GLP-1或其類似物與抗體Fc片段融合蛋白的製備方法

2023-06-20 21:20:21

GLP-1或其類似物與抗體Fc片段融合蛋白的製備方法
【專利摘要】本發明涉及生物【技術領域】，特別是涉及一種GLP-1或其類似物與抗體Fc片段融合蛋白的製備方法。本發明提供一種GLP-1或其類似物與抗體Fc片段融合蛋白的製備方法，包括如下步驟：將GLP-1或其類似物與抗體Fc片段融合蛋白編碼序列克隆至表達載體中；將表達載體轉染CHO-DXB11細胞，培養並篩選出陽性細胞株；將所得細胞表達、純化後，即得所述融合蛋白。本發明所提供的製備方法在CHO細胞系DXB11中表達GLP-1-Fc分子，不會產生降解問題，後續的純化得率大大提高，生物學活性並未減弱，非常適合工藝業化生產需求。
【專利說明】GLP-1或其類似物與抗體Fe片段融合蛋白的製備方法

【技術領域】
[0001] 本發明涉及生物【技術領域】，特別是涉及一種GLP-I或其類似物與抗體Fe片段融合 蛋白的製備方法。

【背景技術】
[0002] 胰高血糖素樣肽-I(GLP-I)可促進胰島素釋放，降低血漿中的胰高血糖素水平， 降低胃排空的速率，促進飽食感並刺激胰島的生物合成和β細胞的增殖，可用於2型糖尿 病的治療。在我國2型糖尿病發病廣泛，如果不及時加以治療，容易轉變成1型糖尿病，給 患者和國家造成很大負擔。因此，開發這類藥物的需求極為迫切。目前美國禮來公司的艾 塞那肽（百泌達）和丹麥諾和諾德製藥公司的利拉魯肽（諾和力）已經在我國獲得進口注 冊，兩種藥物都具有降血糖和減輕體重的作用，但需要每天1-2次皮下注射給藥。
[0003] 為了增加的體內半衰期，使GLP-I長效化從而減少單位時間給藥次數已經成為國 內外研究的熱點。目前研究的GLP-I及類似物長效化的方法主要有以下三種方式：（I)PEG 化長效，代表為Nove Nordisk公司（丹麥諾和諾德公司）研發的每周一次皮下注射的長效 GLP-I類似物索瑪魯肽；（2)GLP-1與白蛋白融合蛋白，代表為專利CN10665538A ; (3)GLP-1 與抗體的Fe片段融合蛋白，代表為專利CN1802386B。禮來公司的GLP-I-Fc (LY2189265)目 前正在美國三期臨床階段，根據臨床實驗的數據報導，LY2189265能夠有效增加 GLP-I的半 衰期，實現每周給藥一次，提高了患者治療的依從性。
[0004] 重組人胰高血糖素樣肽-I(GLP-I)類似物與具有延長人體內半衰期作用的抗體 Fe片段組成的融合蛋白（簡稱GLP-I-Fc)，國外製藥公司將該融合蛋白應用於人體臨床實 驗能夠有效的治療2型糖尿病的同時降低體重。
[0005] 隨著抗體技術的發展，許多上市的抗體類藥物都是在CHO-S或CHO-Kl細胞為原 始細胞的基礎上構建工程細胞，工業生產中採用高密度細胞培養的方法實現抗體目標蛋白 在最終細胞培養液中的高表達。由於抗體分子有分子結構穩定的特點，高密度細胞培養過 程中由於部分工程細胞凋亡而釋放出的蛋白酶對抗體目標蛋白影響很小。由於GLP-I-Fc 融合蛋白存在抗體Fe片段作為分子的組成部分，其分子具有一些抗體的特性，很多人認為 CHO-S或CHO-Kl細胞為原始細胞的基礎上構建工程細胞也應當是最方便和合理的選擇。但 是，在此【技術領域】的一些信息得到，該融合蛋白在細胞表達階段會出現不同程度的降解，所 降解的GLP-I-Fc在後續分離純化製備中很難去除，不但影響到產品的生物學活性也會嚴 重影響產品製備的得率，其原因在於GLP-I-Fc融合蛋白中N端最關鍵的GLP-I部分的31個 胺基酸很不穩定，容易被細胞凋亡裂解後釋放的蛋白酶的水解作用而降解。Qiao-Zhen Lu 等人在文獻Characterization of the Proteases Involved in the N-Terminal Clipping of Glucagon-Like-Peptide-l-Antibody Fusion Proteins 中提到，GLP-l-Fc 在 CHO-S 細 胞系中表達最多會出現超過50%的不完整形態，即降解條帶。由於在細胞發酵過程中產生 的N-端出現降解的GLP-I-Fc融合蛋白必須在最終藥品的製造過程中有效去除，導致合格 終產品的得率在10% -50%之間。
[0006] 在同一篇文章中提到細胞培養過程中添加蛋白酶抑制劑（鹽酸苯甲脒）控制 降解，但對產品的成藥還是增加了風險，在後續的工藝中要對蛋白酶抑制劑進行滅活及 根除也會使得整個產品的製備工藝更加複雜和不經濟，而且添加蛋白酶抑制劑只能降低 GLP-I-Fc分子N-端降解的程度，不能有效抑制其發生，不能真正解決降解問題。另一種去 除GLP-I-Fc分子N-端降解產物的方法是使用多種色譜柱層析進行多步驟的純化，雖然也 能得到非常純的GLP-I-Fc融合蛋白，但是全過程的產率大大下降至20%以下，大大低於治 療性抗體藥物大於70%的得率水平。


【發明內容】

[0007] 鑑於以上所述現有技術的缺點，本發明的目的在於提供一種GLP-I或其類似物與 抗體Fc片段融合蛋白的製備方法，用於解決現有技術中的問題。本發明發明人將GLP-I-Fc 表達質粒DNA導入不同的哺乳動物細胞系中，驚奇的發現在CHO細胞系DXBll中所表達的 GLP-I-Fc融合蛋白無降解出現，以至於合格終產品的得率大於70%。
[0008] 為實現上述目的及其他相關目的，本發明第一方面提供一種GLP-I或其類似物與 抗體Fc片段融合蛋白的製備方法，包括如下步驟：
[0009] 1)將GLP-I或其類似物與抗體Fc片段融合蛋白（GLP-I-Fc)編碼序列克隆至表達 載體中；
[0010] 2)將表達載體轉染CHO-DXBl 1細胞，培養並篩選出陽性細胞株；
[0011] 3)使用步驟2所得細胞表達、純化後，即得所述融合蛋白。
[0012] 優選的，所述GLP-I或其類似物與抗體Fc片段融合蛋白由重組人胰高血糖素樣 肽-I (GLP-I)或其類似物通過連接肽與具有延長人體內半衰期作用的抗體Fc片段連接形 成。
[0013] 更優選的，所述GLP-I或其類似物的胺基酸序列與SEQ ID No. 14 (GLP-1原型序 列）具有80%以上的同源性，更優選的，具有90%以上的同源性，進一步優選為具有97%以 上的同源性。
[0014] 更優選的，所述GLP-I或其類似物的具體序列如SEQ ID No. 14、SEQ ID No :1或 SEQ ID No : 2 所示。
[0015] 更優選的，所述連接肽的胺基酸數量為> 2個，所述連接肽由甘氨酸（Gly)和絲氨 酸（Ser)組合而成。
[0016] 更優選的，所述連接肽的胺基酸數量為6-36個。
[0017] 更優選的，所述連接肽的胺基酸數量為14-36個。
[0018] 更優選的，所述連接肽的胺基酸序列如SEQ ID No :3_8所示。
[0019] 進一步優選的，所述連接肽的胺基酸序列如SEQ ID No : 7所示。
[0020] 更優選的，所述抗體Fc片段為本領域的不具ADCC效應子功能的非裂解性Fc。
[0021] 進一步優選的，所述抗體Fe片段的胺基酸序列如SEQ ID No :9所示。
[0022] 在本發明的優選實施例中，所述GLP-I或其類似物與抗體Fe片段融合蛋白的氨基 酸序列如SEQ ID No: 10和SEQ ID No: 11所示；所述GLP-I或其類似物與抗體Fe片段融 合蛋白編碼序列如SEQ ID No : 12和SEQ ID No : 13所示。
[0023] 優選的，所述表達載體選自DHFR系統的表達載體和/或GS系統的表達載體。
[0024] 進一步優選的，所述DHFR系統的表達載體選自pIRES-DHFR，所述GS系統的表達載 體選自peel2. 4。
[0025] 優選的，所述將GLP-I或其類似物與抗體Fe片段融合蛋白（GLP-I-Fc)編碼序列 克隆至表達載體中的方法具體為：在GLP-I或其類似物與抗體Fc片段融合蛋白編碼序列的 兩端設計與載體的多克隆位點所對應的酶切位點，再將編碼序列與載體上所對應的酶切位 點連接，實現目標蛋白編碼DNA片段與表達載體的連接。
[0026] 進一步優選的，所述將GLP-I或其類似物與抗體Fc片段融合蛋白（GLP-I-Fc) 編碼序列克隆至表達載體中的方法具體為：將GLP-I-Fc融合蛋白的編碼序列兩端設計了 NheI和MluI兩個酶切位點，分別與表達載體上的NheI和MluI酶切位點連接，實現目標蛋 白編碼DNA片段與表達載體的連接。
[0027] 優選的，所述將表達載體轉染CH0-DXB11細胞，培養並篩選出陽性細胞株的方法 具體為：使用DNA轉染試劑將質粒DNA轉染CHO-DXBl 1細胞，傳代培養後通過測定融合蛋白 的表達量，從而篩選出陽性細胞形成細胞株。
[0028] 進一步優選的，所述測定融合蛋白的表達量的具體方法為：針對GLPl的點印跡、 針對GLPl的western blotting免疫印跡法和針對Fc片段的Elisa方法進行檢測中的一 種或多種的組合，從而測定融合蛋白的表達量。
[0029] 優選的，所述細胞表達的方法為適用於CH0-DXB11細胞的細胞表達方法。
[0030] 更優選的，所述細胞表達的方法具體為：將篩選出的陽性細胞株進行無血清馴化， 然後接種至搖瓶中搖床培養，將所得培養液離心取上清液進行蛋白純化。
[0031] 更有選的，所述搖床培養的步驟優選為：溫度36. 5-37. 5°C，4. 8-5. 2%的CO2環境 中搖床培養至密度達到3. 5-4. 5*106,將溫度降低至31. 5-32. 5°C，每天補充養料，5-6天後 細胞活率降低至80-85%停止培養。
[0032] 更有選的，所述將所得培養液離心取上清液進行蛋白純化的步驟優選為，將所得 培養液1000-3000RCF離心取出細胞後，再4000-6000RCF離心取上清進行蛋白純化。
[0033] 優選的，所述純化的具體為通過膜過濾、親和層析柱和凝膠過濾層析進行純化。
[0034] 本發明第二方面提供CH0-DXB11細胞株在GLP-I蛋白製備領域的用途。
[0035] 優選的，所述用途具體為在GLP-I-Fc融合蛋白製備領域的用途。
[0036] 本發明第三方面提供一種融合蛋白，由所述GLP-I或其類似物與抗體Fc片段融合 蛋白的製備方法製備獲得。
[0037] 本發明第四方面提供一種藥物組合物，包括有效劑量的所述GLP-I或其類似物與 抗體Fc片段融合蛋白。
[0038] 優選的，所述組合物還可包括本領域的載體、稀釋劑、賦形劑、穩定劑、增稠劑等， 並可被製備成如片劑、膠囊、粉末、糖漿、溶液或懸浮液等各種本領域技術人員所熟知的藥 劑類型。
[0039] 本發明第五方面提供一種重組的CH0-DXB11宿主細胞，所述宿主細胞含有GLP-I 或其類似物與抗體Fc片段融合蛋白的表達載體，所述表達載體具體為包含GLP-I或其類似 物與抗體Fc片段融合蛋白編碼序列的表達載體。
[0040] 本發明發明人針對目前GLP-I融合蛋白，特別是與抗體Fc片段相融合的GLP-I-Fc 分子在動物細胞中的表達普遍會出現被蛋白酶作用而發生降解的情況（降解片段的出現 勢必會給下遊的分離純化帶來很大的影響，降低產品的質量和製備的得率，通過添加蛋白 酶抑制劑可以部分抑制，但不能完全解決GLP-I-Fc分子在細胞培養過程中發生降解的問 題；添加的蛋白酶抑制劑需要在後續純化過程中有效去除，增加了純化的難度），提供一種 GLP-I或其類似物與抗體Fc片段融合蛋白的製備方法。本發明所提供的製備方法在CHO細 胞系DXBll中表達GLP-I-Fc分子，不會產生降解問題，後續的純化得率大大提高，生物學活 性並未減弱，非常適合工藝業化生產需求。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0041] 圖1顯示為本發明工藝流程圖。

【具體實施方式】
[0042] 本發明發明人將GLP-I-Fc表達質粒DNA導入不同的哺乳動物細胞系中，驚奇的發 現在CHO細胞系DXBll中所表達的GLP-I-Fc融合蛋白無降解出現，以至於合格終產品的得 率大於70 %，在此基礎上完成了本發明。
[0043] 本發明提供一種GLP-I或其類似物與抗體Fc片段融合蛋白的製備方法，包括如下 步驟：
[0044] 1)將GLP-I或其類似物與抗體Fc片段融合蛋白（GLP-I-Fc)編碼序列克隆至表達 載體中；
[0045] 2)將表達載體轉染CHO-DXBl 1細胞，培養並篩選出陽性細胞株；
[0046] 3)使用步驟2所得細胞表達、純化後，即得所述融合蛋白。
[0047] 本發明所提供的GLP-I或其類似物與抗體Fc片段融合蛋白的製備方法中，GLP-I 或其類似物與抗體Fc片段融合蛋白由重組人胰高血糖素樣肽-I (GLP-I)或其類似物通過 連接肽與具有延長人體內半衰期作用的抗體Fc片段連接形成。
[0048] 在GLP-I或其類似物與抗體Fc片段融合蛋白中，GLP-I的類似物可以是重組 GLP-I，GLP-I或其類似物的胺基酸序列與SEQ ID No. 14 (GLP-1原型序列）具有80%以上 的同源性，更優選的，具有90%以上的同源性，進一步優選為具有97%以上的同源性。對 於GLP-I類似物（如旨在提高GLP-I分子性能從而對GLP-I分子進行增加其生物學活性、 降低其免疫源性、等的任何修飾所獲得的GLP-I類似物）與抗體Fc片段融合蛋白而言，當 GLP-I或其類似物的胺基酸序列與原型GLP-I同源性> 80% (優選為> 90%，進一步優選 為> 97% )，都可以在DXB-Il原始細胞中獲得穩定的表達，而不用擔心蛋白酶的水解作用 而降解的問題，從而在增加生物學性能的同時還能保證很高的產率。具體來說，由於GLP-I 蛋白產物降解其主要原因來自於N端最關鍵的GLP-I部分的31個胺基酸很不穩定，容易被 細胞凋亡裂解後釋放的蛋白酶的水解作用而降解，所以當對原型GLP-I分子進行修飾後， 理論上只會使得GLP-I分子被降解的機率降低，其原因在於修飾後形成新的降解位點的幾 率是非常低的。具體如美國禮來公司的GLP-I-Fc產品Dulaglutide就通過分子修飾，使 GLP-I-Fc產品的穩定性有所提升的同時還不影響GLP-I的生物學活性。所以對於本領域技 術人員而言應當能夠理解的是，當本發明所提供的GLP-I-Fc融合蛋白的製備方法能夠穩 定表達具有GLP-I原型序列、及與原型序列具有97%以上的同源性序列（SEQ ID No :1)、具 有90%以上的同源性序列（SEQ ID No :2)的GLP-I-Fc時，該製備方法能夠穩定表達具有 相當或略低的同源性的其他GLP-I修飾片段的融合蛋白是可以預期的。
[0049] 在本發明一優選實施例中，所述GLP-I或其類似物的胺基酸序列如SEQ ID No. 14、 SEQ ID No. 1 或 SEQ ID No. 2 所示。
[0050] 在GLP-I或其類似物與抗體Fc片段融合蛋白中，連接肽可以是本領域的各種連接 肽，只要不對本發明的發明目的產生限制即可。優選的，所述連接肽由甘氨酸（Gly)和絲氨 酸（Ser)組合而成,所述連接肽並非Gly和Ser的任意組合,而是普遍採用以G4S(即氨基 酸序列GGGGS)為單位的多單位連接實現，此類連接肽的設計原則已經是本領域人員的公 知技術。具體可參見CN 102875683B，CN 102875683B，申請號201110193210. 3等現有技術。 連接肽的胺基酸數量為> 2個，更優選的為6-36個，進一步優選為14-36個。
[0051] 在本發明一優選實施例中，連接肽的胺基酸序列如SEQ ID No : 3-8所示。
[0052] 在本發明一最優實施例中，連接肽的胺基酸序列如SEQ ID No : 7所示。
[0053] 在GLP-I或其類似物與抗體Fc片段融合蛋白中，抗體Fc片段為本領域的不具 ADCC效應子功能的非裂解性Fc，只要不對本發明的發明目的產生限制即可。由於與GLP-I 或其變構體通過柔性連接肽相連的Fc片段來源於免疫球蛋白IgG的恆定區，它在消滅病 原體的免疫防禦中起重要作用。在四種人IgG亞型中，IgGl和IgG2, IgG3, IgG4均可以與 GLP-I或其變構體通過柔性連接肽結合。Fe融合主要是為了增加它的體內循環半衰期和 降低生產成本，而Fc介導的"抗體依賴細胞介導的細胞毒性作用"（antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity, ADCC)功能是不必要的，甚至可能產生有害副作用。為了 得到不具ADCC效應子功能的非裂解性Fc，本發明發明人對人的IgG4的Fc片段（P01861_ IGHG4)三個位點進行了修飾，第一個修飾是Fe胺基酸序列按照EU編號系統的S228P，此修 飾可以穩固鏈間二硫鍵的結構從而達到穩定二聚體結構的作用；第二個修飾是EU編號系 統的L235E，此修飾徹底消除Fc片段Fe R的結合，從而將ADCC降到最低。第三個修飾是 EU編號系統的L445P，這個修飾使IgG4的Fc的C端胺基酸序列與IgGl和IgG2的Fc的C 端胺基酸序列相同，從而增加 C端胺基酸序列的均一性。我們這個修飾後的Fc序列命名為 " IgG4 (S228P，L235E，L445P) "，其中IgG4後面括號中的胺基酸根據EU編號。
[0054] 在本發明一優選實施例中，抗體Fc片段的胺基酸序列如SEQ ID No :9所示。
[0055] 在本發明一優選實施例中，所述GLP-I或其類似物與抗體Fc片段融合蛋白的氨基 酸序列如SEQ ID No: 10和SEQ ID No: 11所示；所述GLP-I或其類似物與抗體Fc片段融 合蛋白編碼序列如SEQ ID No :12和SEQ ID No :13所示。
[0056] 本發明所提供的GLP-I或其類似物與抗體Fc片段融合蛋白的製備方法中，表達載 體可選自本領域適合CH0-DXB11細胞表達的載體系統，只要不對本發明的發明目的產生限 制即可。優選的，所述表達載體選自DHFR系統的表達載體和/或GS系統的表達載體。
[0057] 在本發明一優選實施例中，DHFR系統的表達載體如pIRES-DHFR，GS系統的表達載 體如 peel2. 4。
[0058] 本發明所提供的GLP-I或其類似物與抗體Fe片段融合蛋白的製備方法中，將 GLP-I或其類似物與抗體Fc片段融合蛋白（GLP-I-Fc)編碼序列克隆至表達載體中的方法 只要不對本發明的發明目的產生限制即可。具體來說，可以在GLP-I或其類似物與抗體Fc 片段融合蛋白編碼序列的兩端設計與載體的多克隆位點所對應的酶切位點，再將編碼序列 與載體上所對應的酶切位點連接，實現目標蛋白編碼DNA片段與表達載體的連接。
[0059] 在本發明一優選實施例中，將GLP-I或其類似物與抗體Fe片段融合蛋白 (GLP-I-Fc)編碼序列克隆至表達載體中的方法具體為：將GLP-I-Fc融合蛋白的編碼序列 兩端設計了 NheI和MluI兩個酶切位點，分別與表達載體上的NheI和MluI酶切位點連接， 實現目標蛋白編碼DNA片段與表達載體的連接。
[0060] 本發明所提供的GLP-I或其類似物與抗體Fc片段融合蛋白的製備方法中，將表達 載體轉染CH0-DXB11細胞，培養並篩選出陽性細胞株的方法只要不對本發明的發明目的產 生限制即可。
[0061] 在本發明一優選實施例中，將表達載體轉染CHO-DXBl 1細胞，培養並篩選出陽性 細胞株的方法具體為：使用DNA轉染試劑將質粒DNA轉染CHO-DXBl 1細胞，傳代培養大約3 周后，通過測定融合蛋白的表達量，從而篩選出陽性細胞形成細胞株。
[0062] 所述通過測定融合蛋白的表達量具體方法為：通過針對GLPl的點印跡、western blotting免疫印跡法和針對Fe片段的Elisa方法進行檢測，從而測定融合蛋白的表達量。 此外，通過針對GLPl的western blotting免疫印跡法，亦證實了 GLPl蛋白的正確表達。
[0063] 本發明所提供的GLP-I或其類似物與抗體Fc片段融合蛋白的製備方法中，細胞 表達的方法只要不對本發明的發明目的產生限制即可，具體來說，可選用本領域適用於 CH0-DXB11細胞的細胞表達方法。優選的，所述細胞表達的方法具體為：將篩選出的陽性細 胞株進行無血清馴化，然後接種至搖瓶中搖床培養，將所得培養液離心取上清液進行蛋白 純化。
[0064] 所述搖床培養的步驟優選為：溫度36. 5-37. 5°C，4. 8-5. 2%的CO2環境中搖床培 養至密度達到3. 5-4. 5*106,將溫度降低至31. 5-32. 5°C，每天補充養料，5-6天後細胞活率 降低至80-85 %停止培養。
[0065] 所述將所得培養液離心取上清液進行蛋白純化的步驟優選為，將所得培養液 1000-3000RCF離心取出細胞後，再4000-6000RCF離心取上清進行蛋白純化。
[0066] 在本發明一優選實施例中，細胞表達的方法具體為：將篩選出的陽性細胞株進行 無血清馴化，以2*105密度傳代至IL搖瓶中，溫度37°C，5%的CO2環境中，120RPM搖床培養 至密度達到4*106,將溫度降低至32°C，每天補充葡萄糖、胺基酸等養料，5-6天後細胞活率 降低至80-85%停止培養；將細胞液2000RCF離心取出細胞後，再5000RCF離心取上清進行 蛋白純化。
[0067] 本發明所提供的GLP-I或其類似物與抗體Fc片段融合蛋白的製備方法中，對於 融合蛋白的純化方法並沒有具體限制，只要不對本發明的發明目的產生限制即可。融合 蛋白的純化方法已經是本領域的現有技術，融合蛋白的純化主要採用層析的方法純化，例 如使用陰離子交換層析或陽離子交換層析或採用凝膠過濾層析，或採用疏水層析，反相層 析，還可以使用羥基磷灰石吸附層析，金屬螯合層析等，本領域技術人員可對上述所有純 化步驟進行適當的選擇和組合，最終使蛋白純度達到基本均一。此外，利用含有所述融 合蛋白的特異性抗體、受體或配體的親和層析柱如重組的rProteinA, rProteinG天然的 nProteinA, nProteinG或改進的耐鹼型的MabSelectSure對表達的融合蛋白進行純化亦可 被用來純化所述融合蛋白。
[0068] 在本發明一優選實施例中，純化具體為通過膜過濾、親和層析柱和凝膠過濾層析 進行純化。
[0069] 本發明還提供所述CH0-DXB11細胞株在GLP-I蛋白製備領域的用途，所述用途 優選為在GLP-I-Fc融合蛋白製備領域的用途，具體為通過CHO-DXBl 1細胞株細胞株表達 GLP-I-Fc融合蛋白。
[0070] 所述GLP-I-Fc融合蛋白為GLP-I或其類似物與抗體Fc片段融合蛋白。
[0071] 所述GLP-I或其類似物的胺基酸序列與SEQ ID No. 14 (GLP-1原型序列）具有80 % 以上的同源性，更優選的，具有90%以上的同源性，進一步優選為具有97%以上的同源性。
[0072] 本發明還提供一種融合蛋白，由所述GLP-I或其類似物與抗體Fc片段融合蛋白的 製備方法製備獲得。
[0073] 本發明還提供一種藥物組合物，包括有效劑量的所述GLP-I或其類似物與抗體Fc 片段融合蛋白。所述組合物還可包括本領域技術人員常用的載體、稀釋劑、賦形劑、穩定劑、 增稠劑等，並可被製備成如片劑、膠囊、粉末、糖漿、溶液或懸浮液等各種本領域的藥劑類 型。
[0074] 本發明發明人針對目前GLP-I融合蛋白，特別是與抗體Fc片段相融合的GLP-I-Fc 分子在動物細胞中的表達普遍會出現被蛋白酶作用而發生降解的情況（降解片段的出現 勢必會給下遊的分離純化帶來很大的影響，降低產品的質量和製備的得率，通過添加蛋白 酶抑制劑可以部分抑制，但不能完全解決GLP-I-Fc分子在細胞培養過程中發生降解的問 題；添加的蛋白酶抑制劑需要在後續純化過程中有效去除，增加了純化的難度），提供一種 GLP-I或其類似物與抗體Fc片段融合蛋白的製備方法。本發明所提供的製備方法在CHO細 胞系DXB11中表達GLP-I-Fc分子，不會產生降解問題，後續的純化得率大大提高，生物學活 性並未減弱，非常適合工藝業化生產需求。
[0075] 本發明進一步提供一種重組的CHO-DXBl 1宿主細胞，所述宿主細胞含有GLP-I或 其類似物與抗體Fc片段融合蛋白的表達載體，所述表達載體具體為包含GLP-I或其類似物 與抗體Fc片段融合蛋白編碼序列的表達載體。
[0076] 以下通過特定的具體實例說明本發明的實施方式，本領域技術人員可由本說明書 所揭露的內容輕易地了解本發明的其他優點與功效。本發明還可以通過另外不同的具體實 施方式加以實施或應用，本說明書中的各項細節也可以基於不同觀點與應用，在沒有背離 本發明的精神下進行各種修飾或改變。
[0077] 在進一步描述本發明【具體實施方式】之前，應理解，本發明的保護範圍不局限於下 述特定的具體實施方案；還應當理解，本發明實施例中使用的術語是為了描述特定的具體 實施方案，而不是為了限制本發明的保護範圍；在本發明說明書和權利要求書中，除非文中 另外明確指出，單數形式"一個"、"一"和"這個"包括複數形式。
[0078] 當實施例給出數值範圍時，應理解，除非本發明另有說明，每個數值範圍的兩個端 點以及兩個端點之間任何一個數值均可選用。除非另外定義，本發明中使用的所有技術和 科學術語與本【技術領域】技術人員通常理解的意義相同。除實施例中使用的具體方法、設備、 材料外，根據本【技術領域】的技術人員對現有技術的掌握及本發明的記載，還可以使用與本 發明實施例中所述的方法、設備、材料相似或等同的現有技術的任何方法、設備和材料來實 現本發明。
[0079] 除非另外說明，本發明中所公開的實驗方法、檢測方法、製備方法均採用本技術 領域常規的分子生物學、生物化學、染色質結構和分析、分析化學、細胞培養、重組DNA技 術及相關領域的常規技術。這些技術在現有文獻中已有完善說明，具體可參見Sambrook 等 MOLECULAR CLONING :A LABORATORY MANUAL，Second edition，Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989and Third edition,2001 ;Ausubel 等，CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY,John ffiley&Sons,New York,1987and periodic updates ；the series METHODS IN ENZYMOLOGY,Academic Press,San Diego ；ffolffe,CHROMATIN STRUCTURE AND FUNCTION, Third edition, Academic Press, San Diego, 1998 ；METH0DS IN ENZYMOLOGY, Vol.304,Chromatin(P. M. Wassarman and A. P. ffolffe,eds.) ,Academic Press,San Diego, 1999 ;和 METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY, Vol. 119, Chromatin Protocols(P.B. Becker, ed. )Humana Press，Totowa，1999 等。
[0080] 實施例I
[0081] 重組人GLP-I-Fc融合蛋白的編碼序列
[0082] I. GLP-I的胺基酸構成
[0083] 天然的GLP-I及其任何改構的GLP-I分子均可通過不同的柔性連接肽與不同的Fc 片段，如IgGl，IgG2, IgG3, IgG4及改構的等連接形成融合蛋白，這些融合蛋白均有生物學 活性和長效性。
[0084] 天然的GLP-I的胺基酸序列如下：
[0085] HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGRG(SEQ ID No :14)。
[0086] 本發明的融合蛋白分子是在原形GLP-I分子基礎上進行過修飾的變異體，具體為 在原形GLP-I分子的31個胺基酸基礎上進行了兩種不同修飾的變異體，其名稱和分子結構 分別為：
[0087] 分子名稱：Gl (31個胺基酸的GLP-I分子中有1個胺基酸修飾）
[0088] 修飾：Gly8-GLP-1 (7-37)，原形GLP-I的第一個胺基酸編號為7 (第7位），則第8 位的胺基酸（實際對應為第二個胺基酸）更改為Gly。具體序列如SEQ ID No :1所示：
[0089] HGEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAffLVKGRG(SEQ ID No ：1)
[0090] 分子名稱：G3 (31個胺基酸的GLP-I分子中有3個胺基酸修飾）
[0091] 修飾：Gly8-Glu22-Gly36-GLP-1 (7-37)，原形 GLP-I 的第一個胺基酸編號為 7,則 第8, 22, 36位的胺基酸分別更改為Gly，Glu，Gly。具體序列如SEQ ID No :2所示：
[0092] HGEGTFTSDVSSYLEEQAAKEFIAffLVKGGG(SEQ ID No ：2)
[0093] 2.柔性連接肽序列
[0094] 此處連接肽胺基酸數目從2個到31個，主要為甘氨酸（Gly)和絲氨酸（Ser)相互 組合。
[0095] 含有6個胺基酸的柔性連接肽序列為GSGGGS (SEQ ID No :3)，命名為"L1" ；
[0096] 含有11個胺基酸的柔性連接肽序列為GSGGGSGGGGS(SEQ ID No :4)，命名為"L2"；
[0097] 含有16個胺基酸的柔性連接肽序列為GSGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID No :5)，命名為 "L3"；
[0098] 含有21個胺基酸的柔性連接肽序列為GSGGGSGGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID No :6)， 命名為"L4"；
[0099] 含有26個胺基酸的柔性連接肽序列為GSGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID No : 7)，命名為"1^5"；
[0100] 含有31個胺基酸的柔性連接肽序列為GSGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID No :8)，命名為 "L6"。
[0101] 柔性連接肽L5為優選方案。實驗表明用此柔性連接肽表達的GLP-I-Fc檢測生物 學活性最高。
[0102] 3.IgG4 的 Fc 片段
[0103] 對人的IgG4的Fc片段（P01861_IGHG4)三個位點進行了修飾，第一個修飾是Fc 胺基酸序列按照EU編號系統的S228P，第二個修飾是EU編號系統的L235E，第三個修飾是 EU編號系統的L445P。我們這個修飾後的Fc序列命名為"IgG4(S228P，L235E，L445P)"，具 體序列如SEQ ID No :9所示：
[0104] SKYGPPCPPCPAPEFEGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAK TKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSL TCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLS LSPGK(SEQ ID No ：9)
[0105] 4.兩種融合蛋白的胺基酸序列
[0106] 兩種不同的GLP-I變構體序列與柔性連接肽和IgG4_Fc所形成的兩種蛋白胺基酸 序列分別為：
[0107] 命名：G1-L5-FC ;
[0108] 結構：Gl-L5-IgG4(S228P，L235E，L445P)，具體序列如 SEQ ID No :10 所示：
[0109] HGEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGRGGSGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSSKYGPPCPPCPA PEFEGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTV LHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNG QPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID No ：10)
[0110] 命名：G3-L5-FC ;
[0111] 結構：G3-L5-IgG4 (S228P，L235E，L445P)，具體序列如 SEQ ID No : 11 所示：
[0112] HGEGTFTSDVSSYLEEQAAKEFIAWLVKGGGGSGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSSKYGPPCPPCPA PEFEGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTV LHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNG QPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID No ：11)
[0113] 實施例2
[0114] 在CH0-DXB11和CH0-DG44細胞中表達GLP-I-Fc融合蛋白：
[0115] 將兩種不同的GLP-I變構體序列與柔性連接肽和IgG4_Fc所形成的兩種蛋白 (G1-L5-FC 和 G3-L5-FC)編碼序列 SEQ ID No :12 和 SEQ ID No :13 克隆至含有 IRES-DHFR 的表達載體序列中，表達載體在CMV啟動子的驅動下表達GLP-I-Fc。
[0116] G1-L5-FC的編碼序列如SEQ ID No :12所示：（含19aa的信號肽）
[0117] atggagtggtcctgggtgttcctgttctttctgtccgtgaccacaggagtccacagccatggtgaaggg acctttaccagtgatgtaagttcttatttggaaggacaagctgccaaggagttcattgcttggctggtgaaaggccg tggaggatccggtggcggttccggcggtggaggatcaggaggcggtggctctggaggtggtggaagtggtggcggcg gttcgtctaagtacgggcccccttgccctccttgcccagctcctgaatttgagggcggacccagcgtgttcctgttc cccccaaagcccaaggacaccctgatgatcagcagaacccccgaagtgacctgcgtggtggtggacgtgtcccagga agatcccgaggtgcagttcaattggtacgtggacggcgtggaagtgcacaacgccaagaccaagcccagagaggaac agttcaacagcacctacagagtggtgtccgtgctgaccgtgctgcaccaggattggctgaacggcaaagagtacaag tgcaaggtgtccaacaagggcctgcccagcagcatcgaaaagaccatcagcaaggccaagggccagcctcgcgagcc ccaggtgtacacactgcctccaagccaggaagagatgaccaagaaccaggtgtccctgacctgtctcgtgaagggct tctacccctccgacatcgccgtggaatgggagagcaacggccagcccgagaacaactacaagaccaccccccctgtg ctggacagcgacggctcattcttcctgtacagcagactgaccgtggacaagagcagatggcaggaaggcaacgtgtt cagetgcagcgtgatgcacgaggccctgcacaaccactacacccagaagtccctgagcctgagccccggcaaa(SEQ ID No ：12)
[0118] G3-L5~Fc 的編碼序列如 SEQ ID No : 13 所不：
[0119] atggagtggtcctgggtgttcctgttctttctgtccgtgaccacaggagtccacagccatggtgaaggg acctttaccagtgatgtaagttcttatttggaagagcaagctgccaaggagttcattgcttggctggtgaaaggcgg tggaggatccggtggcggttccggcggtggaggatcaggaggcggtggctctggaggtggtggaagtggtggcggcg gttcgtctaagtacgggcccccttgccctccttgcccagctcctgaatttgagggcggacccagcgtgttcctgttc cccccaaagcccaaggacaccctgatgatcagcagaacccccgaagtgacctgcgtggtggtggacgtgtcccagga agatcccgaggtgcagttcaattggtacgtggacggcgtggaagtgcacaacgccaagaccaagcccagagaggaac agttcaacagcacctacagagtggtgtccgtgctgaccgtgctgcaccaggattggctgaacggcaaagagtacaag tgcaaggtgtccaacaagggcctgcccagcagcatcgaaaagaccatcagcaaggccaagggccagcctcgcgagcc ccaggtgtacacactgcctccaagccaggaagagatgaccaagaaccaggtgtccctgacctgtctcgtgaagggct tctacccctccgacatcgccgtggaatgggagagcaacggccagcccgagaacaactacaagaccaccccccctgtg ctggacagcgacggctcattcttcctgtacagcagactgaccgtggacaagagcagatggcaggaaggcaacgtgtt cagetgcagcgtgatgcacgaggccctgcacaaccactacacccagaagtccctgagcctgagccccggcaaa (SEQ ID No ：13)
[0120] 將GLP-I-Fc融合蛋白的編碼序列（SEQ ID No :12和SEQ ID No :13)兩端設計了 NheI和MluI兩個酶切位點，分別與表達載體上的NheI和MluI酶切位點連接，實現目標蛋 白編碼DNA片段與表達載體的連接，獲得質粒DNA。
[0121] 轉染CH0-DXB11和CH0-DG44細胞在6孔板進行，CH0-DXB11空白細胞以1 :10傳 代至6孔板內，用含10%胎牛血清（FBS)和1XHT(HT Supplement，HT培養基添加劑，gibco 公司產品）的DMEM培養基進行培養。當細胞融合率達到90%時進行轉染試驗。首先移除 細胞培養液，向每個孔裡加 2毫升新鮮10% FBS+1X HT的DMEM培養液。14微克質粒DNA 稀釋至150微升DMEM培養基，12微升Lipofectamine試劑稀釋至150微升DMEM培養基， 將DNA和Lipofectamine試劑混合後室溫靜置20分鐘，然後均勻加入6孔板的細胞培養液 中，然後放入37度細胞培養箱進行培養，每孔加入量為300微升。6小時後移除培養液，換 成2毫升新鮮FBS+HT培養基。24小時後，用胰酶消化細胞後用新鮮FBS+HT培養基懸浮， 以1 :5稀釋到兩個T25方瓶中繼續培養。培養24小時後用無 HT的10% FBS的DMEM培養 基繼續培養，每2-3天進行一次換液，大約3周後陽性細胞形成細胞株，此時進行針對Fc片 段的ELISA檢測。ELISA檢測具體方法為：用0. 05M PH9碳酸鹽包被緩衝液將抗人的IgG 抗體稀釋至抗體濃度為1?10 μ g/ml (抗體採購Sigma公司，貨號18885);每個96孔板的 反應孔中加〇. lml，4°C過夜；次日，棄去孔內溶液，用洗滌緩衝液PBST洗3次，每次3分鐘 (簡稱洗滌，下同）；加一定稀釋的待檢樣品〇. Iml於上述已包被之反應孔中，置37°C孵育 1小時，然後洗滌；洗滌後於各反應孔中加入臨時配製的TMB底物溶液（採購於康為世紀公 司）0. lml，37°C 10?30分鐘，最後於各反應孔中加入2M硫酸0. 05ml終止反應，酶標儀讀 數OD 450nm的值（取OD值>0. 15繼續傳代）。同時用稀釋法將細胞傳代到96孔板中，2-3 周后，單克隆可以從96板中挑選出來，傳代到T25中加壓培養。首先用含有IOOnM的MTX的 10% FBS的DMEM培養液加壓培養，大約2周細胞適應IOOnM的MTX後，細胞凍存，然後繼續 以250nM，500nM，IOOOnM的MTX壓力繼續培養，同時用點印跡，WB (western blotting)和針 對Fe片段的Elisa方法進行篩選。點印記和WB的一抗選用抗GLPl的單抗（Sigma採購）， 二抗選用帶有辣根過氧化氫酶標記的山羊抗小鼠單抗（碧雲天公司採購），針對Fc片段的 Elisa方法與上文相同，具體實驗步驟和方法亦可參考分子克隆實驗指南，最終挑選出3-6 株細胞進行無血清馴化。
[0122] 表達不同GLP-I-Fc融合蛋白的細胞株能夠適應在無血清培養基中懸浮培養後， 以2*IO 5密度傳代至IL搖瓶中，溫度37C，5 %的CO2環境中，120RPM搖床培養至密度達 到4*106,將溫度降低至32C，每天補充葡萄糖、胺基酸等養料，5-6天後細胞活率降低至 80-85%停止培養。將細胞液20001^^離心取出細胞後，再50001^^離心取上清進行蛋白純 化。
[0123] 實施例3
[0124] 在CHO-S和CHO-Kl細胞中表達GLP-I-Fc融合蛋白：
[0125] 將兩種不同的GLP-I變構體序列與柔性連接肽和IgG4_Fc所形成的兩種蛋白 (G1-L5-FC和G3-L5-FC)編碼序列SEQ ID No:12和SEQ ID No:13克隆至含有穀氨醯胺合成 酶的GS表達系統的peel2. 4表達載體中，表達載體在CMV啟動子的驅動下表達GLP-1-Fc。
[0126] 克隆方法與實施例2相同，S卩，GLP-I-Fc融合蛋白的編碼序列兩端設計了 NheI和 MluI兩個酶切位點，分別與表達載體上的NheI和MluI酶切位點連接，實現目標蛋白編碼 DNA片段與表達載體的連接。
[0127] CHO-S與CHO-Kl用含有10%胎牛血清的DMEM的培養基培養，轉染前1日對細胞 進行消化後懸浮計數，將細胞稀釋至1*1〇 5個/ml，轉移至6孔板，培養至第2天匯合度達到 60%，進行轉染。A液：分別用無血清DMEM250微升，稀釋1，2,4微克質粒DNA ;B液：使用無 血清的DMEM250微升，加入Lipofectamine2000試劑10微升，室溫放置5分鐘。將A液與 B液混合，室溫放置20分鐘後，加入6孔板中，放入培養箱進行培養。6小時後棄去培養液， 添加2毫升新鮮10%胎牛血清的DMEM培養液。繼續培養48小時後，消化懸浮孔內細胞，使 用含有G418 (800微克每毫升）的DMEM完全培養基懸浮後移至培養皿中培養，每三天換液 一次。大約3周後陽性細胞形成細胞株，此時進行針對Fc片段的Elisa檢測（具體方法同 實施例2)，同時用稀釋法將細胞傳代到96孔板中，2-3周後，單克隆可以從96板中挑選出 來，傳代到12孔板中繼續培養，檢測細胞培養液中Fc的含量（具體方法同實施例2)，從而 挑選出高表達的細胞株，最終挑選出3-6株細胞進行無血清馴化。
[0128] 表達不同GLP-I-Fc融合蛋白的細胞株能夠適應在無血清培養基中懸浮培養後， 以2*IO 5密度傳代至IL搖瓶中，溫度37C，5 %的CO2環境中，120RPM搖床培養至密度達 到4*106,將溫度降低至32C，每天補充葡萄糖、胺基酸等養料，5-6天後細胞活率降低至 80-85%停止培養。將細胞液20001^^離心取出細胞後，再50001^^離心取上清進行蛋白純 化。
[0129] 實施例4
[0130] GLP-I-Fc融合蛋白的分離純化：
[0131] 含有GLP-I-Fc融合蛋白（G1-L5-FC和G3-L5-FC)的細胞培養液（GLP-I-Fc表達 量約lmg/ml) 2L，0. 22微米硝酸纖維素膜深層過濾，IOkD截留分子量PVDF膜平板錯流超 濾濃縮至200ml，GE公司rProteinA FF親和層析柱純化，50mM朽1檬酸緩衝液pH3. 3洗脫， 每收集IOml洗脫液添加 Iml IM Tris ρΗ8· 5中和。收集洗脫液通過GE公司Sephacryl S-200HR純化，得到最終樣品，產品質量分別為：Gl-Ll-IgG4200mg、Gl-L2-IgG4200mg、 Gl-L3-IgG4200mg、 Gl-L4-IgG4200mg、 Gl-L5-IgG4200mg、 Gl-L6-IgG4200mg、 G3-LY-IgG4200mg。進行N端測序以及分析檢測，N端測序結果表明Gl-L5-Fc和G3-L5-Fc 在CHO-Kl、CHO-S、CH0-DG44、CHO-DXBl 1中表達的融合蛋白的均讀框無誤。
[0132] 實施例5
[0133] GLP-I-Fc降解條帶和多聚體分析：
[0134] I. SDS-Page 電泳：
[0135] 製備15v/v%丙烯醯胺濃度的SDS-Page電泳膠，用5倍濃縮的樣品緩衝液稀釋 GLP-I-Fc樣品（5倍濃縮SDS樣品緩衝液成分為60mM Tris-HCl pH6. 8, 25%甘油，2% SDS， 14. 4mM 2-巰基乙醇，0. 1 %溴酚藍，水溶液；電泳樣品使用40微升的5倍濃縮樣品緩衝液 與10微升樣品充分混合），沸水中煮沸樣品5分鐘，冷卻後離心。取離心後上清上樣（上樣 10-30微升），控制恆壓150V約80分鐘結束電泳，結束電泳後考馬斯亮藍染色觀察。
[0136] 2.分子排阻法（SEC-HPLC)
[0137] 分子排阻使用東曹達公司的TSK3000-SW_XL(5微米，7. 8*300毫米）高壓液相分 析柱，分析流動相為PBS，pH7. 4, 10%乙腈緩衝液，樣品（樣品使用實施例4的製備方法，樣 品濃度控制在〇. 5mg/ml - lmg/ml，樣品溶解在20mM檸檬酸，150mM氯化鈉，pH6-7的水溶液 中）進樣流速〇· 5ml/分鐘，檢測波長214nm。
[0138] 3.反相HPLC法（RP-HPLC)(樣品使用實施例4的製備方法）
[0139] 反相HPLC利用Zorbax 300SB-C8 (4. 6*50毫米）分析柱分析，A相流動相為0· 1 % (v/v) TFA緩衝液（水溶液），B相流動相為100 %乙腈，0. 085 % (v/v) TFA緩衝液，運行以下 梯度在214nm檢測波長下檢測。流動相的梯度變化如表1所示。
[0140] 表 1
[0141]

【權利要求】
1. 一種GLP-1或其類似物與抗體Fc片段融合蛋白的製備方法，包括如下步驟： 1) 將GLP-1或其類似物與抗體Fc片段融合蛋白編碼序列克隆至表達載體中； 2) 將表達載體轉染CH0-DXB11細胞，培養並篩選出陽性細胞株； 3) 使用步驟2所得細胞表達、純化後，即得所述融合蛋白。
2. 如權利要求1所述的一種GLP-1或其類似物與抗體Fc片段融合蛋白的製備方法，其 特徵在於，所述GLP-1或其類似物與抗體Fc片段融合蛋白由重組人胰高血糖素樣肽-1或 其類似物通過連接肽與具有延長人體內半衰期作用的抗體Fc片段連接形成。
3. 如權利要求2所述的一種GLP-1或其類似物與抗體Fc片段融合蛋白的製備方法，其 特徵在於，所述GLP-1或其類似物的胺基酸序列與SEQ ID No. 14具有80%以上的同源性。
4. 如權利要求3所述的一種GLP-1或其類似物與抗體Fc片段融合蛋白的製備方法，其 特徵在於，所述GLP-1或其類似物的胺基酸序列與SEQ ID No. 14具有90%以上的同源性。
5. 如權利要求4所述的一種GLP-1或其類似物與抗體Fc片段融合蛋白的製備方法，其 特徵在於，所述GLP-1或其類似物的胺基酸序列與SEQ ID No. 14具有97%以上的同源性。
6. 如權利要求5所述的一種GLP-1或其類似物與抗體Fc片段融合蛋白的製備方法，其 特徵在於，所述GLP-1或其類似物的胺基酸序列如SEQ ID No. 14、SEQ ID No :1或SEQ ID No :2所示。
7. 如權利要求2所述的一種GLP-1或其類似物與抗體Fc片段融合蛋白的製備方法，其 特徵在於，所述連接肽的胺基酸數量為6-36個，所述連接肽由甘氨酸和絲氨酸組合而成， 以G4S為單位的多單位連接實現。
8. 如權利要求7所述的一種GLP-1或其類似物與抗體Fc片段融合蛋白的製備方法，其 特徵在於，所述連接肽的胺基酸數量為14-36。
9. 如權利要求7所述的一種GLP-1或其類似物與抗體Fc片段融合蛋白的製備方法，其 特徵在於，所述連接肽的胺基酸序列如SEQ ID No :3-8所示。
10. 如權利要求2所述的一種GLP-1或其類似物與抗體Fc片段融合蛋白的製備方法， 其特徵在於，所述抗體Fc片段為不具ADCC效應子功能的非裂解性Fc。
11. 如權利要求10所述的一種GLP-1或其類似物與抗體Fc片段融合蛋白的製備方法， 其特徵在於，所述抗體Fc片段的胺基酸序列如SEQ ID No :9所示。
12. 如權利要求2所述的一種GLP-1或其類似物與抗體Fc片段融合蛋白的製備方法， 其特徵在於，所述GLP-1或其類似物與抗體Fc片段融合蛋白的胺基酸序列如SEQ ID No : 10和SEQ ID No : 11所示；所述GLP-1或其類似物與抗體Fc片段融合蛋白編碼序列如SEQ ID No :12 和 SEQ ID No :13 所示。
13. 如權利要求1所述的一種GLP-1或其類似物與抗體Fc片段融合蛋白的製備方法， 其特徵在於，所述表達載體選自DHFR系統的表達載體或GS系統的表達載體。
14. 如權利要求1所述的一種GLP-1或其類似物與抗體Fc片段融合蛋白的製備方法， 其特徵在於，所述將GLP-1或其類似物與抗體Fc片段融合蛋白編碼序列克隆至表達載體中 的方法具體為：在GLP-1或其類似物與抗體Fc片段融合蛋白編碼序列的兩端設計與載體的 多克隆位點所對應的酶切位點，再將編碼序列與載體上所對應的酶切位點連接，實現目標 蛋白編碼DNA片段與表達載體的連接。
15. 如權利要求1所述的一種GLP-1或其類似物與抗體Fc片段融合蛋白的製備方法， 其特徵在於，所述將表達載體轉染CH0-DXB11細胞，培養並篩選出陽性細胞株的方法具體 為：使用DNA轉染試劑將質粒DNA轉染CH0-DXB11細胞，傳代培養後通過測定融合蛋白的表 達量，從而篩選出陽性細胞形成細胞株。
16. 如權利要求1所述的一種GLP-1或其類似物與抗體Fc片段融合蛋白的製備方法， 其特徵在於，所述細胞表達的方法具體為：將篩選出的陽性細胞株進行無血清馴化，然後接 種至搖瓶中搖床培養，將所得培養液離心取上清液進行蛋白純化。
17. 如權利要求1所述的一種GLP-1或其類似物與抗體Fc片段融合蛋白的製備方法， 其特徵在於，所述純化的具體為通過膜過濾、親和層析柱和凝膠過濾層析進行純化。 18. CH0-DXB11細胞株在GLP-1蛋白製備領域的用途。
19. 一種融合蛋白，由如權利要求1-17任一權利要求所述的GLP-1或其類似物與抗體 Fc片段融合蛋白的製備方法製備獲得。
20. -種藥物組合物，包括有效劑量的如權利要求19所述的融合蛋白，還包括載體、稀 釋劑、賦形劑、穩定劑、增稠劑中的一種或多種的組合。
【文檔編號】A61K47/48GK104293834SQ201410531801
【公開日】2015年1月21日 申請日期:2014年10月11日 優先權日:2014年10月11日
【發明者】許必雄, 郭頎然, 趙紅陽 申請人:上海興迪金生物技術有限公司