SIRT6H133Y蛋白及其富集豆蔻醯化修飾肽段的方法和應用
2023-06-21 01:29:47
sirt6h133y，將過表達質粒pet28tev-sirt6h133y轉化大腸桿菌內，2-3天內能夠通過大腸桿菌蛋白質表達系統和his標籤純化得到足夠的sirt6 h133y蛋白。
11.其中，sirt6-flag片段的鹼基序列(seq id no.1)為：
12.atgagcgttaactatgcagcgggtctgagcccgtatgcagataaaggtaaatgtggtctgccggaaatttttgatccgccggaagaactggaacgtaaagtgtgggaactggcgcgtctggtttggcagagcagtagtgttgtttttcataccggtgcaggtattagcaccgcaagcggtattccggattttcgtggtccgcatggtgtatggaccatggaagaacgtggtctggcaccgaaatttgataccacctttgaatctgcacgcccgacacagacccatatggcactggttcagctggaacgcgttggtctgctgcgttttctggttagccagaatgttgatggcctgcatgtgcgtagcggctttccgcgtgataaactggcagaactgcatggtaatatgtttgttgaagaatgtgcaaaatgcaaaactcagtatgttcgtgataccgtggtgggtacgatgggtctgaaagcaaccggtcgtctgtgtacagttgcaaaagcacgtggtctgcgtgcctgtcgtggtgaactgcgcgataccattctggattgggaagatagcctgccggatcgcgatctggcactggcagatgaagcatctcgtaatgctgatctgagtattacactgggtacctctctgcagattcgtcctagcggcaacctgccgctggcaacaaaacgtcgtggtggtcgtctggttattgtgaatctgcagccgaccaaacatgatcgtcatgcagatctgcgtattcatggttatgttgatgaagttatgacccgtctgatgaaacatctgggtctggaaattcctgcttgggatggtccgcgtgttctggaacgtgcactgcctcctctgccgcgtcctcctaccccgaaactggaaccgaaagaagaaagtcctacgcgtattaatggtagcattccggcaggtccgaaacaggaaccttgtgcccagcataatggttctgaacctgcaagtcctaaacgcgaacgcccgaccagcccggcaccgcatcgtcctcctaaacgcgtgaaagcaaaagcagttccaagcgattataaagatgatgatgataaataa。
13.his tag、flag tag雙標籤sirt6 h133y蛋白的胺基酸序列(seq id no.2)(下換線突出為h133y突變位點)：mssyyhhhhhhdydipttenlyfqgamdpefmsvnyaaglspyadkgkcglpeifdppeelerkvwelarlvwqsssvvfhtgagistasgipdfrgphgvwtmeerglapkfdttfesarptqthmalvqlervgllrflvsqnvdglhvrsgfprdklaelygnmfveecakcktqyvrdtvvgtmglkatgrlctvakarglracrgelrdtildwedslpdrdlaladeasrnadlsitlgtslqirpsgnlplatkrrggrlvivnlqptkhdrhadlrihgyvdevmtrlmkhlgleipawdgprvleralpplprpptpklepkeesptringsipagpkqepcaqhngsepaspkrerptspaphrppkrvkakavpsdykddddk。
14.進一步地，pet28a引物分別為：
15.pet28a-f:gcggccgctttcgaatctagagc(seq id no.3)；
16.pet28a-r:gaattccggatccatggcgccctg(seq id no.4)；
17.sirt6引物分別為：
18.sirt6-f:gcgccatggatccggaattcatgagcgttaactatg(seq id no.5)；
19.sirt6-r:ctagattcgaaagcggccgcttatttatcatcatcatc(seq id no.6)。
20.進一步地，得到過表達質粒pet28tev-sirt6h133y時，pcr定點突變擴增的引物分別為：
21.h133y-f:cagaactgtatggtaatatgtttgttgaag(seq id no.7)；
22.h133y-r:catattaccatacagttctgccagtttatc(seq id no.8)。
23.第二方面，本發明提供了一種sirt6 h133y蛋白，其由上述的製備方法得到。
24.第三方面，本發明提供了一種利用上述的sirt6 h133y蛋白進行sirt6 h133y蛋白富集豆蔻醯化修飾肽段的方法，其包括如下步驟：
25.(1)、細胞樣品：細胞可以在dmem低糖培養基內添加抑制劑和脂質、或在dmem低糖
培養基添加豆蔻酸類似物進行細胞培養，用於提高細胞內蛋白質豆蔻醯化修飾水平，收集細胞並消化裂解提取全蛋白；組織樣本：組織可直接消化裂解提取全蛋白。提取的蛋白加入胰蛋白酶進行酶切，得到酶解肽段，冷幹備用；
26.(2)、將酶解肽段溶於緩衝液中，加入sirt6 h133y蛋白和乙腈混合，得到第一混合液；再將anti-flag磁珠加入緩衝液內，然後加入第一混合液進行富集反應，孵育，得到第二混合液；
27.(3)、將第二混合液磁力沉澱，棄去液體，加入緩衝液洗滌，磁力沉澱，反覆洗滌後，徹底棄去液體；
28.(4)、洗滌後的anti-flag磁珠加入洗脫緩衝液，孵育，洗脫，得到肽段洗脫液；
29.(5)、在肽段洗脫液中加入三氟乙酸進行孵育，離心，取上清液凍幹，獲得豆蔻醯化修飾肽段。
30.進一步地，步驟(1)中，抑制劑為肉鹼棕櫚醯轉移酶1a抑制劑(cpt1αinhibitor,aladdin公司，cas number:124083-20-1)，脂質為化學成分明確的脂質濃縮液(化學成分明確的脂質濃縮液來源於thermo公司，詳見:thermo官網www.thermofisher.cn/cn/zh/home/technical-resources/media-formulation.249.html)，豆蔻酸類似物為棕櫚酸炔(alk14)(click chemistry tools公司，cas number:99208-90-9)。
31.進一步地，步驟(1)中，細胞培養的溫度為37℃，時間為6-12h。
32.進一步地，步驟(1)中，組織樣品泛指組織樣品，包括人的各種組織和動物的各種組織。
33.進一步地，步驟(1)中，酶切的溫度為37℃，時間為16-18h。
34.進一步地，步驟(2)和步驟(3)中，緩衝液為myr-ip緩衝液，其包括磷酸緩衝鹽溶液、0.2％吐溫-20和20％乙腈。
35.進一步地，步驟(2)中，孵育的溫度為4℃，時間為16-18h；或室溫2-4h。
36.進一步地，步驟(4)中，洗脫緩衝液包括0.2mol/l甘氨酸和20％乙腈。
37.進一步地，步驟(5)中，孵育的溫度為室溫或37℃，時間為5-10min。
38.進一步地，步驟(5)中，離心的轉速為12000rpm，時間為15-30min。
39.第四方面，本發明提供了豆蔻醯化修飾肽段，其由上述的方法得到。
40.第五方面，本發明提供了一種上述的豆蔻醯化修飾肽段的應用，該豆蔻醯化修飾肽段在質譜鑑定中得以應用，鑑定豆蔻醯化修飾蛋白及修飾位點。
41.由於採用上述方案，本發明的有益效果是：
42.第一、本發明基於sirt6 h133y對豆蔻醯基的結合能力，並通過sirt6 h133y蛋白上的his tag純化蛋白和flag tag標籤對豆蔻醯化修飾肽段進行免疫共沉澱，從而富集得到豆蔻醯化修飾肽段；對豆蔻醯化修飾肽段進行質譜檢測，分析得到豆蔻醯化修飾靶蛋白和修飾位點，故本發明為尋找生物體內潛在的豆蔻醯化修飾靶蛋白，鑑定修飾位點，為解析賴氨酸豆蔻醯化修飾的生理意義提供方法學支撐。同時本發明的方法不僅能夠鑑定賴氨酸豆蔻醯化修飾，還可以通過不同的質量遷移鑑定其他長鏈脂肪醯化修飾位點(例如棕櫚醯化和軟脂醯化)。
43.第二、相比修飾基團泛抗體富集質譜策略，本發明的富集方法成本低，耗時短，且富集材料sirt6 h133y可以通過常規大腸桿菌蛋白表達系統短時間大量製備，富集所用
anti-flag磁珠容易獲得。
附圖說明
44.圖1為本發明的肽段富集質譜鑑定豆蔻醯化修飾蛋白質組學分析的工作流程示意圖。
45.圖2為本發明的實施例1中his tag、flag tag雙標籤sirt6 h133y純化蛋白流程質檢圖。
46.圖3為本發明的實施例2中sirt6敲低293t細胞驗證圖。
47.圖4為本發明的實施例3中dmem低糖培養基添加肉鹼棕櫚醯轉移酶1a抑制劑和化學成分明確的脂質濃縮液培養細胞後全蛋白豆蔻醯化水平圖。
48.圖5為本發明的實施例3中sirt6敲低293t細胞蛋白質提取質檢圖。
49.圖6為本發明的實施例5中添加alk14培養的293t細胞樣本液相色譜肽段分離圖。
50.圖7為本發明的實施例5中賴氨酸豆蔻醯化修飾肽段質譜圖。
具體實施方式
51.本發明提供了一種sirt6 h133y蛋白及其富集豆蔻醯化修飾肽段的方法和應用。
52.如圖1所示，細胞樣本經過蛋白提取，蛋白酶解後通過dsirt6富集豆蔻醯化修飾肽段，上機質譜分析，得到豆蔻醯化修飾蛋白質組譜。即保護利用帶有his tag、flag tag雙標籤的sirt6 h133y蛋白富集豆蔻醯化修飾肽段並進行質譜鑑定豆蔻醯化修飾蛋白的方法。具體描述如下：
53.富集材料sirt6 h133y的製備：
54.通過分子生物學方法設計蛋白突變體sirt6 h133y的表達載體。以sirt6-flag為模板通過sirt6引物得到sirt6-flag片段，以pet28a質粒為模板通過pet28a引物擴增得到質粒片段，通過無縫克隆技術將sirt6-flag片段和質粒片段通過同源拼接得到表達質粒pet28tev-sirt6；sirt6的n端帶his tag，c端帶flag tag。以pet28tev-sirt6為模板通過h133y引物進行pcr定點突變技術，構建帶有his tag、flag tag雙標籤的sirt6 h133y的過表達質粒(pet28tev-sirt6h133y)。在大腸桿菌蛋白質表達系統表達n端his tag和c端flag tag雙標籤的sirt6 h133y蛋白。利用his標籤通過鎳離子交換柱純化sirt6 h133y蛋白，通過sds-page電泳確認純化成功且純度合格。蛋白經過透析後，蛋白保存於-80℃。
55.其中，sirt6-flag片段的鹼基序列(seq id no.1)為：
56.atgagcgttaactatgcagcgggtctgagcccgtatgcagataaaggtaaatgtggtctgccggaaatttttgatccgccggaagaactggaacgtaaagtgtgggaactggcgcgtctggtttggcagagcagtagtgttgtttttcataccggtgcaggtattagcaccgcaagcggtattccggattttcgtggtccgcatggtgtatggaccatggaagaacgtggtctggcaccgaaatttgataccacctttgaatctgcacgcccgacacagacccatatggcactggttcagctggaacgcgttggtctgctgcgttttctggttagccagaatgttgatggcctgcatgtgcgtagcggctttccgcgtgataaactggcagaactgcatggtaatatgtttgttgaagaatgtgcaaaatgcaaaactcagtatgttcgtgataccgtggtgggtacgatgggtctgaaagcaaccggtcgtctgtgtacagttgcaaaagcacgtggtctgcgtgcctgtcgtggtgaactgcgcgataccattctggattgggaagatagcctgccggatcgcgatctggcactggcagatgaagcatctcgtaatgctgatctgagtattacactgggtacctctctgcagattcgtcctagcggcaacctgc
cgctggcaacaaaacgtcgtggtggtcgtctggttattgtgaatctgcagccgaccaaacatgatcgtcatgcagatctgcgtattcatggttatgttgatgaagttatgacccgtctgatgaaacatctgggtctggaaattcctgcttgggatggtccgcgtgttctggaacgtgcactgcctcctctgccgcgtcctcctaccccgaaactggaaccgaaagaagaaagtcctacgcgtattaatggtagcattccggcaggtccgaaacaggaaccttgtgcccagcataatggttctgaacctgcaagtcctaaacgcgaacgcccgaccagcccggcaccgcatcgtcctcctaaacgcgtgaaagcaaaagcagttccaagcgattataaagatgatgatgataaataa。
57.his tag、flag tag雙標籤sirt6 h133y蛋白的胺基酸序列(seq id no.2)(下換線突出為h133y突變位點)：mssyyhhhhhhdydipttenlyfqgamdpefmsvnyaaglspyadkgkcglpeifdppeelerkvwelarlvwqsssvvfhtgagistasgipdfrgphgvwtmeerglapkfdttfesarptqthmalvqlervgllrflvsqnvdglhvrsgfprdklaelygnmfveecakcktqyvrdtvvgtmglkatgrlctvakarglracrgelrdtildwedslpdrdlaladeasrnadlsitlgtslqirpsgnlplatkrrggrlvivnlqptkhdrhadlrihgyvdevmtrlmkhlgleipawdgprvleralpplprpptpklepkeesptringsipagpkqepcaqhngsepaspkrerptspaphrppkrvkakavpsdykddddk。
58.具體地，pet28a引物分別為：
59.pet28a-f:gcggccgctttcgaatctagagc(seq id no.3)；
60.pet28a-r:gaattccggatccatggcgccctg(seq id no.4)。
61.sirt6引物分別為：
62.sirt6-f:gcgccatggatccggaattcatgagcgttaactatg(seq id no.5)；
63.sirt6-r:ctagattcgaaagcggccgcttatttatcatcatcatc(seq id no.6)。
64.pcr定點突變擴增的引物分別為：
65.h133y-f:cagaactgtatggtaatatgtttgttgaag(seq id no.7)；
66.h133y-r:catattaccatacagttctgccagtttatc(seq id no.8)。
67.酶解肽段的製備：
68.由於豆蔻醯化修飾的豐度很低，可以通過動物注射或者培養基添加etomoxir(cpt1α抑制劑)抑制肉鹼脂醯轉移酶1，從而提高細胞質的長鏈脂醯輔酶a含量，有利於提高豆蔻醯化修飾豐度。同樣敲除sirt6基因也有利於豆蔻醯化修飾豐度的提高。
69.western blotting證明細胞通過低糖(1g/ml)的dmem培養基，加入50μmol/l的etomoxir、1％的化學成分明確的脂質濃縮液(美國gibco)能夠較好地提高豆蔻醯化修飾豐度。還可以通過培養基添加豆蔻酸類似物alk14(棕櫚酸炔)，提高模擬豆蔻醯化修飾的豐度。
70.收集的組織或細胞進行消化裂解後，加入8mol/l的ua裂解液，冰上超聲裂解(100w，工作10s，間歇10s，循環10次)，14000rpm離心30min後取上清得到蛋白裂解液測量濃度。取樣品蛋白質20μg，加入5x上樣緩衝液，沸水浴5min，進行12.5％sds-page電泳(120v，75min)，考馬斯亮藍染色鑑定蛋白質提取質量。取2mg蛋白樣品加入10mmol/l二硫蘇糖醇(dtt)在37℃孵育2h以破壞蛋白質二硫鍵，後冷卻至室溫，加入iaa至終濃度50mmol/l，避光孵育30min用來修飾蛋白質sh基團。加入5倍體積水，將ua裂解液濃度稀釋至1.5mol/l，按照50:1比例加入trypsin，37℃酶切18h左右。通過spe c18柱脫鹽，凍幹，得到酶解肽段，存放於-80℃備用。
71.豆蔻醯化修飾肽段的富集：
72.(1)酶解肽段(1mg)復溶於400μl預冷myr-ip緩衝液中，隨後加入80μl的sirt6 h133y蛋白(1mg/ml)和20μl乙腈，混勻，30℃反應4h，使sirt6結合修飾肽段；
73.(2)取50μl的anti-flag磁珠於1.5ml的ep管中，加入500μl的myr-ip緩衝液洗滌，混勻後將ep管放在磁力架上分離beads和液體，棄去液體，洗滌3次；
74.(3)將步驟(1)中的反應液與預處理好的anti-flag磁珠(該磁珠可以從國內beenbio公司(貨號pr002)和國外thermo scientific公司(貨號a36797)購買得到)混勻進行富集反應，4℃孵育16-18h；
75.(4)將上述反應液從4℃取出，放在磁力架上分離，棄去液體；
76.(5)加入500μl的myr-ip緩衝液洗滌，混勻後將ep管放在磁力架上分離beads和液體，棄去液體，重複洗滌3次；
77.(6)加入150μl洗脫緩衝液混勻，室溫搖床孵育15min，放在磁力架上，將液體轉入乾淨的1.5ml的ep管中，洗脫3次，混合；
78.(7)在洗脫產物中加入4％的tfa，37℃孵育10min後，12000rpm離心15min沉澱sirt6蛋白，上清保留，可以直接作為質譜樣品進行質譜鑑定或冷凍乾燥保存。如果是凍幹肽段用0.1％甲酸20％乙腈水溶液復溶作為質譜樣品。
79.myr-ip緩衝液：1x pbs(不含ca
2+
、mg
2+
，ph值為7.4)，0.2％tween-20，20％乙腈；洗脫緩衝液：0.2mol/l甘氨酸，20％乙腈，ph值為2.2。
80.質譜鑑定：
81.質譜樣品採用納升流速的高效液相系統easy-nlc 1200進行分離。流動相a為0.1％甲酸水溶液，流動相b為0.1％甲酸乙腈水溶液(乙腈為80％)。首先色譜柱以100％的流動相a進行平衡，隨後樣品的酶解肽段由自動進樣器輸送到上樣柱(2cm，id100μm，3μm，c18)，之後再經過分析柱(15cm，id150μm，1.9μm，c18)進行分離，流速為600nl/min。相關液相梯度如下：75min梯度:0-5min，液線性梯度從4-20％；5-65min，b液線性梯度從20-50％；66-75min，b液維持在100％。肽段樣品經分析色譜柱分離，並通過hplc肽段分離圖證明肽段分離效果良好且豐度良好，後用q exactive hf-x質譜儀進行質譜檢測。檢測方式為正離子模式，母離子掃描範圍300-1400m/z，一級質譜解析度為120,000at 200m/z，agc(automatic gain control)target為3e6，maximum it為30ms，動態排除時間(dynamic exclusion)為12.0s。多肽和多肽碎片的質荷比按照下列方法採集：每次全掃描(full scan)後採集60個碎片圖譜(ms2 scan)，使用hcd碎裂模式，normalized collision energy為27％，isolation window為1.6m/z，二級質譜解析度7,500at 200m/z。
82.質譜分析採集的原始數據(raw文件)，通過thermo proteome discoverer軟體進行資料庫檢索，最終獲得蛋白質樣品的鑑定信息。其中搜庫參數設定如下：enzyme為trypsin；missed cleavage sites設為2；非alk14添加樣品，動態修飾設定oxidation(m)和myr-(k)和myr-(g)(質量遷移210.356da；alk14添加樣品，動態修飾設定oxidation(m)和alk14-(k)和alk14-(g)(質量遷移234.377da)。資料庫檢索鑑定到的蛋白質必須通過設定的過濾參數fdr≤0.01。最終獲得豆蔻醯化修飾肽段質譜圖和賴氨酸豆蔻醯化修飾蛋白。
83.下面結合附圖和實施例對本發明的技術內容做進一步的說明。下述實施例是說明性的，不是限定性的，不能以下述實施例來限定本發明的保護範圍。下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規方法。下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，
均可從商業途徑得到。
84.實施例1：
85.大腸桿菌表達純化sirt6 h133y蛋白
86.(1)構建帶有his tag、flag tag雙標籤的sirt6 h133y的過表達質粒(pet28tev-sirt6h133y)：
87.以sirt6-flag為模板通過sirt6-f/r引物合成得到sirt6-flag片段，以pet28a質粒為模板通過pet28a-f/r引物擴增得到質粒片段，通過無縫克隆技術將sirt6-flag片段和質粒片段通過同源拼接得到表達質粒pet28tev-sirt6，其n端帶his tag，c端帶flag tag。以pet28tev-sirt6為模板通過引物h133y-f/r進行pcr定點突變，構建帶有his tag、flag tag雙標籤的sirt6 h133y的過表達質粒(pet28tev-sirt6h133y)。
88.其中，sirt6-flag片段的鹼基序列(seq id no.1)為：
89.atgagcgttaactatgcagcgggtctgagcccgtatgcagataaaggtaaatgtggtctgccggaaatttttgatccgccggaagaactggaacgtaaagtgtgggaactggcgcgtctggtttggcagagcagtagtgttgtttttcataccggtgcaggtattagcaccgcaagcggtattccggattttcgtggtccgcatggtgtatggaccatggaagaacgtggtctggcaccgaaatttgataccacctttgaatctgcacgcccgacacagacccatatggcactggttcagctggaacgcgttggtctgctgcgttttctggttagccagaatgttgatggcctgcatgtgcgtagcggctttccgcgtgataaactggcagaactgcatggtaatatgtttgttgaagaatgtgcaaaatgcaaaactcagtatgttcgtgataccgtggtgggtacgatgggtctgaaagcaaccggtcgtctgtgtacagttgcaaaagcacgtggtctgcgtgcctgtcgtggtgaactgcgcgataccattctggattgggaagatagcctgccggatcgcgatctggcactggcagatgaagcatctcgtaatgctgatctgagtattacactgggtacctctctgcagattcgtcctagcggcaacctgccgctggcaacaaaacgtcgtggtggtcgtctggttattgtgaatctgcagccgaccaaacatgatcgtcatgcagatctgcgtattcatggttatgttgatgaagttatgacccgtctgatgaaacatctgggtctggaaattcctgcttgggatggtccgcgtgttctggaacgtgcactgcctcctctgccgcgtcctcctaccccgaaactggaaccgaaagaagaaagtcctacgcgtattaatggtagcattccggcaggtccgaaacaggaaccttgtgcccagcataatggttctgaacctgcaagtcctaaacgcgaacgcccgaccagcccggcaccgcatcgtcctcctaaacgcgtgaaagcaaaagcagttccaagcgattataaagatgatgatgataaataa。
90.質粒構建使用引物：
91.pet28a-f:gcggccgctttcgaatctagagc(seq id no.3)；
92.pet28a-r:gaattccggatccatggcgccctg(seq id no.4)；
93.sirt6-f:gcgccatggatccggaattcatgagcgttaactatg(seq id no.5)；
94.sirt6-r:ctagattcgaaagcggccgcttatttatcatcatcatc(seq id no.6)；
95.h133y-f:cagaactgtatggtaatatgtttgttgaag(seq id no.7)；
96.h133y-r:catattaccatacagttctgccagtttatc(seq id no.8)。
97.(2)pet28tev-sirt6h133y轉化進大腸桿菌arcticexpress(ed3)，轉化子在2x yt培養基中(kanamycin 50μg/ml，gentamicin 40μg/ml)生長，od
600
達到0.8時，加入0.2mmol/l的iptg，16℃過夜誘導蛋白表達。
98.(3)收集細菌菌液，8000rpm離心5min，棄上清，加入1mmol/l的pmsf裂解液(20mmol/l tris-hcl，500mmol/l nacl，2％glycerol，ph值為7.2)懸浮，用高壓破碎儀進行細胞破碎，12000rpm離心30min，取上清裝入鎳離子交換柱(ge healthcare)，根據
fplc
tm
system進行純化。加入10柱體積的wash buffer(20mmol/ltris-hcl，500mmol/l nacl，2％glycerol和20mmol/l imidazole，ph值為7.2)洗滌，用elution buffer(20mmol/l tris-hcl，500mmol/l nacl，2％glycerol和500mmol/l imidazole，ph值為7.2)洗脫蛋白。sds-page電泳結果確認sirt6 h133y蛋白表達純化成功(圖2)。用透析buffer(50mmol/l tris-hcl，250mmol/l nacl and 10％glycerol，ph值為7.2)進行蛋白透析，去除咪唑，得到的蛋白保存於-80℃。
99.其中，sirt6 h133y蛋白的胺基酸序列(seq id no.2)(下換線突出為h133y突變位點)：mssyyhhhhhhdydipttenlyfqgamdpefmsvnyaaglspyadkgkcglpeifdppeelerkvwelarlvwqsssvvfhtgagistasgipdfrgphgvwtmeerglapkfdttfesarptqthmalvqlervgllrflvsqnvdglhvrsgfprdklaelygnmfveecakcktqyvrdtvvgtmglkatgrlctvakarglracrgelrdtildwedslpdrdlaladeasrnadlsitlgtslqirpsgnlplatkrrggrlvivnlqptkhdrhadlrihgyvdevmtrlmkhlgleipawdgprvleralpplprpptpklepkeesptringsipagpkqepcaqhngsepaspkrerptspaphrppkrvkakavpsdykddddk。
100.實施例2：
101.sirt6敲低293t細胞株構建
102.用sirt6 shrna病毒轉染293t細胞，同時加入polybrene增加感染效率，轉染6h後換液(使用高糖dmem培養基)。轉染48h後用puromycin進行陽性篩選，得到穩定表達sirt6 shrna的細胞株。western blotting結果證明293t sirt6敲低效率良好(圖3)。
103.實施例3：
104.細胞培養及樣品處理
105.(1)sirt6敲低的293t細胞，用含有10％fbs的高糖dmem培養基培養，待細胞匯合率達80％左右後，換低糖(1g/ml)的dmem培養，其中加入etomoxir(cpt1a抑制劑，中國aladdin公司)50μmol/l，1％的化學成分明確的脂質濃縮液，培養12h後收樣，western blotting結果證明上述培養方法能夠提高豆蔻醯化修飾豐度(圖4)。細胞還可以通過培養基添加10μg/ml alk14(豆蔻酸類似物)，培養12h後收樣。
106.(2)細胞樣品加入8mol/l的ua裂解液，冰上超聲裂解(100w，工作10s，間歇10s，循環10次)，14000rpm離心30min後取上清得到蛋白裂解液測量濃度。取樣品蛋白質20μg，加入5x上樣緩衝液，沸水浴5min，進行12.5％sds-page電泳(120v，75min)，考馬斯亮藍染色證明蛋白質提取質量良好(圖5)。取2mg蛋白樣品加入10mmol/l的dtt在37℃孵育2h以破壞蛋白質二硫鍵，後冷卻至室溫，加入iaa至終濃度50mmol/l，避光孵育30min用來修飾蛋白質sh基團。加入5倍體積水，將ua裂解液濃度稀釋至1.5mol/l，按照50：1比例加入trypsin，37℃酶切18h左右。通過spe c18柱脫鹽，凍幹，得到酶解肽段，存放於-80℃備用。
107.實施例4：
108.豆蔻醯化修飾肽段富集
109.(1)酶解肽段(1mg)復溶於400μl預冷myr-ip緩衝液中，隨後加入80μl的sirt6 h133y蛋白(1mg/ml)和20μl乙腈，混勻，30℃反應4h，使sirt6結合修飾肽段；
110.(2)取50μl的anti-flag磁珠於1.5ml的ep管中，加入500μl的myr-ip緩衝液洗滌，混勻後將ep管放在磁力架上分離磁珠和液體，棄去液體，洗滌3次；
111.(3)將步驟(1)中的反應液與預處理好的anti-flag磁珠混勻進行富集反應，4℃孵
育18h；
112.(4)將上述反應液從4℃取出，放在磁力架上分離，棄去液體；
113.(5)加入500μl的myr-ip緩衝液洗滌，混勻後將ep管放在磁力架上分離磁珠和液體，棄去液體，重複洗滌3次；
114.(6)加入150μl洗脫緩衝液混勻，室溫搖床孵育15min，放在磁力架上，將液體轉入乾淨的1.5ml的ep管中，洗脫3次，混合；
115.(7)在洗脫產物中加入4％的tfa，37℃孵育10min後，12000rpm離心15min沉澱sirt6蛋白，上清保留，可以直接作為質譜樣品進行質譜鑑定或冷凍乾燥保存。如果是凍幹肽段用0.1％甲酸20％乙腈水溶液復溶作為質譜樣品；
116.(8)真空乾燥上清液，濃縮肽段。
117.myr-ip緩衝液：1x pbs(不含ca
2+
、mg
2+
，ph 7.4)，0.2％tween-20，20％乙腈。洗脫緩衝液：0.2mol/l甘氨酸，20％乙腈，ph值為2.2。
118.實施例5：
119.質譜鑑定
120.樣品採用納升流速的高效液相系統easy-nlc 1200進行分離。流動相a為0.1％甲酸水溶液，流動相b為0.1％甲酸乙腈水溶液(乙腈為80％)。首先色譜柱以100％的流動相a進行平衡，隨後樣品的酶解肽段由自動進樣器輸送到上樣柱(2cm，id100μm，3μm，c18)，之後再經過分析柱(15cm，id150μm，1.9μm，c18)進行分離，流速為600nl/min。肽段樣品經分析色譜柱分離，hplc肽段分離圖說明肽段分離效果良好且豐度良好(圖6)，後用q exactive hf-x質譜儀進行檢測。檢測方式為正離子模式，母離子掃描為700m/z，一級質譜解析度為120,000at 200m/z，agc(automatic gain control)target為3e6，maximum it為30ms，動態排除時間(dynamic exclusion)為12.0s。多肽和多肽碎片的質荷比按照下列方法採集：每次全掃描(full scan)後採集60個碎片圖譜(ms2 scan)，使用hcd碎裂模式，normalized collision energy為27％，isolation window為1.6m/z，二級質譜解析度7,500at 200m/z。
121.質譜分析採集的原始數據(raw文件)，通過thermo proteome discoverer軟體進行資料庫檢索，最終獲得蛋白質樣品的鑑定信息。其中搜庫參數設定如下：enzyme為trypsin；missed cleavage sites設為2；非alk14添加樣品，動態修飾設定oxidation(m)和myr-(k)和myr-(g)(質量遷移210.356da)；alk14添加樣品，動態修飾設定oxidation(m)和alk14-(k)和alk14-(g)(質量遷移234.377da)。質譜數據分析後得到賴氨酸豆蔻醯化修飾靶蛋白及其修飾位點，dux4l3和glis2為鑑定得到修飾蛋白中2個豆蔻醯化修飾蛋白(圖7)。
122.上述對實施例的描述是為了便於該技術領域的普通技術人員能理解和使用本發明。熟悉本領域技術人員顯然可以容易的對這些實施例做出各種修改，並把在此說明的一般原理應用到其他實施例中，而不必經過創造性的勞動。因此，本發明不限於上述實施例。本領域技術人員根據本發明的原理，不脫離本發明的範疇所做出的改進和修改都應該在本發明的保護範圍之內。
123.124.125.126.127.128.129.