2〕如上述〔A9〕記載的製造方法，其中，工序(a)或(b)是工序(a)。(A9-3〕如上述〔A9〕記載的製造方法，其中，工序(a)或(b)是工序〔AIO)如上述〔Al〕〔A3-4)任意一項記載的製造方法，其中，工序(1)中，使用pH為69且磷酸鹽濃度為520mM的緩衝液，將該可溶性血栓調節蛋白含有物供給於羥基磷灰石；工序(2)中，通過使用pH為69且磷酸鹽濃度為520mM的緩衝液得到流通級分，從而得到包含實質上不含有該可溶性血栓調節蛋白的變性體的可溶性血栓調節蛋白的級分。〔All〕如上述〔Al〕〔AIO〕任意一項記載的製造方法，其中，該方法在得到包含實質上不含有該可溶性血栓調節蛋白的變性體的可溶性血栓調節蛋白的洗脫級分之後，不包括使該級分的pH為4以下的工序。〔A12〕如上述(Al〕(All〕任意一項記載的製造方法，其中，該方法在得到包含實質上不含有該可溶性血栓調節蛋白的變性體的可溶性血栓調節蛋白的洗脫級分之後，包括不使該級分的pH為4以下的濃縮工序和/或脫鹽工序，該方法用於將該可溶性血栓調節蛋白製成藥品原料。〔A13〕如上述〔Al〕〔A12〕任意一項記載的製造方法，其中，實質上不含有該可溶性血栓調節蛋白的變性體的可溶性血栓調節蛋白中，可溶性血栓調節蛋白的變性體的含量為3%以下。〔A14〕如上述〔Al〕〔A13〕任意一項記載的製造方法，其中，該可溶性血栓調節蛋白是由轉化細胞得到的，該轉化細胞是通過將編碼序列編號9或序列編號11記載的胺基酸序列的DNA轉染至宿主細胞而製備的。〔A15〕可溶性血栓調節蛋白的精製方法，該精製方法使該可溶性血栓調節蛋白實質上不含有能夠由可溶性血栓調節蛋白在酸性下生成的該可溶性血栓調節蛋白的變性體，其中，該精製方法包括如下工序(1)將含有或疑似含有該可溶性血栓調節蛋白的變性體的該可溶性血栓調節蛋白含有物供給於陰離子交換體或羥基磷灰石；(2)在能夠將該可溶性血栓調節蛋白和該可溶性血栓調節蛋白的變性體分離的分離條件下，得到包含實質上不含有該可溶性血栓調節蛋白的變性體的可溶性血栓調節蛋白的洗脫級分，或者，該精製方法在將該可溶性血栓調節蛋白含有物供給於陰離子交換體或羥基磷灰石的工序中，製備該可溶性血栓調節蛋白含有物的緩衝液，以流通級分的的形式得到實質上不含有該可溶性血栓調節蛋白的變性體的可溶性血栓調節蛋白。〔A15-2〕如上述〔A15)記載的精製方法，其中，該方法具有上述〔Al〕〔A14〕任意一項記載的特徵。〔A16〕如上述〔Al〕〔A15〕任意一項記載的製造方法，其中，實質上不含有可溶性血栓調節蛋白的變性體的血栓調節蛋白中，可溶性血栓調節蛋白的變性體的含量為3.0%以下。(Bl〕血栓調節蛋白的製造方法，該方法是從含有或疑似含有能夠在酸性下由可溶性血栓調節蛋白生成的該可溶性血栓調節蛋白的變性體的該可溶性血栓調節蛋白含有物來製造實質上不含有該可溶性血栓調節蛋白的變性體的血栓調節蛋白的方法，其中，該方法包括如下工序(1)將該血栓調節蛋白含有物供給於陰離子交換體或羥基磷灰石；(2)在能夠將該可溶性血栓調節蛋白和該可溶性血栓調節蛋白的變性體分離的分離條件下，得到包含實質上不含有該可溶性血栓調節蛋白的變性體的可溶性血栓調節蛋白的洗脫級分。(B2〕血栓調節蛋白的製造方法，該方法是從含有或疑似含有能夠在酸性下由可溶性血栓調節蛋白生成的該可溶性血栓調節蛋白的變性體的該可溶性血栓調節蛋白含有物來製造實質上不含有該可溶性血栓調節蛋白的變性體的血栓調節蛋白的方法，其中，在將該血栓調節蛋白含有物供給於陰離子交換體或羥基磷灰石的工序中，製備該血栓調節蛋白含有物的緩衝液，以流通級分的形式得到實質上不含有該可溶性血栓調節蛋白的變性體的可溶性血栓調節蛋白。〔B3〕如(Bl〕記載的製造方法，其中，工序(1)中，將可溶性血栓調節蛋白含有物供給於陰離子交換體，使用的緩衝液的pH為49;工序(2)中，使用pH為59、鹽濃度為01M的緩衝液進行線性或分段、或者線性和分段組合的梯度洗脫，通過預先確認來得到包含實質上不含有該可溶性血栓調節蛋白的變性體的可溶性血栓調節蛋白的洗脫級分，或者通過一邊確認洗脫級分，一邊得到包含實質上不含有該可溶性血栓調節蛋白的變性體的可溶性血栓調節蛋白的洗脫級分。〔B4〕如〔Bl〕記載的製造方法，其中，工序(1)中，將可溶性血栓調節蛋白含有物供給於陰離子交換體，使用的緩衝液的pH為45;工序(2)中，使用pH為59、鹽濃度為01M的緩衝液進行線性或分段、或者線性和分段的組合的梯度洗脫，通過預先確認來得到包含實質上不含有該可溶性血栓調節蛋白的變性體的可溶性血栓調節蛋白的洗脫級分，或者通過一邊確認洗脫級分，一邊得到包含實質上不含有該可溶性血栓調節蛋白的變性體的可溶性血栓調節蛋白的洗脫級分。〔B5〕如〔B2)記載的製造方法，其中，緩衝液的pH為58、鹽濃度為0.10.2M，將可溶性血栓調節蛋白含有物供給於陰離子交換體，以流通級分的形式得到實質上不含有該可溶性血栓調節蛋白的變性體的可溶性血栓調節蛋白。〔B6〕如〔Bl〕記載的製造方法，其中，工序(1)中，將可溶性血栓調節蛋白含有物供給於羥基磷灰石，使用的緩衝液的pH為69、該緩衝液的磷酸濃度為8mM以下；上述工序(2)中，使用pH為69、磷酸鹽濃度為00.5M的緩衝液進行線性或分段、或者線性和分段的組合的梯度洗脫，通過預先確認來得到包含實質上不含有該可溶性血栓調節蛋白的變性體的可溶性血栓調節蛋白的洗脫級分，或者通過一邊確認洗脫級分，一邊得到包含實質上不含有該可溶性血栓調節蛋白的變性體的可溶性血栓調節蛋白的洗脫級分。(B7)如(Bl〕記載的製造方法，其中，工序(1)中，將可溶性血栓調節蛋白含有物供給於羥基磷灰石，使用的緩衝液的pH為69、該緩衝液的磷酸濃度為14mM;上述工序(2)中，使用pH為69、磷酸鹽濃度為140mM的緩衝液進行線性或分段、或者線性的分段組合的梯度洗脫，通過預先確認來得到包含實質上不含有該可溶性血栓調節蛋白的變性體的可溶性血栓調節蛋白的洗脫級分，或者通過一邊確認洗脫級分，一邊得到包含實質上不含有該可溶性血栓調節蛋白的變性體的可溶性血栓調節蛋白的洗脫級分。〔B8〕如〔B2〕記載的製造方法，其中，緩衝液的pH為69、磷酸鹽濃度為520mM，將可溶性血栓調節蛋白含有物供給於羥基磷灰石，以流通級分的形式得到實質上不含有該可溶性血栓調節蛋白的變性體的可溶性血栓調節蛋白。〔B9〕如〔Bl〕〔B8〕任意一項記載的製造方法，其中，在得到包含實質上不含有可溶性血栓調節蛋白的變性體的可溶性血栓調節蛋白的洗脫級分之後，不使該級分的pH為4以下。〔BIO〕如〔Bl〕〔B8)任意一項記載的製造方法，其中，在得到包含實質上不含有可溶性血栓調節蛋白的變性體的可溶性血栓調節蛋白的洗脫級分之後，通過不使該級分的pH為4以下的濃縮工序或脫鹽工序來製成藥品原料。〔Bll〕如〔Bl〕〔BIO〕任意一項記載的製造方法，其中，實質上不含有該可溶性血栓調節蛋白的變性體的可溶性血栓調節蛋白中，可溶性血栓調節蛋白的變性體的含量為3%以下。〔B12〕如〔Bl〕〔Bll〕任意一項記載的製造方法，其中，實質上不含有該可溶性血栓調節蛋白的變性體的可溶性血栓調節蛋白中，可溶性血栓調節蛋白的變性體的含量為1%以下。〔B13〕如〔Bl〕〔B12〕任意一項記載的製造方法，其中，該血栓調節蛋白是由轉化細胞得到的肽，該轉化細胞是通過將編碼序列編號9或序列編號11記載的胺基酸序列的DNA轉染至宿主細胞而製備的。通過使用本發明的製造方法，不需要用於提高處理蛋白質濃度的濃縮工序，不受處理容積限制，並且能夠以高生產率分離該可溶性血栓調節蛋白的變性體，能夠得到實質上不含有該可溶性血栓調節蛋白的變性體的高純度可溶性血栓調節蛋白。圖1表示實施例4中利用陰離子交換體線性梯度洗脫分離可溶性血栓調節蛋白的變性體的色譜圖。圖2表示實施例5中利用陰離子交換體線性梯度洗脫分離可溶性血栓調節蛋白的變性體的色譜圖。圖3表示實施例6中利用陰離子交換體線性梯度洗脫分離可溶性血栓調節蛋白的變性體的色譜圖。圖4表示對實施例3中得到的高純度精製品測定可溶性血栓調節蛋白的變性體含量的結果。圖5表示實施例8中利用陰離子交換體分段梯度洗脫去除可溶性血栓調節蛋白的變性體的色譜圖。圖6表示實施例11中利用羥基磷灰石分段梯度洗脫去除可溶性血栓調節蛋白的變性體的色譜圖。圖7表示實施例14中利用強陰離子交換體進行高純度化和去除可溶性血栓調節蛋白的變性體的色譜圖。具體實施例方式已知本發明中的血栓調節蛋白(l)與凝血酶選擇性結合、(2)具有利用凝血酶促進蛋白C的活化的作用。並且，本發明中的血栓調節蛋白的下述作用通常能得到認可(3)延長基於凝血酶作用的凝固時間的作用和/或(4)抑制基於凝血酶作用的血小板聚集的作用，這正是所希望的。有時將這些血栓調節蛋白所具有的作用稱為血栓調節蛋白活性。作為血栓調節蛋白活性，優選具有上述(1)和(2)的作用，進一步優選具有全部的上述(1)(4)的作用。對於利用凝血酶促進蛋白C的活化的作用，可以利用例如以日本特開昭64-6219號公報為首的各種公知文獻中明確記載的試驗方法來容易地確認促進蛋白c的活化的作用的活性量和是否存在該作用。另外，對於延長基於凝血酶作用的凝固時間的作用和/或抑制基於凝血酶作用的血小板聚集的作用，也能夠同樣容易地加以確認。作為本發明所記載的可溶性血栓調節蛋白的例子，可以舉出在沒有表面活性劑的存在下可溶於水的可溶性血栓調節蛋白。作為可溶性血栓調節蛋白的溶解性的優選例子，可以舉出在水、例如注射用蒸餾水中(沒有TritonX-100或聚多卡醇等表面活性劑的存在，通常為中性附近)溶解lmg/ml以上、或者10mg/ml以上，優選溶解15mg/ml以上、或者17mg/ml以上，進一步優選溶解20mg/ml以上、25mg/ml以上、或者30mg/ml以上，特別優選溶解60mg/ml以上，在某些情況下，可以分別舉出溶解80mg/ml以上、或者100mg/ml以上。在判斷可溶性血栓調節蛋白是否能夠溶解時，可以如下理解在溶解後，例如在白色光源的正下方，在約1000lux的亮度的位置，用肉眼觀察時為澄清透明，以不含有可被明確確認那樣程度的不溶性物質為直接指標。另外，也可以以過濾後有無殘渣來進行確認。作為本發明的可溶性血栓調節蛋白，優選包含在人型血栓調節蛋白中作為血栓調節蛋白活性的中心位點而已知的序列編號1的第19132位的胺基酸序列，但只要包含序列編號1的第19132位的胺基酸序列，就沒有特別限定。只要具有利用凝血酶促進蛋白C的活化的作用即具有血栓調節蛋白活性，該序列編號1的第19132位的胺基酸序列也可以自然變異或人工變異，即，序列編號1的第19132位的胺基酸序列中的一個或2個以上的胺基酸可以發生取代、缺失、添加。只要具有血栓調節蛋白活性，則對容許的變異的程度沒有特別限定，例如作為胺基酸序列，可以例舉出具有50%以上的相同性的胺基酸序列，優選70%以上的相同性，更優選80%以上的相同性，進一步優選90%以上的相同性，特別優選95%以上的相同性，最優選98%以上的相同性。將這樣的胺基酸序列稱為相同變異序列。對於這些變異，如後所述，採用通常的基因操作技術就能夠容易獲得。序列編號3的序列是序列編號1的序列的第125位的胺基酸Val變異為Ala的序列，但作為本發明的可溶性血栓調節蛋白，也優選包含序列編號3的第19132位的胺基酸序列。如此，作為本發明的可溶性血栓調節蛋白，只要包含至少具有序列編號1或者序列編號3的第19132位的序列或者這些序列的相同變異序列、至少具有血栓調節蛋白活性的肽序列，就沒有特別限定，作為優選的實例，可以舉出由序列編號1或者序列編號3各自的第19132位或者第17132位的序列構成的肽、或者由上述序列的相同變異序列構成的至少具有血栓調節蛋白活性的肽，更優選由序列編號1或者序列編號3的第19132位的序列構成的肽。另外，也存在更優選由序列編號1或者序列編號3各自的第19132位或者第17132位的相同變異序列構成的至少具有血栓調節蛋白活性的肽的其他方式。另外，作為本發明的可溶性血栓調節蛋白的另一方式，優選包含序列編號5的第19480位的胺基酸序列，只要包含序列編號5的第19480位的胺基酸序列，就沒有特別限定。只要具有利用凝血酶促進蛋白C的活化的作用即具有血栓調節蛋白活性，該序列編號5的第19480位的胺基酸序列也可以是其相同變異序列。序列編號7的序列是序列編號5的序列的第473位的胺基酸Val變異為Ala的序列，但作為本發明的可溶性血栓調節蛋白，也優選包含序列編號7的第19480位的胺基酸序列。如此，作為本發明的可溶性血栓調節蛋白，只要包含至少具有序列編號5或者序列編號7的第19480位的序列或者這些序列的相同變異序列、至少具有血栓調節蛋白活性的肽序列，就沒有特別限定，作為優選的實例，可以舉出由序列編號5或者序列編號7各自的第19480位或者第17480位的序列構成的肽、或者由上述序列的相同變異序列構成的至少具有血栓調節蛋白活性的肽，更優選由序列編號5或者序列編號7的第19480位的序列構成的肽。另外，也存在更優選由序列編號5或者序列編號7各自的第19480位或者第17480位的相同變異序列構成的至少具有血栓調節蛋白活性的肽的其他方式。另外，作為本發明的可溶性血栓調節蛋白的另一方式，優選包含序列編號9的第19515位的胺基酸序列，只要包含序列編號9的第19515位的胺基酸序列，就沒有特別限定。只要具有利用凝血酶促進蛋白C的活化的作用即具有血栓調節蛋白活性，該序列編號9的第19515位的胺基酸序列也可以是其相同變異序列。序列編號11的序列是序列編號9的序列的第473位的胺基酸Val變異為Ala的序列，但作為本發明的血栓調節蛋白，也優選包含序列編號11的第19515位的胺基酸序列。如此，作為本發明的可溶性血栓調節蛋白，只要包含至少具有序列編號9或者序列編號11的第19515位的序列或者這些序列的相同變異序列、至少具有血栓調節蛋白活性的肽序列，就沒有特別限定，作為更優選的實例，可以舉出由序列編號9或者序列編號11各自的第19516位、第19515位、第17516位或者第17515位的序列構成的肽、或者由上述序列的相同變異序列構成的至少具有血栓調節蛋白活性的肽，特別優選由序列編號9的第19516位、第19515位、第17516位或者第17515位的序列構成的肽。作為優選的實例，也可以舉出它們的混合物。另外，也存在特別優選由序列編號ll的第19516位、第19515位、第17516位或者第17515位的序列構成的肽的其他的方式。作為優選的實例，也可以舉出它們的混合物。另外，作為優選的實例，也可以舉出由這些序列的相同變異序列構成的至少具有血栓調節蛋白活性的肽。如上所述，具有相同變異序列的肽也指作為對象的肽的胺基酸序列中可以取代、缺失、添加一個以上、即一個或2個以上的氮基酸、進而優選數個(例如120個、優選為110個、更優選為15個、特別優選為13個)胺基酸的肽。只要具有血栓調節蛋白活性，就對容許的變異的程度沒有特別限定，例如，作為胺基酸序列，可以例舉出具有50%以上的相同性的胺基酸序列，優選70%以上的相同性，更優選80%以上的相同性，進一步優選90%以上的相同性，特別優選95%以上的相同性，最優選98%以上的相同性。另外，作為本發明的可溶性血栓調節蛋白，作為其優選的實例，還可以舉出日本特開昭64-6219中由序列編號14的序列(462個胺基酸殘基)構成的肽、由序列編號8的序列(272個胺基酸殘基)構成的肽、或者由序列編號6的序列(236個胺基酸殘基)構成的肽。作為本發明的可溶性血栓調節蛋白，只要是至少具有序列編號1或序列編號3的第19132位的胺基酸序列的肽，就沒有特別限定，其中優選至少具有序列編號5或序列編號7的第19480位的胺基酸序列的肽，更優選至少具有序列編號9或者序列編號11的第19515位的胺基酸序列的肽。作為至少具有序列編號9或者序列編號11的第19515位的胺基酸序列的肽，其更優選的實例可以舉出由序列編號9或者序列編號11各自的第19516位、第19515位、第17516位或者第17515位的序列構成的肽。另外，作為更優選的實例，也可以舉出由序列編號9或者序列編號11各自的第19516位、第19515位、第17516位或者第17515位的序列構成的肽的、序列編號9或者序列編號11各自的混合物。對於上述混合物，作為從序列編號9或者序列編號11各自的從第17位開始的肽和從第19位開始的肽的混合比例，可例舉出(30:70)(50:50)，其優選的實例可以舉出(35:65)(45:55)。另外，作為在序列編號9或者序列編號11各自的在第515位終止的肽和在第516位終止的肽的混合比例，可例舉出(0:100)(90:10)，根據情況可例舉出(70:30)(90:10)、(0:100)(30:70)。這些肽的混合比例可以通過通常的方法求出。需要說明的是，序列編號1的第19132位的序列相當於序列編號9的第367480位的序列，序列編號5的第19480位的序列相當於序列編號9的第19480位的序列。此外，序列編號3的第19132位的序列相當於序列編號11的第367480位的序列，序列編號7的第19480位的序列相當於序列編號11的第19480位的序列。另夕卜，序列編號l、3、5、7、9以及11各自的第118位的序列是完全相同的序列。如後所述，本發明的這些血栓調節蛋白可以由轉化細胞獲得，該轉化細胞是藉助載體將編碼這些序列編號1、3、5、7、9或11等的肽的DNA(具體地說，分別是序列編號2、序列編號4、序列編號6、序列編號8、序列編號10、或者序列編號12等的鹼基序列)轉染至宿主細胞而製備的。作為血栓調節蛋白，優選由轉化細胞得到的血栓調節蛋白，該轉化細胞是藉助載體將編碼序列編號9或序列編號11的胺基酸序列的DNA(具體地說，分別是序列編號10或序列編號12的鹼基序列)轉染至宿主細胞而製備的。另外，這些肽只要具有上述的胺基酸序列即可，具有糖鏈或不具有糖鏈均可，在這點上沒有特別限定。另外，在基因操作中，根據使用的宿主細胞的種類，糖鏈的種類、附加的位置和附加的程度不同，可以任意使用這些肽。對於糖鏈的結合位置和種類，已知日本特開平11-341990記載的事實，對於本發明的血栓調節蛋白，也存在在同樣的位置附加同樣的糖鏈的情況。如後所述，並非特定通過基因操作來獲得，但通過基因操作來獲得的情況下，作為表達時可以使用的信號序列，可以使用編碼上述的序列編號9的第118位的胺基酸序列的鹼基序列、編碼序列編號9的第116位的胺基酸序列的鹼基序列、其他公知的信號序列(例如人組織型纖溶酶原激活劑的信號序列)(國際公開88/9811號公報)。將編碼血栓調節蛋白的DNA序列導入宿主細胞的情況下，優選舉出將編碼血栓調節蛋白的DNA序列併入載體(特別優選能夠在動物細胞中表達的表達載體)中來導入的方法。所謂表達載體，是由啟動子序列、對mRNA賦予核糖體結合位點的序列、編碼要表達的蛋白的DNA序列、剪接信號、轉錄終止的終止子序列、複製起始序列等構成的DNA分子，作為優選的動物細胞表達載體的例子，可以舉出R.C.Mulligan等[Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.78.2072(1981)]報告的pSV2-X、P.M.Howley等[MethodinEmzymology，101,387，AcademicPress(1983)]報告的pBP69T(69畫6)等。作為能夠在製造這些肽時使用的宿主細胞，可以舉出中國倉鼠卵巢(CHO)細胞、COS-l細胞、COS-7細胞、VERO(ATCCCCL-81)細胞、BHK細胞、來自犬腎的MDCK細胞、倉鼠AV-12-664細胞等，以及作為來自人的細胞的HeLa細胞、WI38細胞、人293細胞。CHO細胞極為普遍而優選，在CHO細胞中，進一步優選DHFR-CHO細胞。此外，在基因操作的過程和肽的製造過程中，多使用大腸桿菌等微生物，優選使用各微生物所適合的宿主-載體體系，在上述的宿主細胞中，也可以選擇適宜的載體體系。在基因重組技術中使用的血栓調節蛋白的基因被克隆，並且公開了使用血栓調節蛋白的基因重組技術的製造例，另外，還已知用於得到其精製品的精製方法[日本特開昭64-6219號公報、日本特開平2-255699號公報、日本特開平5-213998號公報、日本特開平5-310787號公報、日本特開平7-155176號公報、J.Biol.Chem.，264:10351-10353(1989)]。因此，本發明中使用的可溶性血栓調節蛋白可通過使用上述的報告中記載的方法或者基於這些報告所記載的方法得以製造。例如，在日本特開昭64-6219號公報中，公開了包含質粒pSV2血栓調節蛋白J2的大腸桿菌K-12菌株DH5(ATCC保藏編號67283號)，該質粒pSV2血栓調節蛋白J2包含編碼全長的血栓調節蛋白的DNA。另外，還可以使用將該菌株於1996年6月19日再次保藏於生命研(現獨立行政法人產業技術綜合研究所專利生物保藏中心)(日本國茨城縣筑波市東1丁目1番3號(郵政編碼305))的菌株(大腸桿菌DH5/pSV2TMJ2)(FERMBP-5570)。以該編碼全長的血栓調節蛋白的DNA作為原料，通過公知的基因操作技術，可以製備本發明的血栓調節蛋白。本發明中使用的可溶性血栓調節蛋白採用現有公知的方法或基於這些方法來製備即可，可以參考例如上述山本等的方法[日本特開昭64-6219號公報]、或者日本特開平5-213998號公報。即，通過基因操作技術將來自人的血栓調節蛋白基因製成例如編碼序列編號9的胺基酸序列的DNA，進而必要時也可以進行改變。作為該改變，例如，為了製成編碼序列編號11的胺基酸序列的DNA(具體地說，由序列編號12的鹼基序列構成)，按照[MethodsinEnzymology,100:468(1983年)，AcademicPress]所記載的方法，對編碼序列編號9的胺基酸序列的第473位的胺基酸的密碼子(特別是第1418位的鹼基)進行位點部位特異性突變。例如，可以通過使用具有序列編號13所示的鹼基序列的變異用合成DNA製成使序列編號10的第1418位的鹼基T轉換為鹼基C的DNA。將如此製備的DNA併入例如中國倉鼠卵巢(CHO)細胞中，製成轉化細胞，經適當選擇，從培養該細胞所得到的培養液中可以製造出經由公知方法精製的血栓調節蛋白。如上所述，優選將編碼序列編號9的胺基酸序列的DNA(序列編號IO)轉染至上述宿主細胞中。本發明中使用的血栓調節蛋白的生產方法並不限於上述的方法，例如，可以從生產血栓調節蛋白的組織或這些組織培養液等中提取精製，也可以根據需要進一步通過蛋白分解酶進行切斷處理。利用上述細胞培養方法製造本發明中的血栓調節蛋白的情況下，通過蛋白質的翻譯後修飾，有時能夠確認到N末端胺基酸的多樣性。例如，有時序列編號9中的第17位、18位、19位或者22位的胺基酸會成為N末端。另外，例如為了使第22位的穀氨酸轉換為焦穀氨酸，有時修飾N末端胺基酸。優選第17位或19位的胺基酸成為N末端，更優選第19位的胺基酸成為N末端。另外，也存在優選第17位的胺基酸成為N末端的其他方式。關於以上的修飾和多樣性等，對於序列編號11來說，也可以舉出同樣的例子。另外，在使用具有序列編號10的鹼基序列的DNA製造血栓調節蛋白的情況下，有時確認到C末端胺基酸的多樣性，有時會製造出短l個胺基酸殘基的肽。即，存在第515位的胺基酸成為C末端，進而該第515位被醯胺化那樣的C末端胺基酸被修飾的情況。因此，有時能夠製造N末端胺基酸和C末端胺基酸富於多樣性的肽或者它們的混合物。優選第515位的胺基酸成為C末端。另外，也存在優選第516位的胺基酸成為C末端的其他方式。關於以上的修飾和多樣性等，對於具有序列編號12的鹼基序列的DNA來說，也是同樣的。利用上述方法得到的血栓調節蛋白有可能是N末端和C末端的多樣性得以確認的肽的混合物。具體可以舉出由序列編號9中的第19516位、第19515位、第17516位或者第17515位的序列構成的肽的混合物。根據本發明，提供一種製造可溶性血栓調節蛋白的方法，該可溶性血栓調節蛋白實質上不含有能夠由可溶性血栓調節蛋白在酸性下生成的該可溶性血栓調節蛋白的變性體。該製造方法只要包含如下兩個工序就沒有特別限定，所述工序為(l)將含有或疑似含有該可溶性血栓調節蛋白的變性體的該可溶性血栓調節蛋白含有物供給於陰離子交換體或羥基磷灰石；以及(2)在能夠將該可溶性血栓調節蛋白和該可溶性血栓調節蛋白的變性體分離的分離條件下，得到包含實質上不含有該可溶性血栓調節蛋白的變性體的可溶性血栓調節蛋白的級分。但是，優選在工序(l)之前包括工序(O):將該可溶性血栓調節蛋白置於pH為5以下的酸性下，更優選在工序(1)之前包括(0)將該可溶性血栓調節蛋白置於pH為5以下的酸性下的工序並且包括(*)精製可溶性血栓調節蛋白的工序。在本發明的製造方法中，對工序(*)的位置沒有特別限定，但優選在工序(l)之前進行工序(*)。作為本發明的可溶性血栓調節蛋白能夠在酸性下生成該可溶性血栓調節蛋白的變性體的酸性下的條件，可例舉出例如pH為5以下，優選pH為4以下，更優選pH為3以下，作為該pH的下限，可例舉出例如pH為1以上，優選pH為2以上，更優選pH為3以上。另外，作為在酸性下的時間，可例舉出例如0.5小時以上、優選為l小時以上、更優選為2小時以上。另外，作為在酸性下的溫度，可例舉出例如室溫、優選為15'C以下、更優選為8"C以下，作為該溫度的下限，可例舉出通常為(TC以上、優選為2"以上、更優選為5。C以上。在上述的酸性下的條件下，變成可溶性血栓調節蛋白和該可溶性血栓調節蛋白的變性體的混合物。作為利用本發明的方法製造的"實質上不含有可溶性血栓調節蛋白的變性體的血栓調節蛋白"中的可溶性血栓調節蛋白的變性體的含量的上限，優選為3.0%以下，更優選為2.0%以下，進一步優選為1.0%以下，特別優選為0.5%以下，作為其下限，可例舉出0.01%以上，但優選為檢出限以下。可溶性血栓調節蛋白的變性體的含量可以利用色譜法進行分析，例如，使用TSKgelG3000SWXL(7.8mml.D.X30cm;TOSOH社)分析用尺寸排阻色譜法，以含有硫酸鈉的磷酸緩衝液為移動相，供給150pl分析樣品，以0.9ml/分鐘的流速，測定280nm下的吸光度，由此進行分析，由可溶性血栓調節蛋白和可溶性血栓調節蛋白的變性體的峰面積可以求出可溶性血栓調節蛋白的變性體的含量。能夠由本發明的可溶性血栓調節蛋白在酸性下生成的該可溶性血栓調節蛋白的變性體在使用TSKgelG3000SWXL(7.8mml.D.X30cm;TOSOH社)分析用尺寸排阻色譜法、以含有硫酸鈉的磷酸緩衝液為移動相、供給15(^1分析樣品並以流速0.9ml/分鐘進行分析時，以可溶性血栓調節蛋白的保持時間的約9成的保持時間(例如，可溶性血栓調節蛋白的保持時間為約9分鐘時，可溶性血栓調節蛋白的變性體的保持時間約8分鐘)進行檢測。另外，能夠由本發明的可溶性血栓調節蛋白在酸性下生成的該可溶性血栓調節蛋白的變性體在電泳的非變性聚丙烯醯胺凝膠電泳(Native-PAGE)中發生移動，並在血栓調節蛋白的高分子側被發現，在SDS-PAGE中沒有檢測出。作為在本發明中使用的含有或疑似含有能夠在酸性下生成的可溶性血栓調節蛋白的變性體的可溶性血栓調節蛋白含有物(以下有時簡稱為變性體含有物)，只要是含有可溶性血栓調節蛋白和可溶性血栓調節蛋白的變性體的物質，就沒有特別限定，可例舉出使用含有血清成分的培養基或無血清培養基，對能夠生產出可溶性血栓調節蛋白的細胞進行培養，從製備出的培養上清得到的可溶性血栓調節蛋白液體；優選的是使用含有血清成分的培養基或無血清培養基，對能夠生產出可溶性血栓調節蛋白的細胞進行培養，使用製備出的培養上清，經精製工序得到的該可溶性血栓調節蛋白液體，或者置於酸性下得到的該可溶性血栓調節蛋白液體；更優選的是使用含有血清成分的培養基或無血清培養基，對能夠生產出可溶性血栓調節蛋白的細胞進行培養，使用製備出的培養上清，經精製工序得到的該可溶性血栓調節蛋白液體。另外，也存在優選置於酸性下得到的該可溶性血栓調節蛋白液體的其他方式。作為上述精製工序，只要是能夠至少除去可溶性血栓調節蛋白以外的蛋白質的工序，就沒有特別限定，可以舉出如下工序使用負載了針對血栓調節蛋白的抗體的親和色譜法，在酸性下將該可溶性血栓調節蛋白洗脫並回收；或者在傳導率為2534ms/cm、pH為34的條件下使通過上述親和色譜法得到的該可溶性血栓調節蛋白進一步與陽離子交換體接觸，在該工序中，以流通級分的形式回收該可溶性血栓調節蛋白。作為上述可溶性血栓調節蛋白含有物(變性體含有物)，只要其含有可溶性血栓調節蛋白和可溶性血栓調節蛋白的變性體，就沒有特別限定，可例舉出實質上不含有除可溶性血栓調節蛋白和可溶性血栓調節蛋白的變性體以外的蛋白的物質。具體地說，作為可溶性血栓調節蛋白相對於可溶性血栓調節蛋白含有物中的全蛋白的含量的下限，可以舉出50%以上，優選為60%以上，更優選為70%以上，進一步優選為80%以上，特別優選為卯％以上，最優選為95%以上，最最優選為99%以上。另外，有時也優選為99.9%以上。作為上述可溶性血栓調節蛋白的含量，可以舉出可溶性血栓調節蛋白本身的含量，但有時也表示可溶性血栓調節蛋白和可溶性血栓調節蛋白的變性體二者合計的含量。在可溶性血栓調節蛋白的含量在表示可溶性血栓調節蛋白和可溶性血栓調節蛋白的變性體二者合計的含量的情況下，作為可溶性血栓調節蛋白相對於可溶性血栓調節蛋白含有物中的全蛋白的含量的下限，可例舉出50%以上，優選為60%以上，更優選為70%以上，進一步優選為80%以上，特別優選為90%以上，最優選為95%以上，最最優選為99%以上。另夕卜，有時也優選為99.9%以上。上述可溶性血栓調節蛋白的含量可以使用色譜法進行測定，例如，使用AsahiPakC4P-50(4.6mmLD.X15cm;昭和電工株式會社)分析用反相色譜法，利用含有0.1。/。三氟乙酸的蒸餾水(A液)和含有0.1%三氟乙酸的乙腈(B液)的移動相，供給150(1l分析樣品，以0.8ml/分鐘的流速，將A液和B液的混合比從96:4線性變化至48分鐘後的0:100，對洗脫液測定280nm下的吸光度，由此進行分析，可以根據可溶性血栓調節蛋白和其他蛋白質的峰面積求出上述可溶性血栓調節蛋白的含量。另外，還可以使用日本特開平11-341990號公報所記載的ELISA方法，測定可溶性血栓調節蛋白以外的蛋白質，由此求出可溶性血栓調節蛋白的含量。在本發明中，優選在經過將該血栓調節蛋白置於PH為5以下的酸性下的工序之後，將含有或疑似含有該可溶性血栓調節蛋白的變性體的該血栓調節蛋白含有物供給於陰離子交換體或羥基磷灰石。作為酸性下的pH，上限優選pH為5以下，更優選pH為4以下，進一步優選pH為3以下，下限優選pH為l以上，更優選pH為2以上，進一步優選pH為3以上。此外，作為在酸性下的時間，可舉出例如0.5小時以上、優選為1小時以上、更優選為2小時以上。另外，作為在酸性下的溫度，可舉出例如室溫、優選為15'C以下、更優選為8"以下，作為在酸性下的溫度的下限，可舉出通常為0。C以上、優選為2'C以上、更優選為5。C以上。作為在本發明中使用的鹽，適合的鹽是氯化物，最適合的鹽是氯化鈉。另外，對於羥基磷灰石來說，適合的磷酸鹽是磷酸鈉、磷酸鉀。作為能夠將可溶性血栓調節蛋白和可溶性血栓調節蛋白的變性體分離的分離條件，可以舉出線性或分段或者線性和分段的組合的梯度洗脫條件、在流通級分中可溶性血栓調節蛋白不洗脫的條件、或等度洗脫條件，優選線性或分段或者線性和分段的組合的梯度洗脫條件、或在流通級分中可溶性血栓調節蛋白不洗脫的條件，更優選線性或分段或者線性和分段的組合的梯度洗脫條件。另外，也存在優選在流通級分中可溶性血栓調節蛋白不洗脫的條件的其他方式。另外，有時也優選等度洗脫條件。作為流通級分，可以舉出將可溶性血栓調節蛋白含有物供給於陰離子交換體或羥基磷灰石後，可溶性血栓調節蛋白不吸附於陰離子交換體或羥基磷灰石上的級分。作為流通級分，只要實質上不含有血栓調節蛋白的變性體，就沒有特別限定，例如可以舉出120柱容積、150柱容積、或者1100柱容積。作為梯度洗脫條件，根據使用的柱進行適當設定即可。作為具體的條件，可舉出後述的條件。另外，作為在流通級分中可溶性血栓調節蛋白不洗脫的條件，使用的緩衝液也可以根據使用的柱進行來適當設定。作為具體的條件，可舉出後述的條件。另外，作為等度洗脫條件，只要根據使用的柱來適當設定即可。陰離子交換體優選使用強陰離子交換體，即具有季銨基的陰離子交換體(例如SOURCEQ(GEHealthcareBio-Sciences公司))，在供給變性體含有物之前，可以使用數柱容積的pH為49的緩衝液(對緩衝液的種類沒有限定，例如，0.1M乙酸、pH4，或0.02M磷酸、pH7.3，或0.02MTris、pH8)使陰離子交換體平衡化。平衡後，供給變性體含有物，並且在可溶性血栓調節蛋白洗脫之前，可以使用pH為49的緩衝液(對緩衝液的種類沒有限定，例如，O.IM乙酸、pH4，或0.02M磷酸、pH7.3，或0.02MTris、pH8)對其進行清洗。使用pH為59、優選pH為78的緩衝液(對緩衝液的種類沒有限定，例如，0.02M磷酸、pH7.3，或0.02MTris、pH8)，在01M鹽濃度下使吸附的變性體含有物梯度洗脫，由此使可溶性血栓調節蛋白和可溶性血栓調節蛋白的變性體分離洗脫。分離條件只要是能夠將可溶性血栓調節蛋白和可溶性血栓調節蛋白的變性體分離的分離條件，就沒有特別限定，作為梯度洗脫條件，可以舉出線性或分段、或者線性和分段的組合的條件。優選該梯度洗脫的鹽濃度為00.3M，更優選鹽濃度為0.030.26M。洗脫緩衝液的量是240柱容積，優選為520柱容積。使用梯度洗脫條件的情況下，作為得到包含實質上不含有該可溶性血栓調節蛋白的變性體的可溶性血栓調節蛋白的洗脫級分的工序，可以舉出例如(a)預先確認可溶性血栓調節蛋白的洗脫級分的位置，得到包含實質上不含有該可溶性血栓調節蛋白的變性體的可溶性血栓調節蛋白的洗脫級分；或者(b)—邊確認洗脫級分中是否存在可溶性血栓調節蛋白，一邊得到包含實質上不含有該可溶性血栓調節蛋白的變性體的可溶性血栓調節蛋白的洗脫級分。具體說明工序(a)，可以舉出如下工序利用能夠確認可溶性血栓調節蛋白和可溶性血栓調節蛋白的變性體的存在的分析方法(例如，下面的實施例7中所述的尺寸排阻色譜法)，預先確認實質上不含有該可溶性血栓調節蛋白的變性體的洗脫級分的位置，將該位置的洗脫級分回收。另外，具體說明工序(b)，可以舉出如下工序一邊利用能夠確認可溶性血栓調節蛋白和可溶性血栓調節蛋白的變性體的存在的分析方法(例如，下面的實施例7中所述的尺寸排阻色譜法)，確認洗脫級分含有該可溶性血栓調節蛋白且實質上不含有該可溶性血栓調節蛋白的變性體，一邊得到包含實質上不含有該可溶性血栓調節蛋白的變性體的該可溶性血栓調節蛋白的洗脫級分。優選工序(b)。另外，根據情況有時也優選工序(a)。此外，在供給變性體含有物之前，將變性體含有物在適當的緩衝液中進行置換，由此也可以以流通級分的形式得到實質上不含有血栓調節蛋白的變性體的可溶性血栓調節蛋白。作為流通級分，可以舉出將可溶性血栓調節蛋白含有物供給於陰離子交換體後，可溶性血栓調節蛋白不吸附在陰離子交換體上的級分。在利用可溶性血栓調節蛋白和可溶性血栓調節蛋白的變性體之間對柱的吸附力的差異的情況中，陰離子交換體可以優選使用強陰離子交換體，即具有季銨基的陰離子交換體，例如SOURCEQ、QSepharoseFF(GEHealthcareBio-Sciences公司)、Sartobind(Sartorius公司)、Mustang(PALL社)。用於置換的適當的緩衝液優選為pH58、鹽濃度0.10.2M的緩衝液，對緩衝液的種類沒有限定，例如，可以使用0.02M磷酸、0.18M氯化鈉、pH7.3。作為得到流通級分的方法，只要能夠一邊利用後述的實施例7所述的尺寸排阻色譜法等分析方法來確認級分含有該可溶性血栓調節蛋白且實質上不含有該可溶性血栓調節蛋白的變性體，一邊適當得到該級分即可。另外，也可以使用等度洗脫條件。在該情況下也可以參照梯度洗脫條件和在流通級分中可溶性血栓調節蛋白不洗脫的條件，來設定適合的條件。羥基磷灰石使用例如Macro-Prep(R)CeramicHydroxyaPatiteTYPEl(BIO-RAD社))，在供給變性體含有物之前，可以使用數柱容積的pH69的磷酸濃度為8mM以下、優選為5mM以下、更優選為2mM以下的緩衝液(對緩衝液的種類沒有限定，例如，5mM磷酸、0.2M氯化鈉、pH7，或lmM磷酸、25mMTRIS、0.2M氯化鈉、pH7.7，或2mM磷酸、20mMHEPES、0.17M氯化鈉、pH7)對羥基磷灰石進行平衡化。供給的變性體含有物的緩衝液使用pH69的磷酸濃度為8mM以下、優選為5mM以下、更優選為2mM以下的緩衝液，平衡後，供給變性體含有物，並且在可溶性血栓調節蛋白洗脫之前，可以使用pH69的磷酸濃度為8mM以下、優選為5mM以下、更優選為2mM以下的緩衝液(對緩衝液的種類沒有限定，例如，5mM磷酸、0.2M氯化鈉、pH7，或lmM磷酸、25mMTRIS、0.2M氯化鈉、pH7.7，或2mM磷酸、20mMHEPES、0.17M氯化鈉、pH7)對其進行清洗。使用pH69、優選pH78的緩衝液，在00.5M的磷酸鹽濃度下使吸附的變性體含有物梯度洗脫，由此使可溶性血栓調節蛋白和可溶性血栓調節蛋白的變性體分離洗脫。分離條件只要是能夠將可溶性血栓調節蛋白和可溶性血栓調節蛋白的變性體分離的分離條件，就沒有特別限定，作為梯度洗脫條件，可以舉出線性或分段。優選該梯度的磷酸鹽濃度為140mM，更優選的是，以分段進行，在810mM磷酸鹽濃度下可以得到包含實質上不含有可溶性血栓調節蛋白的變性體的可溶性血栓調節蛋白的洗脫級分。通過進一步提高磷酸鹽的濃度，使可溶性血栓調節蛋白的變性體洗脫。在使用梯度洗脫條件的情況下，作為得到包含實質上不含有該可溶性血栓調節蛋白的變性體的可溶性血栓調節蛋白的洗脫級分的方法，可以舉出與用陰離子交換體分離可溶性血栓調節蛋白和可溶性血栓調節蛋白的變性體時的方法相同的方法。此外，在供給變性體含有物之前，將變性體含有物在適當的緩衝液中進行置換，由此也可以以流通級分的形式得到實質上不含有血栓調節蛋白的變性體的可溶性血栓調節蛋白。作為流通級分，可以舉出將可溶性血栓調節蛋白含有物供給於羥基磷灰石後，可溶性血栓調節蛋白不吸附在羥基磷灰石上的級分。利用可溶性血栓調節蛋白和可溶性血栓調節蛋白的變性體之間對柱的吸附力的差異。在該情況下，羥基磷灰石可以使用例如Macro-Prep(R)CeramicHydroxyaPatiteTYPE1(BI0-RAD社)。用於置換的適當的緩衝液是pH為69、磷酸鹽濃度為520mM(優選pH為67、磷酸鹽濃度為510mM)的緩衝液，對緩衝液的種類沒有限定，例如，可以使用10mM磷酸、10mM氯化鈉、pH7的緩衝液。作為得到流通級分的方法，只要能夠一邊利用後述的實施例7中記載的尺寸排阻色譜法等分析方法來確認級分含有該可溶性血栓調節蛋白且實質上不含有該可溶性血栓調節蛋白的變性體，一邊適當得到該級分即可。另外，也可以使用等度洗脫條件。在該情況下也可以參照梯度洗脫條件和在流通級分中可溶性血栓調節蛋白不洗脫的條件，來設定適合的條件。在本發明的製造方法中，將可溶性血栓調節蛋白含有物供給於陰離子交換體或羥基磷灰石，得到包含實質上不含有可溶性血栓調節蛋白的變性體的可溶性血栓調節蛋白的洗脫級分後，優選不包括使該級分的pH為4以下的工序。另外，優選在其後的用於將該可溶性血栓調節蛋白製成藥品原料的濃縮工序和/或脫鹽工序中也不使pH為4以下。作為使用含有血清成分的培養基或無血清培養基對能夠生產出可溶性血栓調節蛋白的細胞進行培養並從製備出的培養上清精製可溶性血栓調節蛋白的優選的方法，可以舉出以血栓調節蛋白活性、例如利用凝血酶促進蛋白C活化的活性為指標的精製方法，可以舉出例如如下的精製方法用離子交換柱的Q-瓊脂糖凝膠FF對培養上清進行粗精製，將具有血栓調節蛋白活性的級分回收，接著，用親和柱的抗小鼠血栓調節蛋白單克隆抗體進行精製，將血栓調節蛋白活性強的級分回收，用陽離子交換柱的SP-瓊脂糖凝膠FF對回收級分進行精製，將流通級分濃縮，經凝膠過濾，得到血栓調節蛋白活性級分。利用該SP-瓊脂糖凝膠FF進行精製後，在最佳的條件下使用本發明的陰離子交換體、優選強陰離子交換體即具有季銨基的陰離子交換體(例如SOURCEQ(GEHealthcareBio-Sciences公司)或本發明的羥基磷灰石(例如Macro-Prep(R)CeramicHydroxyaPatiteTYPEl(BIO-RAD社))，由此能夠簡便地得到實質上不含有可溶性血栓調節蛋白的變性體的高純度的血栓調節蛋白。此外，用抗小鼠血栓調節蛋白單克隆抗體進行精製後，通過在最佳的條件下使用本發明的陰離子交換體、優選強陰離子交換體即具有季銨基的陰離子交換體(例如SOURCEQ(GEHealthcareBio-Sciences公司))，能夠將可溶性血栓調節蛋白的變性體和小鼠抗體衍生物、及使用含血清培養基的情況下的血清衍生物同時去除，能夠簡便地得到實質上不含有可溶性血栓調節蛋白的變性體的高純度的血栓調節蛋白。進一步通過不使利用上述例舉出的方法得到的高純度的血栓調節蛋白的pH為4以下的濃縮工序和/或脫鹽工序，可以得到緩衝液得以交換的高純度精製品。利用上述方法得到的可溶性血栓調節蛋白可用作藥品原料。此外，根據本發明，提供一種精製可溶性血栓調節蛋白的方法，該方法使該精製的可溶性血栓調節蛋白實質上不含有能夠由可溶性血栓調節蛋白在酸性下生成的該可溶性血栓調節蛋白的變性體。該精製方法只要包括如下工序，就沒有特別限定，所述工序為(l)將含有或疑似含有該可溶性血栓調節蛋白的變性體的該可溶性血栓調節蛋白含有物供給於陰離子交換體或羥基磷灰石；以及(2)在能夠將該可溶性血栓調節蛋白和該可溶性血栓調節蛋白的變性體分離的分離條件下，得到包含實質上不含有該可溶性血栓調節蛋白的變性體的可溶性血栓調節蛋白的級分。另外，作為該精製方法，可以舉出具有上述本發明的可溶性血栓調節蛋白的製造方法所具有的特徵的精製方法。實施例利用以下的實施例更具體地說明本發明，但本發明不受這些實施例的任何限定。(實施例l)利用強陰離子交換體柱的粗精製根據日本特開平11-341990號公報，通過基因操作技術，製備編碼序列編號9記載的胺基酸序列的DNA，經轉基因併入中國倉鼠卵巢細胞，對併入後的中國倉鼠卵巢細胞進行培養，得到培養液上清。將得到的411培養液上清用0.2lam的膜過濾器(Millipore社、Millipak20)過濾。將過濾後的培養上清供給於用含150mM氯化鈉的20mMTris鹽緩衝液(pH7.4)平衡化的Q-Sepharose(GEHealthcareBio-Sciences公司)柱(直徑44cm、高度26.3cm)。接著，用6柱容積的含有180mM氯化鈉的20mM乙酸緩衝液進行清洗，進一步用8柱容積的含有180mM氯化鈉的20mMTris鹽緩衝液(pH7.4)進行清洗，用含有300mM氯化鈉的20mMTris鹽緩衝液(pH7.4)開始洗脫，得到從洗脫液在280nm下的吸光度的峰上升起的0.5柱容積容量的洗脫液作為粗精製品。需要說明的是，以760mL/分鐘的流速進行實施。(實施例2)利用單克隆抗體的精製根據日本特開平11-341990號公報，製作以來自人肺的血栓調節蛋白為抗原的抗血栓調節蛋白單克隆抗體，與CNBr-activatedSepharose(溴化氰活化瓊脂糖凝膠)4FastFlow(GEHealthcareBio-Sciences公司)接觸反應，偶聯抗血栓調節蛋白單克隆，製成抗血栓調節蛋白單克隆結合Sepharose4FastFlow。將實施例1中得到的洗脫級分中的16.51供給於用含0.3M氯化鈉的20mM磷酸緩衝液(pH7.3)平衡化的單克隆抗體柱(直徑44cm、高度10.5cm)。流通6柱容積的含有1.0M氯化鈉的20mM磷酸緩衝液(pH7.3)，進一步流通3柱容積的0.1M乙酸緩衝液(pH5.0)進行清洗，用含有0.3M氯化鈉的0.1M甘氨酸鹽酸緩衝液(pH3.0)開始洗脫，得到從洗脫液在280nm下的吸光度的峰上升到下降的洗脫液，在洗脫液中添加容量為洗脫液容積的1/10的0.5M磷酸緩衝液(pH7.3)，得到精製液。需要說明的是，以760mL/分鐘的流速進行實施。(實施例3)利用強陽離子交換體柱的精製用1.0M甘氨酸鹽酸緩衝液(pH2.0)將實施例2中得到的精製液中的193ml調整成pH為3.5，將經調整的液體供給於用含0.3MNaCl的0.1M甘氨酸鹽酸緩衝液(pH3.5)平衡化的SP-SepharoseFF(GEHealthcareBio-Sciences公司)柱(直徑16mm、高度12cm)。用含300mMNaCl的100mM甘氮酸鹽酸緩衝液(pH3.5)開始進行清洗，得到280nm下的吸光度的峰從上升到下降的流通級分，立即用0.5M磷酸緩衝液(pH7.3)中和至pH為7，得到高純度精製品。需要說明的是，以3.3mL/分鐘流速進行實施。通過使用上述AsahiPakC4P-50的色譜法或日本特開平11-341990號公報所記載的ELISA法等，獲知該高純度精製品的可溶性血栓調節蛋白的含量為99%以上。(實施例4)利用陰離子交換體線性梯度洗脫的可溶性血栓調節蛋白的變性體的分離(l)將實施例3中得到的高純度精製品中的10ml用30ml純淨水進行稀釋。將稀釋後的40ml溶液供給於用含0.1M氯化鈉的20mM磷酸緩衝液(pH6)平衡化的sourrceQ30(GEHealthcareBio-Sciences公司)柱(直徑0.5cm、高度9.8cm)。用3柱容積的20mM磷酸緩衝液(pH6)清洗，以20mM磷酸緩衝液(pH6)的0.1M0.3M氯化鈉的線性梯度、洗脫容積為20柱容積的條件開始洗脫，從洗脫液在280nm下的吸光度的峰上升開始以1柱容積為單位進行分離。需要說明的是，以樣品的加入和清洗時的流速為2.2mL/分鐘、洗脫時的流速為0.3mL/分鐘的條件進行實施。色譜圖見圖1。(實施例5)利用陰離子交換體線性梯度洗脫的可溶性血栓調節蛋白的變性體的分離(2)將實施例3中得到的高純度精製品中的10ml用30ml純淨水進行稀釋。將稀釋後的40ml溶液供給於用含0.1M氯化鈉的20mM磷酸緩衝液(pH7)平衡化的sourrceQ30(GEHealthcareBio-Sciences公司)柱(直徑0.5cm、高度9.8cm)。用3柱容積的20mM磷酸緩衝液(pH7)清洗，以20mM磷酸緩衝液(pH7)的0.1M0.3M氯化鈉的線性梯度、洗脫容積為20柱容積的條件開始洗脫，從洗脫液在280nm下的吸光度的峰上升開始以1柱容積為單位進行分離。需要說明的是，以樣品的加入和清洗時的流速為2.2mL/分鐘、洗脫時的流速為0.3mL/分鐘的條件進行實施。色譜圖見圖2。(實施例6)利用陰離子交換體線性梯度洗脫的可溶性血栓調節蛋白的變性體的分離(3)將實施例3中得到的高純度精製品中的10ml用30ml純淨水進行稀釋。將稀釋後的40ml溶液供給於用含0.1M氯化鈉的20mMTris緩衝液(pH8)平衡化的sourrceQ30(GEHealthcareBio-Sciences公司)柱(直徑0.5cm、高度9.8cm)。用3柱容積的20mMTris緩衝液(pH8)清洗，以20mMTris緩衝液(pH8)的0.1M0.3M氯化鈉的線性梯度、洗脫容積為20柱容積的條件開始洗脫，從洗脫液在280nm下的吸光度的峰上升開始以1柱容積為單位進行分離。需要說明的是，以樣品的加入和清洗時的流速為2.2mL/分鐘、洗脫時的流速為0.3mL/分鐘的條件進行實施。色譜圖見圖3。(實施例7)實施例46的可溶性血栓調節蛋白的變性體含量的評價使用TSKgelG3000SWXL(7.8mml.D.X30cm;TOSOH社)分析用尺寸排阻色譜法，對各級分的可溶性血栓調節蛋白的變性體含量進行評價。柱用移動相平衡化，移動相使用含0.1M硫酸鈉的50mM磷酸鹽緩衝液(pH7.3)，流速為0.9ml/分鐘，供給各級分150|il，進行分析。另外，各級分的回收是通過測定280nm下的吸光度來算出的。實施例4實施例6的結果列於下表l。另外，對在實施例3中得到的高純度精製品也用上述方法測定了可溶性血栓調節蛋白的變性體含量，測定結果為7.0%(圖4)。在實施例4實施例6任意一個條件下，均能夠以76%81%的回收率得到實質上不含有可溶性血栓調節蛋白的變性體的高純度可溶性血栓調節蛋白。tableseeoriginaldocumentpage35(實施例8)利用陰離子交換體分段梯度洗脫的可溶性血栓調節蛋白的變性體的分離將實施例3中得到的高純度精製品中的70ml用210ml純淨水進行稀釋。將稀釋後的溶液供給於用含30mM氯化鈉的20mM磷酸緩衝液(pH7.3)平衡化的sourceQ30(GEHealthcareBio-Sciences公司)柱(直徑0.5cm、高度20.5cm)。用3柱容積的含30mM氯化鈉的20mM磷酸緩衝液(pH7.3)清洗，用含0.18M氯化鈉的20mM磷酸緩衝液(pH7.3)開始洗脫，得到從洗脫液在280nm下的吸光度的峰上升到6柱容積容量為止的洗脫液。使用TSKgelG3000SWXL(TOSOH社)分析用尺寸排阻色譜法，在實施例7的條件下評價洗脫液的可溶性血栓調節蛋白的變性體含量，結果可溶性血栓調節蛋白的變性體含量比率為0.0%，得到了實質上不含有可溶性血栓調節蛋白的變性體的高純度可溶性血栓調節蛋白。洗脫液的回收率為89%。需要說明的是，以樣品的加入和清洗時的流速為0.8mL/分鐘、洗脫時的流速為0.4mL/分鐘的條件進行實施。色譜圖見圖5。(實施例9)利用基因操作技術對來自人的血栓調節蛋白基因進行製備及轉基因，通過對經轉基因而併入的中國倉鼠卵巢細胞進行無血清培養來得到含有可溶性血栓調節蛋白的培養上清對於在為了得到含有可溶性血栓調節蛋白的培養上清的培養中使用的不含動物成分的無血清培養基，製備了種子培養基和灌流培養用培養基這兩種。種子培養基是在每1L的ISCHO-CD(液體培養基，產品目錄編號91119-1L，製造商IrvineScientific)中以HTsupplement(液體，產品目錄編號11067-030,製造商Invitrogen)為5mL、L-Glutamine200mM(液體，產品目錄編號25030-081，製造商Invitrogen)為40mL的比例進行無菌混合而製備出的。對於種子培養基來說，保存時為冷藏保存(28度)，使用時，在即將使用前在36'C恆溫水浴槽中加熱再進行使用。灌流培養用培養基是在每1L的去離子超濾水中以ISCHO-CD-A3(粉末培養基，產品目錄編號98688，製造商IrvineScientific)為20.8g、食鹽(等級特級，製造商和光純藥)為2.6g、碳酸氫鈉食鹽(等級特級，製造商和光純藥)為4.化的比例添加並溶解後，用0.2,過濾器(PVDF製造，製造商Millipore)無菌過濾而製備出的。灌流培養用培養基在保存時、使用時均要冷藏保存(28度)。在種子培養開始時，將冷凍保存的能生產出可溶性血栓調節蛋白的細胞(日本特開平11-341990號公報)在37度恆溫水浴槽中快速融化，懸浮於種子培養基中，進行離心分離(2000rpm、2分鐘、國產化學)，除去離心上清後，將細胞沉澱懸浮於lOOmL種子培養基中，分注到225cn^T型燒瓶培養容器(製造商BDBiosciences)中，開始第1段的種子培養。第1段種子培養以在36度、5%二氧化碳培養箱內的靜置培養的方式實施。第1段種子培養的浮遊活細胞密度達到約8X105cdls/mL時，在第2段種子培養中繼代培養。第2段種子培養以後以攪拌培養來實施。對於攪拌培養中的種子培養的規模和攪拌培養容器，以第2段種子培養為400mL(玻璃制轉瓶，製造商柴田科學)、第3段種子培養為1.6L(玻璃制轉瓶，製造商柴田科學)、第4段種子培養為6L(玻璃制球形轉瓶，製造商柴田科學)的方式依次擴大繼代培養液量。種子培養的浮遊活細胞密度達到約8X105cdls/mL時，在下一段的種子培養中繼代培養。在繼代培養中，增加與從繼代後的培養規模中減去繼代前的培養規模得到的值相同量的種子培養用培養基以進行擴大。攪拌培養在36度、5%二氧化碳培養箱內利用磁力攪拌器(製造商柴田科學)在攪拌速度為60100rpm的條件下實施。第4段種子培養的浮遊活細胞密度達到約8X105cells/mL時，將種子培養液分別輸送至3臺灌流培養槽(2L灌流培養裝置，製造商丸菱生物)，每臺輸送2L，開始灌流培養。在灌流培養中供給至灌流培養槽中的灌流培養用培養基的定量輸送是使用蠕動泵(製造商Masterflex)以2L/天的流量進行的。灌流培養中的細胞分離是利用設置在灌流培養槽內的旋轉過濾器進行的。3臺灌流培養槽分別使用了不同的旋轉過濾器。第一臺使用了不鏽鋼製篩網(FP-IO，孔徑10(am，製造商富士過濾器工業)的旋轉過濾器、第二臺使用了不鏽鋼製篩網(FP-30，孔徑30^im，製造商富士過濾器工業)的旋轉過濾器、第三臺使用了聚酯PETP制篩網(孔徑10,，產品目錄編號BB-8808571，製造商Sartorius)的旋轉過濾器。通過顯示灌流培養槽內的2L液面的液位傳感器的動作，在培養液量為2L以上時，在培養槽內壓力的作用下間歇地排出利用設置在灌流培養槽內的旋轉過濾器進行了細胞分離的培養上清。間歇排出的培養上清被輸送至冷藏保存的容器中，在28度冷藏保存。對於灌流培養條件，控制槽內溫度為3537"C、溶解氧濃度為10%90%、pH為6.87.6來進行培養。灌流培養進行30天，這期間的活細胞平均密度為第一臺17xlO、dls/mL、第二臺10xl06cells/mL、第三臺18"06cells/mL。在3臺灌流培養槽中，將從灌流培養第三天起至第30天為止得到的培養上清混合，用0.2pm過濾器(PVDF制，製造商Millipore)過濾，過濾後的培養上清冷藏保存(28度)。(實施例IO)利用強陰離子交換體柱的精製將由實施例9得到的培養液上清中的850ml供給至用含30mM氯化鈉的20mM乙酸鈉、120mM乙酸緩衝液平衡化的Q-SepharoseFF(GEHealthcareBio-Sciences公司)柱(直徑1.6cm、高度29cm)。接著，用12柱容積的含30mM氯化鈉的20mM乙酸鈉、120mM乙酸緩衝液(pH3.8)清洗，用含140mM氯化鈉的20mM乙酸鈉、40mM乙酸緩衝液(pH4.2)開始洗脫，向從洗脫液在2S0nm下的吸光度的主峰上升起的2柱容積容量的洗脫液中添加1/5柱容積容量的含10mM磷酸鉀的1MHEPES緩衝液(pH8)，得到精製品。需要說明的是，以2mL/分鐘的流速進行實施。(實施例1l)利用羥基磷灰石分段梯度洗脫的可溶性血栓調節蛋白的變性體的分離將實施例10中得到的精製品中的20ml供給於用含0.17M氯化鈉、2mM磷酸鈉的20mMHEPES緩衝液(pH7)平衡化的Macro-Prep(R)Ce體icHydroxyaPatiteTYPEl(BIO匿RAD社)柱(直徑0.5cm、高度9.7cm)。用6柱容積的含0.17M氯化鈉、2mM磷酸鈉的20mMHEPES緩衝液(pH7)清洗，用含10mM氯化鈉的8mM磷酸緩衝液(pH7)以4柱容積的洗脫容積進行洗脫，得到從洗脫液在280nm下的吸光度的峰上升到下降的洗脫液。需要說明的是，以0.4mL/分鐘的流速進行實施。使用TSKgelG3000SWXL(TOSOH社)分析用尺寸排阻色譜法，在實施例7的條件下評價洗脫液的可溶性血栓調節蛋白的變性體含量，結果可溶性血栓調節蛋白的變性體含量比率為0.8%以下。柱用0.5M磷酸緩衝液(pH7)進行再生。色譜圖見圖6。(實施例12)利用強陰離子交換體柱的粗精製(2)將實施例9中得到的培養液上清5.21供給於用含150mM氯化鈉的20mMTris鹽緩衝液(pH7.7)平衡化的CaptoQ(GEHealthcareBio-Sciences公司)柱(直徑1.6cm、高度26cm)。接著，用15柱容積的含0.18M氯化鈉的20mMTris鹽緩衝液(pH7.7)進行清洗，用含0.3M氯化鈉的20mMTris鹽緩衝液(pH7.7)開始洗脫，得到從洗脫液在280nm下的吸光度的峰上升起的2柱容積容量的洗脫液作為粗精製品。需要說明的是，以10mL/分鐘的流速進行實施。(實施例13)利用單克隆抗體的精製(2)按照專利文獻2製作單克隆抗體。將實施例12中得到的洗脫級分中的72mL供給於用含0.3M氯化鈉的20mM磷酸緩衝液(pH7.3)平衡化的單克隆抗體柱(直徑5cm、高度llcm)。流通6柱容積的含l.OM氯化鈉的20mM磷酸緩衝液(pH7.3)，進而流通3柱容積的0.1M乙酸緩衝液(pH5.0)進行清洗，用含20mM氯化鈉的0.1M甘氨酸鹽酸緩衝液(pH3.0)開始洗脫，得到從洗脫液在280nm下的吸光度的峰上升到下降的洗脫液，在洗脫液中添加容積容量為洗脫液的15%的0.3M磷酸緩衝液(pH7.3)，得到精製液。需要說明的是，以9.8mL/分鐘的流速進行實施。通過使用上述AsahiPakC4P-50的色譜法或日本特開平11-3419卯號公報所記載的ELISA法等，獲知該精製液的可溶性血栓調節蛋白的含量為99%以上。(實施例14)利用強陰離子交換體的高純度化和可溶性血栓調節蛋白的變性體的去除將實施例13中得到的精製液中的75mL供給於用含40mM氯化鈉的0.1M乙酸緩衝液(pH4)平衡化的sourceQ30(GEHealthcareBio-Sciences公司)柱(直徑0.5cm、高度20.5cm)。流通2柱容積的含40mM氯化鈉的0.1M乙酸緩衝液(pH4)，進而流通4柱容積的含50mM氯化鈉的0.1M乙酸緩衝液(pH4)，並且進一步用3柱容積的含30mM氯化鈉的20mM磷酸緩衝液(pH7.3)清洗，用含0.18M氯化鈉的20mM磷酸緩衝液(pH7.3)開始洗脫，得到從洗脫液在280nm下的吸光度的峰上升起的6柱容積的洗脫液。需要說明的是，以樣品加入時的流速為lmL/分鐘、清洗和洗脫時的流速為0.3mL/分鐘的條件進行實施。使用TSKgelG3000SWXL(TOSOH社)分析用尺寸排阻色譜法，在實施例7的條件下評價洗脫液的可溶性血栓調節蛋白的變性體含量，結果可溶性血栓調節蛋白的變性體含量比率為0.1%,得到實質上不含有可溶性血栓調節蛋白的變性體的高純度可溶性血栓調節蛋白。洗脫液的回收率為71%。色譜圖見圖7。(實施例15)混入異種蛋白質(小鼠抗體衍生物和中國倉鼠卵巢細胞的細胞衍生物)量的評價使用日本特開平11-341990號公報所記載的ELISA方法，對實施例1314的洗脫級分進行評價。測定各洗脫級分在280nm下的吸光度，以吸光度為1的混入量進行評價，評價結果列於下表2。可以同時減少各成分的混入量。[表2]小鼠抗體衍生物(ng/OD)中國倉鼠卵巢細胞的細胞衍生物(ng/OD)實施例131102實施例14N.D.N.D.權利要求1.一種可溶性血栓調節蛋白的製造方法，該可溶性血栓調節蛋白實質上不含有能夠由可溶性血栓調節蛋白在酸性下生成的該可溶性血栓調節蛋白的變性體，其中，該方法包括如下工序(1)將含有或疑似含有該可溶性血栓調節蛋白的變性體的該可溶性血栓調節蛋白含有物供給於陰離子交換體或羥基磷灰石；以及(2)在能夠將該可溶性血栓調節蛋白和該可溶性血栓調節蛋白的變性體分離的分離條件下，得到包含實質上不含有該可溶性血栓調節蛋白的變性體的可溶性血栓調節蛋白的級分。2.如權利要求1所述的製造方法，該方法是製造實質上不含有能夠由可溶性血栓調節蛋白在酸性下生成的該可溶性血栓調節蛋白的變性體的可溶性血栓調節蛋白的方法，其中，該方法包括如下工序(O)將該可溶性血栓調節蛋白置於pH為5以下的酸性下；G)將經上述工序(o)得到的含有或疑似含有該可溶性血栓調節蛋白的變性體的該可溶性血栓調節蛋白含有物供給於陰離子交換體或羥基磷灰石；以及(2)在能夠將該可溶性血栓調節蛋白和該可溶性血栓調節蛋白的變性體分離的分離條件下，得到包含實質上不含有該可溶性血栓調節蛋白的變性體的可溶性血栓調節蛋白的級分。3.如權利要求1或2所述的製造方法，其中，相對於可溶性血栓調節蛋白含有物中的全蛋白，可溶性血栓調節蛋白的含量為80%以上。4.如權利要求13任意一項所述的製造方法，其中，工序(2)是通過進行線性或分段、或者線性和分段的組合的梯度洗脫來得到包含實質上不含有該可溶性血栓調節蛋白的變性體的可溶性血栓調節蛋白的洗脫級分的工序。5.如權利要求13任意一項所述的製造方法，其中，工序(2)是得到流通級分的工序，該工序中得到包含實質上不含有該可溶性血栓調節蛋白的變性體的可溶性血栓調節蛋白的級分。6.如權利要求13任意一項所述的製造方法，其中，工序(2)是通過進行等度洗脫來得到包含實質上不含有該可溶性血栓調節蛋白的變性體的可溶性血栓調節蛋白的洗脫級分的工序。7.如權利要求13任意一項所述的製造方法，其中，工序(1)中，使用pH為49的緩衝液，將該可溶性血栓調節蛋白含有物供給於陰離子交換體；工序(2)中，使用pH為59且鹽濃度為0MlM的緩衝液，進行線性或分段、或者線性和分段的組合的梯度洗脫，(a)預先確認可溶性血栓調節蛋白的洗脫級分的位置，得到包含實質上不含有該可溶性血栓調節蛋白的變性體的可溶性血栓調節蛋白的洗脫級分；或者(b)—邊確認在洗脫級分中是否存在可溶性血栓調節蛋白，一邊得到包含實質上不含有該可溶性血栓調節蛋白的變性體的可溶性血栓調節蛋白的洗脫級分。8.如權利要求13任意一項所述的製造方法，其中，工序(1)中，使用pH為58且鹽濃度為0.1M0.2M的緩衝液，將該可溶性血栓調節蛋白含有物供給於陰離子交換體；工序(2)中，通過使用pH為58且鹽濃度為0.1M0.2M的緩衝液得到流通級分，從而得到包含實質上不含有該可溶性血栓調節蛋白的變性體的可溶性血栓調節蛋白的級分。9.如權利要求13任意一項所述的製造方法，其中，工序(1)中，使用pH為69且磷酸鹽濃度為8mM以下的緩衝液，將可溶性血栓調節蛋白含有物供給於羥基磷灰石；工序(2)中，使用pH為69且磷酸鹽濃度為0M0.5M的緩衝液，進行線性或分段、或者線性和分段的組合的梯度洗脫，(a)預先確認可溶性血栓調節蛋白的洗脫級分的位置，得到包含實質上不含有該可溶性血栓調節蛋白的變性體的可溶性血栓調節蛋白的洗脫級分；或者(b)—邊確認在洗脫級分中是否存在可溶性血栓調節蛋白，一邊得到包含實質上不含有該可溶性血栓調節蛋白的變性體的可溶性血栓調節蛋白的洗脫級分。10.如權利要求13任意一項所述的製造方法，其中，工序(1)中，使用pH為69且磷酸鹽濃度為5mM20mM的緩衝液，將該可溶性血栓調節蛋白含有物供給於羥基磷灰石；工序(2)中，通過使用pH為69且磷酸鹽濃度為5mM20mM的緩衝液得到流通級分，從而得到包含實質上不含有該可溶性血栓調節蛋白的變性體的可溶性血栓調節蛋白的級分。11.如權利要求110任意一項所述的製造方法，其中，該方法在得到包含實質上不含有該可溶性血栓調節蛋白的變性體的可溶性血栓調節蛋白的洗脫級分之後，不包括使該級分的pH為4以下的工序。12.如權利要求111任意一項所述的製造方法，其中，該方法在得到包含實質上不含有該可溶性血栓調節蛋白的變性體的可溶性血栓調節蛋白的洗脫級分之後，包括不使該級分的pH為4以下的濃縮工序和/或脫鹽工序，該製造方法用於將該可溶性血栓調節蛋白製成藥品原料。13.如權利要求112任意一項所述的製造方法，其中，實質上不含有該可溶性血栓調節蛋白的變性體的可溶性血栓調節蛋白中，可溶性血栓調節蛋白的變性體的含量為3%以下。14.如權利要求113任意一項所述的製造方法，其中，該可溶性血栓調節蛋白是由轉化細胞得到的，該轉化細胞是通過將編碼序列編號9或序列編號11記載的胺基酸序列的DNA轉染至宿主細胞而製備的。全文摘要本發明的課題是得到實質上不含有能夠在酸性下生成的可溶性血栓調節蛋白的變性體的可溶性血栓調節蛋白。根據本發明，提供可溶性血栓調節蛋白的製造方法，該方法是由含有或疑似含有能夠在酸性下生成的可溶性血栓調節蛋白的變性體的可溶性血栓調節蛋白含有物製造實質上不含有該可溶性血栓調節蛋白的變性體的可溶性血栓調節蛋白的方法，該方法包括如下工序將該可溶性血栓調節蛋白含有物供給於陰離子交換體或羥基磷灰石；在能夠分離該可溶性血栓調節蛋白的變性體的分離條件下進行線性或分段、或者線性和分段的組合的鹽濃度的梯度洗脫，通過預先確認來得到包含實質上不含有該可溶性血栓調節蛋白的變性體的可溶性血栓調節蛋白的洗脫級分，或者通過一邊確認洗脫級分，一邊得到包含實質上不含有該可溶性血栓調節蛋白的變性體的可溶性血栓調節蛋白的洗脫級分。文檔編號C07K1/16GK101641368SQ20088000962公開日2010年2月3日申請日期2008年3月21日優先權日2007年3月23日發明者大東晉申請人:旭化成製藥株式會社